Xenopus Oozyten: Optimierte Methoden für die Mikroinjektion, Entfernen von Follicular Zellschichten und schnelle Lösung Änderungen in elektrophysiologischen Experimenten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue Proteine, wie z. B. Ionenkanäle in Xenopus-Oozyten, zu exprimieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in jedem Bereich zu beantworten, der ein funktionales Ausdruckssystem erfordert. Die Hauptvorteile der Variationen dieser Technik sind die Geschwindigkeit, Zuverlässigkeit und das verbesserte Überleben der Eizellen.

Diese Methode kann Aufschluss über die Funktionsweise von Ionenkanälen geben. Darüber hinaus kann es auf die Untersuchung jedes anderen Proteins angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir feststellten, dass klassische Methoden zu einer geringen Überlebensrate der Eizellen führten.

Nachdem Sie die Eierstocklappen von weiblichen Fröschen gemäß dem Textprotokoll entfernt haben, legen Sie die Lappen in sterile modifizierte Barth-Lösung, die mit Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Schneiden Sie die Lappen auf, um den Zugang des Gewebes zu Sauerstoff zu ermöglichen. Um Follikel im fünften bis sechsten Stadium herauszufiltern, verwenden Sie eine Pinzette, um den Eierstock zu halten, und senken Sie dann eine Platinschlinge über die Follikel und ziehen Sie die Schlinge vorsichtig zurück, um das Bindegewebe mit dem Follikel aus dem Eierstockgewebe zu zerstören.

Sortieren Sie gesund aussehende Eizellen mit der Platinschlaufe aus. Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Kunststoff, deren Spitze auf einen Durchmesser von 1,5 Millimetern zugeschnitten ist, um ausgewählte Follikel in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern zu übertragen. Nach der Vorbereitung von cRNAs für den GABA-A-Rezeptor und Mikroinjektionspipetten gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie Paraffinöl und eine 10-Milliliter-Spritze mit einer dünnen Nadel, um eine Mikroinjektionspipette zu füllen.

Montieren Sie dann die Pipette auf ein selbstgebautes Mikroinjektionsgerät. Geben Sie mit einer Pipette mit einer sterilen Kunststoffspitze einen Tropfen mRNA-Lösung auf die saubere Seite eines feuchtigkeitsbeständigen Thermoplasts. Tauchen Sie dann die Spitze der Injektionspipette in das Tröpfchen und schalten Sie den Motor ein, um den Kolben zurückzuziehen.

Die mRNA-Lösung sollte in die Pipette gelangen und eine sichtbare Grenzfläche mit dem Öl bilden. Ziehen Sie dann die Spitze der Pipette aus dem Tröpfchen zurück und üben Sie einen positiven Druck auf die Innenseite der Injektionspipette aus. An der Spitze der Injektionspipette sollte sich ein Tröpfchen mRNA-Lösung bilden.

Richten Sie die Follikel mit einer 60-Millimeter-Petrischale aus, auf deren Unterseite ein Nylonnetz geklebt und für die Injektion mit MBS bedeckt ist. Positionieren Sie die Injektionspipette mit dem Mikromanipulator über einem einzelnen Follikel. Führen Sie die Injektionsnadel in die Mitte des Pflanzenpols ein und üben Sie einen positiven Druck auf die Innenseite der Pipette aus, um 50 Nanoliter mRNA mit einer Flussrate von 0,6 Mikrolitern pro Minute zu injizieren.

Warten Sie fünf bis 10 Sekunden, bevor Sie die Injektionspipettenspitze aus dem Follikel entfernen, um ein Entweichen von Boten-RNA zu vermeiden. Übertragen Sie die injizierten Follikel in eine neue Petrischale, die mit zwei Millilitern MBS gefüllt ist. Stellen Sie das Gericht in einen Weinkühlschrank, der auf 18 Grad Celsius eingestellt ist.

Inkubieren Sie die injizierten Follikel vor der Aufzeichnung ein bis sieben Tage lang, abhängig von der Identität des neu exprimierten Proteins. Um Follikel zu entfernen, übertragen Sie zehn injizierte Follikel in ein Borosilikatglasröhrchen, das 0,5 Milliliter MBS, ein Milligramm pro Milliliter Kollagenase und 0,1 Milligramm pro Milliliter Trypsininhibitor enthält. Tauchen Sie das Röhrchen in ein 36 Grad heißes Wasserbad und inkubieren Sie die Follikel 20 Minuten lang.

Hier ist die Temperatur kritisch, denn ein Grad mehr kann die Eizellen abtöten. Spülen Sie die Follikel, indem Sie sie in ein zweites Röhrchen mit einem Milliliter MBS bei Raumtemperatur überführen, und lassen Sie sie etwa zehn Sekunden lang in der Röhrchen. Dann werden die Follikel in ein drittes Röhrchen mit 0,5 Millilitern doppelt konzentriertem MBS mit vier Millimolaren EGTA überführt und die Proben vier Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Röhrchen gelegentlich geschüttelt werden.

Die Inkubationszeit von vier Minuten ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich die Follikelschichten von der Eizelle lösen. Spülen Sie die Follikel, indem Sie sie in ein anderes Röhrchen mit einem Milliliter MBS bei Raumtemperatur überführen, und lassen Sie sie etwa 10 Sekunden lang im Röhrchen. Übertragen Sie die Eizellen in eine 35-Millimeter-Petrischale, die zwei Milliliter MBS enthält.

Verwenden Sie dann unter einem Stereomikroskop eine Platinschlaufe, um die äußeren Hüllen von den Follikeln zu trennen, indem Sie die nackte Eizelle einfach wegschieben. Bewahren Sie die entblößten Eizellen bis zur Verwendung auf. In diesem Experiment wurden mechanisch ausgewählte Xenopus-Eizellen mit einer mRNA-Beschichtung für GABA-A-Rezeptor-Untereinheiten mikroinjiziert.

Dann wurden follikuläre Zellschichten entfernt. Die Eizellen wurden bei minus 80 Millivolt unter Spannung geklemmt und steigenden Konzentrationen von GABA und dem Vorhandensein von THDOC, einem starken positiven allosterischen Modulator des GABA-A-Rezeptors, ausgesetzt. Dieses Panel zeigt die induzierten Stromamplituden in Abhängigkeit von den GABA-Konzentrationen, was auf die Empfindlichkeit dieser Untereinheitenkombination gegenüber GABA hinweist.

Die verwendete Gleichung lautete I(c)Imax/n), wobei c die Konzentration von GABA ist, während EC50 die Konzentration von GABA in Gegenwart eines mikromolaren THDOC ist, was eine halbmaximale Stromamplitude hervorruft. Imax ist die maximale Stromamplitude. I ist die Stromamplitude und n ist der Hill-Koeffizient.

Der EC50-Wert des Alpha-Vier-Beta-2-Delta-GABA-A-Rezeptors betrug 0,41 0,12 Mikromolar und n 0,76 0,04 Nach der Beherrschung können follikuläre Zellschichten in einer halben Stunde entfernt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, das Proteinexpressionsverfahren in Xenopus-Eizellen zu verbessern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Xenopus-Eizellen isoliert, die von follikulären Zellschichten umgeben sind, ihre Mikroinjektion mit mRNA und die anschließende Entfernung von follikulären Zellschichten.