Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue Kandidatengene für Hirnfehlbildungsstörungen zu identifizieren und ihre ursächliche Rolle in vivo direkt zu bestätigen. Diese Strategie kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurobiologie zu beantworten, indem molekulare Signalwege entdeckt werden, die mit der Gehirnentwicklung und korrelierten Pathologien verbunden sind. Der Hauptvorteil dieser Strategie besteht darin, dass sie dazu beitragen wird, neue Gene zu entdecken, die mit Hirnerkrankungen in Verbindung gebracht werden, und neue diagnostische Instrumente zu entwickeln.

Mit diesem Ansatz konnten wir den entscheidenden Beitrag des C6orf70-Gens zur Pathogenese der periventrikulären nodulären Heterotopie, einer Hirnfehlbildung, die durch abnormale neuronale Migration verursacht wird, aufdecken. Das Verfahren wird von Fabienne Schaller, Ingenieurin aus unserem Labor, vorgeführt. Bereiten Sie eine E15-trächtige Ratte auf das Verfahren vor, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben und gemäß den institutionellen und nationalen Richtlinien.

Stellen Sie sicher, dass das Tier richtig betäubt ist, dass eine Augensalbe auf die Augen aufgetragen wird und dass der Bauch richtig rasiert und desinfiziert ist. Nachdem Sie mit einer scharfen Schere einen zwei Zentimeter langen vertikalen Schnitt in die Haut und den Muskel der kaudalen Bauchmittellinie gemacht haben, legen Sie vorsichtig ein Uterushorn aus der Bauchhöhle frei. Tragen Sie eine auf 37 Grad Celsius vorgewärmte normale Kochsalzlösung tropfenweise auf, um die Embryonen mit Feuchtigkeit zu versorgen.

Halten Sie die Gebärmutter während des gesamten Eingriffs feucht. Um DNA zu injizieren, halten Sie einen Embryo vorsichtig in einer Hand, wobei der Kopf leicht zugänglich ist. Führen Sie dann mit der anderen Hand vorsichtig eine Glaskapillare, die mit einem Mikroinjektor verbunden ist, in den linken Seitenventrikel ein, der sich einen Millimeter von der Mittellinie entfernt und in einer Tiefe von zwei bis drei Millimetern befindet.

Verwenden Sie den Mikroinjektor, um etwa einen Mikroliter DNA mit schnellem Grün zu injizieren, um eine visuelle Überwachung der Injektion zu ermöglichen. Um die DNA in die Zellen zu elektropopolieren, tropfen Sie zunächst normale Kochsalzlösung auf die Oberfläche der drei mal sieben Millimeter großen Elektrode. Platzieren Sie dann die positive Elektrode auf der injizierten Seite und die negative Elektrode auf dem nicht injizierten rechten Ventrikel.

Verwenden Sie das fußgesteuerte Pedal, um fünf elektrische Impulse in Intervallen von 950 Millisekunden abzugeben. Nach der Elektroporation wird das Gebärmutterhorn wieder in die Bauchhöhle zurückgeführt und sterile Kochsalzlösung hinzugefügt, damit sich die Embryonen natürlicher positionieren können und um den intraoperativen Flüssigkeitsverlust auszugleichen. Verschließen Sie die Muskelwand mit resorbierbaren chirurgischen Nähten, dann die Haut mit einem einfachen unterbrochenen Stich.

Führen Sie eine postoperative Analgesie für bis zu 48 Stunden oder wie in den institutionellen Richtlinien angegeben durch. Bringen Sie die Ratte in ihren sauberen Käfig zurück und überwachen Sie sie, bis sie aus der Narkose kommt. Nachdem Sie das Gehirn in 4%igem Paraformaldehyd fixiert haben, wie im schriftlichen Teil des Protokolls beschrieben, waschen Sie es 10 Minuten lang in PBS.

Bereiten Sie während des Waschens 50 Milliliter 4%Agar in PBS vor und achten Sie darauf, dass die Temperatur der gelösten Agarose 50 Grad Celsius nicht überschreitet. Gießen Sie die Agarose in plastische Einbettformen und legen Sie dann das Gehirn in die Agarose. Platzieren Sie das eingebettete Gehirn bei vier Grad Celsius und lassen Sie die Agarose mindestens eine Stunde lang polymerisieren.

Nachdem die Agarose polymerisiert wurde, trimmen Sie überschüssige Agarose aus dem Bereich des Gehirns, kleben Sie das Gehirn mit dem vorderen hinteren Zugang des Gehirns senkrecht zur Klinge auf die Vibratom-Grundplatte. Nachdem Sie einige Minuten gewartet haben, bis der Kleber getrocknet ist, legen Sie die Platte mit dem verklebten Gehirn in die Vibratomkammer. Füllen Sie das Vibratom mit PBS und beginnen Sie mit dem Schneiden von 100 Mikron dicken Abschnitten.

Übertragen Sie die Schnitte nach dem Schneiden auf Objektträger und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit. Geben Sie dann ein paar Tropfen Montagemedium hinzu und legen Sie ein Deckglas auf die Abschnitte. Über Nacht trocknen lassen.

Bilden Sie die Schnitte mit 10-facher Vergrößerung an einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop ab. Um die Bilder zu analysieren, konvertieren Sie das Bild zunächst in 8-Bit mit einer entsprechenden Software für die quantitative Bildanalyse. Wählen Sie dann eine repräsentative GFP-positive fluoreszierende Zelle aus und definieren Sie ihre Form manuell, indem Sie auf Schätzen klicken und mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug den Rand der Zelle zeichnen.

Die Software behält automatisch den Durchmesser- und Intensitätsschwellenwert der Zelle bei. Klicken Sie auf Zellen suchen, damit die Software transfizierte Zellen im gesamten Kortex lokalisieren kann. Entfernen Sie dann bei Bedarf manuell Fehlalarme.

Teilen Sie die gesamte Dicke der Rinde in acht interessante Bereiche auf, die in einzelnen Abschnitten normalisiert sind, indem Sie auf das Regionswerkzeug klicken und acht Regionsstreifen auswählen, wobei die Streifen eins und acht der ventrikulären Zone bzw. der Oberseite der kortikalen Platte entsprechen. Klicken Sie anschließend auf Übernehmen, damit die Software die relative Position der GFP-transfizierten Zellen im gesamten Kortex zählen kann. Klicken Sie abschließend auf Quantifizierung speichern, um die Daten zur Analyse in eine Excel-Datei zu exportieren.

Array-CGH und Whole-Exom-Sequenzierung identifizierten C6orf70 als Kandidatengen für Entwicklungsgenanomalien. Die quantitative PCR ergab, dass dieses Gen zusammen mit PHF10 und DLL1 in der Großhirnrinde von Ratten exprimiert wird. Die folgenden Bilder zeigen repräsentative neokortikale koronale Schnitte von E20-Rattengehirnen 5 Tage nach der Elektroporation entweder mit einem grün fluoreszierenden Proteinkonstrukt allein oder in Kombination mit shRNA, die auf die C6orf70-kodierende Sequenz abzielt, oder mit dem relativ ineffektiven Mismatch-Konstrukt.

Filament A Knock Down wurde zur Kontrolle der gestörten neuronalen Migration verwendet. Die In-utero-Elektroporation mit shRNA, die auf das C6orf70 oder Filament A abzielt, induzierte einen Stillstand von GFP-positiven Zellen innerhalb der ventrikulären Zone, wie durch die weißen Pfeile angezeigt, während die Zellen, die GFP allein oder in Kombination mit dem Mismatch-Konstrukt exprimierten, die neuronale Migration nicht veränderten. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich vor Augen zu halten, welchen Zustand der kortikalen Genese Sie analysieren möchten, entweder die neuronale Proliferation, die Migration oder die Reifung.

Vergessen Sie nicht, dass das Erlernen der Durchführung der In-utero-Elektroporation im embryonalen Gehirn von Nagetieren eine lange Trainingszeit, Fähigkeiten und regelmäßiges Üben erfordert.