Name: Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Lernen Sie optimierte Mikroinjektionsmethoden für Xenopus-Oozyten zur Expression von Ionenkanälen. Diese Technik verbessert Überlebensraten und Zuverlässigkeit in elektrophysiologischen Experimenten.

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Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung 315230_156929/1 unterstützt. M.C.M. ist Empfänger eines Stipendiums (Beca Chile Postdoctorado von CONICYT, Ministerio de Educación, Chile).

Tierversuche wurden vom lokalen Komitee des Kantons Bern Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Bern (BE85 / 15) zugelassen. 1. Herstellung von Xenopus - Oozyten <ol><li> Pflegen Frösche (Xenopus laevis) auf einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel - Zyklus in Wasser , das streng bei 20 ° C gehalten wird. </li><li> Entfernen Sie die Lappen der Ovarien von weiblichen Frösche 9. HINWEIS: Die Entfernung der Lappen ist ein Anreiz für die Regeneration und häufig die Qualität der Oozyten verbessert sich mit der Operation. Die Eizelle wird durch eine Dotterschicht, eine Schicht von Follikelzellen und Bindegewebe enthalten , die Blutgefäße 21 abgedeckt. Die gesamte Struktur ist die &quot;Follikel&quot; bezeichnet. </li><li> Legen Sie die Lappen der Ovarien , die dicht gepackt sind mit den Follikeln die Eizellen in sterilen Barth Saline 7 (MBS) , ergänzt mit Penicillin und Streptomycin (88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mMNaHCO 3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2, 0,33 mM Ca (NO 3) 2, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 ug / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin). </li><li> Einzel-out Stufe V-VI 21 Follikel. Halten Sie die Ovar Lappen mit einer Pinzette. Senken Sie die Platin - Schleife (Abbildung 1) über die Follikel und sanft die Schleife zurückziehen das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören. HINWEIS: Stufe V-VI 21 Follikel durch ihre Größe gekennzeichnet sind (1,0 bis 1,2 mm Durchmesser) und durch den guten Kontrast zwischen dem dunklen pigmentierten Tier Hemisphäre und der gelblichen pflanzlichen Hemisphäre. </li><li> Übertragen Sie nur gesund aussehende Follikel (dh perfekt sphärisch und mit intakten Pigmentierung) zu einem Durchmesser von 35 mm Petrischale mit Hilfe einer Plastik Pasteur - Pipette (schneiden Sie die zurück zu einem Öffnungsdurchmesser von 1,5 mm). </li></ol> Anmerkung: Die hier beschriebenen Mikroinjektionssystem von der durch Kressmann und Birnstiel 22 berichtet abgeleitet ist. <ol><li> Bereiten cRNAs von den entsprechenden cDNAs kodierend für die Untereinheiten der α 4 β 2 δ GABA A Rezeptor durch in vitro Transkription, die Zugabe eines Poly (A +) -Schwanz und RNA Quantifizierung durch Gelelektrophorese 23. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren (1,0 mm Außendurchmesser (OD), 0,58 mm Innendurchmesser (ID), 100 mm Länge) mit einer Mikropipette Puller. Brechen Sie die Spitzen der Glaskapillaren unter einem Mikroskop mit einem Mikromanipulator und microfilament mit einem Spitzendurchmesser von 12 zu schaffen - 15 &amp; mgr; m mit einer abgeschrägten Spitze. </li><li> Verfüllen die Mikroinjektionspipette mit Paraffinöl mit einem 10-ml-Spritze und dann montieren Sie die Mikroinjektionspipette auf ein selbstgebautes microinjection Vorrichtung (Abbildung 2). HINWEIS: Die Selbstbau ölhydraulische Injektionsgerät besteht aus einem Grill Motor durch einen Fußschalter gesteuert. Ein zusätzlicher Schalter verändert den Drehbetrieb des Motors. Dieser Motor treibt eine Mikrometerschraube (0,5 mm / Umdrehung), die vor- oder zurückzieht, um den Kolben einer 10 &amp; mgr; l-Glasspritze. Die Injektion mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 Upm und eine 0,5 wiederum entspricht einer 50 nL Injektion in einen Follikel. Die Spitze der Spritze verbunden ist dickwandig Polytetrafluorethylen Schlauch, der sich an der Injektionsnadel durch ein sehr kurzes Stück Tygon-Schlauch verbunden ist. Die Injektions Kapillare wird durch ein Bohrfutter gehalten, die von einem Mikromanipulator gesteuert wird. Das gesamte System wird mit Paraffinöl gefüllt. Luftblasen sollten vermieden werden, da sie das Injektionssystem beeinträchtigt. Die Einrichtung ist mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet. Ein Stereomikroskop ist für die optische Kontrolle erforderlich. Follikeln unter kaltem Licht mit einer stereomicr sichtbar gemachtOscope (40-facher Vergrößerung). Leistung der Einspritzaufbau wird durch die Injektion von radioaktiven Tracers in Xenopus Oozyten getestet. Ein Volumen von 45 - 55 nL sollte pro Injektion geliefert werden. </li><li> Mit einer Pipette mit einem sterilen Kunststoffspitze, testen Sie die Konfiguration durch einen Tropfen steriles Wasser auf die saubere innerhalb eines feuchtigkeitsbeständigen thermoplastischen Platzierung (2 x 2 cm). Tauchen Sie die Spitze der Injektionspipette in diesem Tröpfchen, und dann den Motor drehen Sie den Kolben (Unterdruck im Inneren der Injektionspipette) zurückzuziehen. HINWEIS: Das Wasser sollte die Pipette eingeben und eine sichtbare Schnittstelle mit dem Öl bilden. </li><li> Ziehen Sie die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen und gelten Überdruck auf der Innenseite der Injektionspipette. Ein Wassertröpfchen sollte an der Spitze der Injektionspipette bilden. </li><li> Vorbereitung für das Einspritzen der Follikel, indem sie sich mit den pflanzlichen Pole nach oben zeigend in den Zwischenräumen ein Nylonnetz (G: 0,8 mm) geklebt Futter auf den Boden eines Petri Schale (60 mm) mit MBS abgedeckt. </li><li> Dispense 2 &amp; mgr; l der mRNA eine Pipette mit einer sterilen Plastikspitze auf die saubere innerhalb eines thermoplastischen verwenden. Nehmen Sie die mRNA nach oben in die Injektionspipette durch Unterdruck auf der Innenseite der Injektionspipette aufgebracht wird. </li><li> Positionieren Sie die Injektionspipette über einen einzelnen Follikel mit dem Mikromanipulator. </li><li> Legen Sie die Injektionsnadel in der Mitte des vegetativen Pol und injizieren 50 nL der mRNA bei einer Flussrate von 0,6 &amp; mgr; l / min durch Überdruck auf der Innenseite der Pipette angelegt wird. Warten von 5 bis 10 s vor der Injektion Pipettenspitze aus dem Follikel zu entfernen mRNA Flucht zu verhindern. HINWEIS: Die mRNA sollte in das pflanzliche (gelblich) Pol injiziert werden, die Injektion in den Nucleus zu vermeiden, die in der Tier Hemisphäre befindet. </li><li> Übertragen Sie die injizierten Follikel auf eine neue Petrischale (35 mm), gefüllt mit 2 ml MBS. Die Schale in einen Weinkühler auf 18 ° C eingestellt. Inkubieren der injizierten Follikel für 1 -7 d vor der Aufnahme in Abhängigkeit von der Identität des neu exprimierten Proteins. </li></ol> 3. Abisolieren der Follikel (Figur 3) HINWEIS: Wie oben erwähnt, ist die Eizelle von einem vitelline Schicht Follikelzellen bedeckt und Bindegewebe, die die Blutgefäße 24 enthält, ist bekannt als &quot;Follikel.&quot; Alle Schichten mit Ausnahme der Dotterschicht, die ohne verhindert den Zugang von Lösungen an die Zelloberfläche mechanische Stabilität bietet, muss vor elektrophysiologischen Experimenten entfernt werden. Der Follikel ohne die umgebenden Zellschichten hat zuvor eine &quot;entblößten&quot; Eizelle 25 bezeichnet worden. Dieser Schritt wird in der Regel am selben Tag wie die elektrophysiologischen Experimenten durchgeführt. <ol><li> Transfer zehn injiziert Follikel mit einem Rohr Borosilicatglas 0,5 ml MBS, 1 mg / ml Kollagenase und 0,1 mg / ml Trypsin-Inhibitor enthält. Eintauchen des Rohres in ein Wasserbad bei 36 ° C gehalten. inkubieren derFollikel für 20 Minuten und schütteln gelegentlich die Rohre. </li><li> Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre. </li><li> Übertragung der Follikel mit einem dritten Rohr mit 0,5 ml doppelt konzentrierter MBS , enthaltend 4 mM Ethylenglycol-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;- tetraessigsäure (EGTA), und inkubiere sie für 4 min bei RT. Das Röhrchen wird gelegentlich. HINWEIS: Die hypertonischen Lösung (doppelt konzentriert MBS) wird verwendet, innerhalb Follikel Zellschichten Schrumpfung der Eizellen zu induzieren, wodurch follikulären Zellschichten von der Eizelle löst; EGTA zugegeben Kollagenase-Aktivität zu hemmen. </li><li> Spülen Sie die Follikel, indem sie in ein zweites Röhrchen, das 1 ml MBS bei RT übertragen. Lassen Sie sie für etwa 10 s in die Röhre. </li><li> Übertragen Sie die Eizellen in eine Petrischale (35 mm Durchmesser), die 2 ml MBS. Unter einem Stereomikroskop, trennen Sie die äußeren Hüllen aus den Follikeln voneinfaches Drücken die nackte Eizelle entfernt die Platin-Schleife. HINWEIS: Die äußeren Einhüllenden der Oozyten fest an der Kulturschale haften und leicht aus den Oozyten getrennt werden können. Einige Eizellen spontan ihre äußeren Hüllen verlieren und als entblößte Eizellen gewonnen werden. Dieses Verfahren führt zu einer relativ stabilen Präparation, die die kugelförmige Erscheinung der Oozyten hält. </li></ol> 4. Schnelle Lösung Ändern Sie rund um die Oozyten <ol><li> Führen Sie eine Spannungsklemm Experiment, wie 9,26 beschrieben. </li><li> Ändern, um die Lösung der Schwerkraft gespeisten Perfusionssystem durch die Perfusion Schalter drehen, wie durch den Versuch benötigt. <ol><li> Gelten die Perfusionslösung bei 6 ml / min durch eine Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von 1,35 mm, die Mündung davon platziert ist etwa 0,4 mm von der Oberfläche der Oozyte, schnelle Veränderungen der Agonistenkonzentration zu erlauben um die Eizelle. HINWEIS: Die Änderungsrate war vorher Schätzungd als 70% in weniger als 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Methoden , die in diesem Artikel beschriebenen abweichen von denen traditionell 7-9 verwendet. Es ist Standard , um die Lappen der Ovarien auf eine 1 bis 2 h Kollagenasebehandlung 8 zu exponieren; isolieren unbeschädigte, entblößte Eizellen; und injizieren sie mit mRNA kommerzielle Injektionsgeräte verwenden. Dieses klassische Verfahren hat die folgenden Nachteile: 1) Die Oozyten werden wahrscheinlich durch die lange Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von Kollagenase beschädigt werden. ...

Xenopus Oozyten werden als Expressionssystem (- 3 und den darin References 2) weit verbreitet. Sie sind in der Lage, richtig montieren und funktionell aktiven Multiunter Proteine ​​in ihre Plasmamembranen integrieren. Mit diesem System ist es möglich, Membranproteine ​​allein oder in Kombination mit anderen Proteinen funktionell zu untersuchen, um die Eigenschaften von mutierten, chimäre oder verketteten Proteine ​​zu studieren, und potentielle Arzneimittel zu screenen. Vorteile von Oozyten über andere heterologe Expressionssysteme umfassen die einfache Handhabung der Riesenzellen, die hohen Anteil an Zellen, die fremde genetische Information, die einfache Steuerung der Umgebung der Oocyte durch Bad-Perfusion, und die Kontrolle des Membranpotentials mit Hilfe . Der Nachteil dieses Expressionssystem ist die saisonalen Schwankungen in vielen Laboratorien , 17-20. Der Grund für diese Variationbei weitem nicht klar ist. Zusätzlich wird die Qualität der Oozyten oft stark zu variieren beobachtet. Traditionelle Methoden 7-9 haben die Isolierung von Ovar Keulen, die Exposition von Ovar Keulen zu Kollagenase für einige Stunden, um die Auswahl von entblößte Eizellen und die Eizelle Mikroinjektions enthalten. Hier wird eine Reihe von alternativen, schnellen Verfahren berichtet, dass erlaubt haben, uns mit diesem Expressionssystem arbeiten, um für mehr als 30 Jahren ohne saisonale Schwankungen und eine geringe Variation in Oozytenqualität. Die modifizierten und verbesserten Methoden , die hier für die Isolierung von Oozyten beschrieben, die Mikroinjektion mit cRNA und Entfernung von follikulären Zellschichten können für die Expression von jedem Protein der Wahl in der Xenopus Oozyten verwendet werden. Die sehr einfache Methode für die schnelle Lösung Änderungen des Mediums, um die Eizelle kann auf die Untersuchung von jeder ligandengesteuerten Ionenkanal und von Trägern aufgetragen werden.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; g Penicillin/ml und 100 μ; g Streptomycin/mL</td></tr><tr><td>Platindrahtschlaufe</td><td>hausgemacht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Spritze&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, Typ 701N</td></tr><tr><td>Dickwandiger Schlauch aus Polytetrafluorethylen</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1,0 mm Außendurchmesser</td></tr>;<tr><td>Paraffinöl</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Nylonnetz, G: 0,8 mm&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilikatglasröhre&nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Kollagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor Typ I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillare</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1,35 ID mm (für Perfusion), alternative Firma: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilikatglas Kapillare</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1,0 OD x&nbsp; 0,58 ID x 100 Länge mm (für Mikroinjektion)&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillare aus Borosilikatglas&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Länge mm (für Zwei-Elektroden-Spannungsklemme)</td></tr><tr><td>&gamma;-Aminobuttersäure (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihydroxy-5&alpha;-pregnan-20-on (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>Grillmotor</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>Gleichstrom-Kleinstmotor Typ 2230 mit Getriebe Typ 22/2</td></tr><tr><td>Mikrometerschraube</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Sterile Kunststoff-Transferpipetten</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oozyten: optimierte methoden für die mikroinjektion, entfernen von follicular zellschichten und schnelle lösung Änderungen in elektrophysiologischen experimenten

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Die Xenopus Oozyten als heterologe Expressionssystem für Proteine, wurde zuerst von Gurdon et al. 1 und wurde seit seiner Entdeckung weit verbreitet (Referenzen 2 - 3 und Referenzen darin). Ein Merkmal, das die Eizelle attraktiv für ausländische -Kanalexpression macht , ist die schlechte Fülle von endogenen Ionenkanäle 4. Dieses Expressionssystem hat sich als nützlich für die Charakterisierung vieler Proteine ​​erwiesen, darunter Liganden-gesteuerte Ionenkanäle. Die Expression von GABA - A - Rezeptoren in Xenopus - Oozyten und ihre funktionelle Charakterisierung wird hier beschrieben, einschließlich der Isolierung von Oozyten, Mikroinjektionen mit cRNA, die Entfernung von follikulären Zellschichten und eine schnelle Lösung Veränderungen in elektrophysiologischen Experimenten. Die Verfahren wurden in diesem Labor 5,6 optimiert und weichen von den routinemäßig verwendeten 7-9 diejenigen. Traditionell werden entblößte Eizellen vorbereitetmit einer verlängerten Kollagenase Behandlung von Ovar Keulen bei RT und diese entblößte Oozyten werden mit mRNA mikroinjiziert. Verwendung der optimierten Methoden, diverse Membranproteine wurden mit diesem System exprimiert und untersucht, wie rekombinante GABA A -Rezeptoren 10-12, humanem rekombinantem Chloridkanäle 13, Trypanosom Kaliumkanäle 14 und eine myo - Inositol - Transporter 15, 16. Die Methoden , die hier beschrieben werden , können zur Expression jedes Proteins der Wahl in Xenopus Oozyten angewendet werden, und die schnelle Lösung Änderung verwendet werden kann andere Liganden-gesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen.

Xenopus - Oozyten wurden mit einer Platinöse mechanisch herausgehoben (Figur 1). 0,5: 2,5 fmol / Oocyte (Abbildung 2) Die Oozyten wurden mit mRNA kodierend für den GABA A -Rezeptor - Untereinheiten &amp; agr; 4 &amp; bgr; 2, δ, 0,5 mikroinjiziert. Nach 4 d wurden follicular Zellschichten entfernt werden (Abbildung 3). Oocyten wurden Spannung bei -80 mV eingespannt und ausgesetzt steigenden Konzen...

Optimierte Verfahren für die Isolierung einzelner Follikel, zytoplasmatische RNA-Mikroinjektionen, die Entfernung umgebender Zellschichten und die Proteinexpression in Xenopus-Eizellen werden beschrieben. Darüber hinaus wird eine einfache Methode für schnelle Lösungsänderungen in elektrophysiologischen Experimenten mit ligandengesteuerten Ionenkanälen vorgestellt.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue Proteine, wie z. B. Ionenkanäle in Xenopus-Oozyten, zu exprimieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in jedem Bereich zu beantworten, der ein funktionales Ausdruckssystem erfordert. Die Hauptvorteile der Variationen dieser Technik sind die Geschwindigkeit, Zuverlässigkeit und das verbesserte Überleben der Eizellen.Diese Methode kann Aufschluss über die Funktionsweise von Ionenkanälen geben. Darüber hinaus kann es auf die Untersuchung jedes anderen Proteins angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir feststellten, dass klassische Methoden zu einer geringen Überlebensrate der Eizellen führten.Nachdem Sie die Eierstocklappen von weiblichen Fröschen gemäß dem Textprotokoll entfernt haben, legen Sie die Lappen in sterile modifizierte Barth-Lösung, die mit Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Schneiden Sie die Lappen auf, um den Zugang des Gewebes zu Sauerstoff zu ermöglichen. Um Follikel im fünften bis sechsten Stadium herauszufiltern, verwenden Sie eine Pinzette, um den Eierstock zu halten, und senken Sie dann eine Platinschlinge über die Follikel und ziehen Sie die Schlinge vorsichtig zurück, um das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören.Sortieren Sie gesund aussehende Eizellen mit der Platinschlaufe aus. Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Kunststoff, deren Spitze auf einen Durchmesser von 1,5 Millimetern zugeschnitten ist, um ausgewählte Follikel in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern zu übertragen. Nach der Vorbereitung von cRNAs für den GABA-A-Rezeptor und Mikroinjektionspipetten gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie Paraffinöl und eine 10-Milliliter-Spritze mit einer dünnen Nadel, um eine Mikroinjektionspipette zu füllen.Montieren Sie dann die Pipette auf ein selbstgebautes Mikroinjektionsgerät. Geben Sie mit einer Pipette mit einer sterilen Kunststoffspitze einen Tropfen mRNA-Lösung auf die saubere Seite eines feuchtigkeitsbeständigen Thermoplasts. Tauchen Sie dann die Spitze der Injektionspipette in das Tröpfchen und schalten Sie den Motor ein, um den Kolben zurückzuziehen.Die mRNA-Lösung sollte in die Pipette gelangen und eine sichtbare Grenzfläche mit dem Öl bilden. Ziehen Sie dann die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen zurück und üben Sie einen positiven Druck auf die Innenseite der Injektionspipette aus. An der Spitze der Injektionspipette sollte sich ein Tröpfchen mRNA-Lösung bilden.Richten Sie die Follikel mit einer 60-Millimeter-Petrischale aus, auf deren Unterseite ein Nylonnetz geklebt und für die Injektion mit MBS bedeckt ist. Positionieren Sie die Injektionspipette mit dem Mikromanipulator über einem einzelnen Follikel. Führen Sie die Injektionsnadel in die Mitte des Pflanzenpols ein und üben Sie einen positiven Druck auf die Innenseite der Pipette aus, um 50 Nanoliter mRNA mit einer Flussrate von 0,6 Mikrolitern pro Minute zu injizieren.Warten Sie fünf bis 10 Sekunden, bevor Sie die Injektionspipettenspitze aus dem Follikel entfernen, um ein Entweichen von Boten-RNA zu vermeiden. Übertragen Sie die injizierten Follikel in eine neue Petrischale, die mit zwei Millilitern MBS gefüllt ist. Stellen Sie das Gericht in einen Weinkühlschrank, der auf 18 Grad Celsius eingestellt ist.Inkubieren Sie die injizierten Follikel vor der Aufzeichnung ein bis sieben Tage lang, abhängig von der Identität des neu exprimierten Proteins. Um Follikel zu entfernen, übertragen Sie zehn injizierte Follikel in ein Borosilikatglasröhrchen, das 0,5 Milliliter MBS, ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase und 0,1 Milligramm pro Milliliter Trypsininhibitor enthält. Tauchen Sie das Röhrchen in ein 36 Grad heißes Wasserbad und inkubieren Sie die Follikel 20 Minuten lang.Hier ist die Temperatur kritisch, denn ein Grad mehr kann die Eizellen abtöten. Spülen Sie die Follikel, indem Sie sie in ein zweites Röhrchen mit einem Milliliter MBS bei Raumtemperatur überführen, und lassen Sie sie etwa zehn Sekunden lang in der Röhrchen. Dann werden die Follikel in ein drittes Röhrchen mit 0,5 Millilitern doppelt konzentriertem MBS mit vier Millimolaren EGTA überführt und die Proben vier Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Röhrchen gelegentlich geschüttelt werden.Die Inkubationszeit von vier Minuten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich die Follikelschichten von der Eizelle lösen. Spülen Sie die Follikel, indem Sie sie in ein anderes Röhrchen mit einem Milliliter MBS bei Raumtemperatur überführen, und lassen Sie sie etwa 10 Sekunden lang im Röhrchen. Übertragen Sie die Eizellen in eine 35-Millimeter-Petrischale, die zwei Milliliter MBS enthält.Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop eine Platinschlaufe, um die äußeren Hüllen von den Follikeln zu trennen, indem Sie die nackte Eizelle einfach wegschieben. Bewahren Sie die entblößten Eizellen bis zur Verwendung auf. In diesem Experiment wurden mechanisch ausgewählte Xenopus-Eizellen mit einer mRNA-Beschichtung für GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten mikroinjiziert.Dann wurden follikuläre Zellschichten entfernt. Die Eizellen wurden bei minus 80 Millivolt unter Spannung geklemmt und steigenden Konzentrationen von GABA und dem Vorhandensein von THDOC, einem starken positiven allosterischen Modulator des GABA-A-Rezeptors, ausgesetzt. Dieses Panel zeigt die induzierten Stromamplituden in Abhängigkeit von den GABA-Konzentrationen, was auf die Empfindlichkeit dieser Untereinheitenkombination gegenüber GABA hinweist.Die verwendete Gleichung lautete I(c)Imax/n), wobei c die Konzentration von GABA ist, während EC50 die Konzentration von GABA in Gegenwart eines mikromolaren THDOC ist, was eine halbmaximale Stromamplitude hervorruft. Imax ist die maximale Stromamplitude. I ist die Stromamplitude und n ist der Hill-Koeffizient.Der EC50-Wert des Alpha-Vier-Beta-2-Delta-GABA-A-Rezeptors betrug 0,41 0,12 Mikromolar und n 0,76 0,04 Nach der Beherrschung können follikuläre Zellschichten in einer halben Stunde entfernt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, das Proteinexpressionsverfahren in Xenopus-Eizellen zu verbessern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Xenopus-Eizellen isoliert, die von follikulären Zellschichten umgeben sind, ihre Mikroinjektion mit mRNA und die anschließende Entfernung von follikulären Zellschichten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mikroinjektion von Xenopus laevis Oozyten

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oozyten

Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Ionenstrom von BK-Kanälen aufgezeichnet wird mit Patch-Clamp-Techniken. BK-Kanäle sind in...

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

Wir beschreiben Methoden zur Manipulation unreifer Eizellen von Xenopus laevis, zur In-vitro-Reifung von Eizellen zu Eizellen und zur intrazytoplasmatischen Spermieninjektion. Dieses Protokoll ermöglicht den Abbau einiger mütterlicher Proteine und die Überexpression von Genen von Interesse während der Befruchtung und ist daher wertvoll, um die Rolle spezifischer Faktoren in der frühen Embryonalentwicklung zu untersuchen.

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Die Kontrolle der Proteinsynthese erfolgt hauptsächlich im Initiationsschritt der Translation, dessen Mängel mit verschiedenen Störungen verbunden sind. Um ihre Ätiologie besser zu verstehen, haben wir hier ein Protokoll mit Xenopus laevis Eizellen beschrieben, das die Translation des mos-Transkripts in Gegenwart einer Mutante des Translationsinitiationsfaktors eIF4G1 bewertet.

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Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen

Lernen Sie optimierte Mikroinjektionsmethoden für Xenopus-Oozyten zur Expression von Ionenkanälen. Diese Technik verbessert Überlebensraten und Zuverlässigkeit in elektrophysiologischen Experimenten.

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten (Video) | JoVE Journal

Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

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