Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen In Vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ausgerichtete und zufällige 3D-Kollagenmatrizen zu erzeugen, um die Zellmigration oder andere zelluläre Prozesse im Kontext einer 3D-Umgebung zu beobachten. Diese Methode wurde entwickelt, um Kollagenmerkmale zu erfassen, die wir in echtem Gewebe finden, was dazu beitragen kann, die Schlüsselfragen zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen, die Zellen verwenden, um eine ausgerichtete oder zufällige extrazelluläre Matrix zu erkennen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Organisation der 3D-Umgebung und der darin enthaltenen Bildzellen manipulieren können, und zwar kostengünstig mit Geräten, die allgemein verfügbar sind.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil sie die Kollagenlösung und den Neutralisationspuffer nicht gut genug mischen und das Kollagen ungleichmäßig durch die Kanäle ziehen. Brian Burkel, ein leitender Wissenschaftler in meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Mischen Sie zunächst das Kollagen und den HEPES-Puffer gründlich, bevor Sie Zellen und Medien hinzufügen, um eine ordnungsgemäße Neutralisierung des Kollagens zu gewährleisten.

Fügen Sie dann die Zellen und Medien zu der neutralisierten Kollagenmischung hinzu und legen Sie sie auf Eis, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Pipettieren Sie die eiskalte Mischung in eine sterile, nicht mit Gewebekultur behandelte Oberfläche, um die Anhaftung und das Wachstum von Zellen außerhalb des Kollagengels zu minimieren. Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösung gleichmäßig zu verteilen.

Lassen Sie das Gel etwa 10 bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur polymerisieren. Decken Sie dann die Gele ab und bringen Sie sie für weitere 45 bis 60 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um die Polymerisation abzuschließen. Bei der Polymerisation wird das Gel undurchsichtig.

Nach der Polymerisation fügen Sie zwei bis drei Milliliter Medium hinzu. Lösen Sie dann die Gele von den Seiten der Vertiefung, indem Sie eine 200-Pipette um den Umfang der Vertiefung führen. Schwenken Sie die Schale vorsichtig, um das Gel von der Unterseite zu lösen.

Um PDMS-Mikrokanäle zum Ausrichten von Kollagenmatrizen zu erstellen. Bereiten Sie zunächst einen SuA-Silizium-Master unter Verwendung von Standard-Softlithographie-Techniken her, die an anderer Stelle beschrieben werden. Mischen Sie anschließend mit einem Bastelstäbchen 20 Gramm Elastomerbasis mit 2 Gramm Härter in einem Einwegbecher gründlich.

Sobald es gut vermischt ist, entgasen Sie das PDMS-Gemisch, indem Sie den Einwegbecher in eine Vakuumkammer unter einem Vakuumdruck von 550 Millimetern Quecksilber stellen. Entgasen Sie das Gemisch für etwa eine bis eineinhalb Stunden. Bereiten Sie beim Entgasen des PDMS den Silizium-Master vor, indem Sie ein sauberes Blatt Durchlichtfolie auf eine Heizplatte legen, gefolgt vom Silizium-Master.

Stellen Sie sicher, dass die Mikrokanalform nach oben zeigt. Nach ein bis eineinhalb Stunden nehmen Sie das entgaste PDMS aus der Vakuumkammer. Gießen Sie das PDMS langsam in die Mitte des Masters und lassen Sie es durch die Schwerkraft gleichmäßig verteilen.

Rollen Sie anschließend vorsichtig ein zweites Blatt Durchlichtfolie auf den Silikonmaster und das PDMS, um Luftblasen zu vermeiden. Lege vorsichtig eine Gummiplatte auf die Folie, gefolgt von einer 1/8 Zoll großen Acrylplatte, dann füge das erste von drei Zehn-Pfund-Gewichten auf die Acrylplatte hinzu. Zunächst schwimmt das erste Gewicht, damit es sich absetzen und stabilisieren kann, bevor es mit den beiden verbleibenden Hantelscheiben weitergeht.

Wenn Sie fortfahren möchten, stellen Sie eine heiße Platte auf 70 Grad Celsius ein und härten Sie das PDMS vier Stunden lang aus. Lassen Sie das PDMS nach dem Aushärten mindestens eine weitere Stunde abkühlen und schälen Sie dann vorsichtig die obere Durchsichtigkeitsfolie für den Wafer. Zum Schluss entfernst du die Kanäle mit der Pinzette.

Legen Sie die Kanäle kopfüber auf eine neue, saubere Durchlichtfolie und reinigen Sie alle Öffnungen mit kreisenden Bewegungen und einer scharfen Pinzette. Entfernen Sie alle Fragmente von PDMS, die sich lösen. Legen Sie dann ein Stück Packband mit der Klebeseite nach oben auf die Werkbank und legen Sie den PDMS-Kanal mit der Seite nach unten auf das Band.

Drücken Sie mit dem runden Ende einer Pinzette auf die Kanäle, um einen guten Kontakt zu gewährleisten. Entfernen Sie die Kanäle und wiederholen Sie diesen Vorgang auf beiden Seiten, bis alle sichtbaren Ablagerungen entfernt sind. Übertragen Sie dann die sauberen, vorbereiteten PDMS-Kanäle in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 70 % Ethanol gefüllt ist.

Wirbeln Sie die Kanäle 30 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit vor und ersetzen Sie dann die Lösung durch frisches Ethanol mit 70 %. Übertragen Sie den PDMS-Kanal mit aseptischen Techniken nach oben in eine saubere und sterile Schüssel. Anschließend werden die Kanäle UV-behandelt, bis das Ethanol verdampft ist.

Sobald sie trocken sind, drehe die Kanäle auf einen Deckglas oder eine Glasbodenschale und drücke sie auf das Glas, um sie gut abzudichten. Fügen Sie ein Pflaster aus sterilem PDMS hinzu, um den mittleren Teil der Kanäle abzudecken und zu schließen, und lassen Sie das Setup gründlich trocknen, bevor Sie fortfahren. Geben Sie als Nächstes einen 100-Mikroliter-Tropfen einer Kollagenlösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter auf einen Kanal und ziehen Sie ihn mit einem Vakuum durch den Kanal.

Inkubieren Sie die Kanäle eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und überführen Sie die Kanäle, die noch mit Kollagenbeschichtungslösung gefüllt sind, in einen Kühlschrank. Kühle das Set etwa 15 bis 30 Minuten lang und entferne dann mit einem Aspirator oder einer Pipette die Kollagenbeschichtungslösung aus den Kanälen. Beginnen Sie damit, die Kollagenlösung zu neutralisieren, sie mit Zellmedien zu verdünnen und 15 Minuten lang auf Eis zu inkubieren.

Geben Sie dann 120 bis 150 Mikroliter der Kollagenlösung in Anschluss A eines vorgekühlten Kanals. Befestigen Sie als Nächstes eine 25-Milliliter-Pipette an einer Vakuumleitung und platzieren Sie sie über Anschluss C. Verwenden Sie sie, um die Mischung in einer einzigen gleichmäßigen Bewegung einzusaugen, und stoppen Sie, sobald das Kollagen das Ende erreicht. Der wichtigste Schritt zur Generierung von Zufallsmatrizen besteht darin, das Kollagen langsam durch den Kanal zu ziehen.

Wenn es zu schnell durchgezogen wird, führt dies zu einer verstärkten Ausrichtung in dem Teil des Kanals oder im gesamten Kanal. Entfernen Sie vorsichtig überschüssige Lösung aus den Portbereichen und legen Sie dann sterile PDMS-Pflaster auf beide Ports A und C. Entfernen Sie nach zwei bis drei Minuten das mittlere PDMS-Pflaster, das Port B abdeckt, und geben Sie zwei bis drei Mikrostreuen von Zellen in einer Konzentration von ein bis drei Millionen Zellen pro Milliliter in den mittleren Port. Lassen Sie das Gel weitere 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur teilweise polymerisieren und überführen Sie das Gel dann für weitere 15 bis 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Entfernen Sie nach der Polymerisation die PDMS-Anschlussabdeckungen, und fügen Sie Medien hinzu, um den Kanal vollständig abzudecken. Hier wurden 50.000 vier T-on-Zellen für 5 Tage entweder in ein 2 mg/ml oder ein 3,5 mg/ml Kollagengel eingebettet. Die Ein-Zell-Linie mit vier T-Zellen ist eine hochkontraktile Krebslinie von Med Aesthetics, die jedoch nur in der Lage ist, das Gel mit hoher Dichte um etwa 10 % zusammenzuziehen. Vergleichbare Gele mit niedriger Dichte werden im gleichen Zeitraum zu 57 % kontrahiert.

Der Grad der Kollagenausrichtung wird durch die Geschwindigkeit des Kollagenflusses moduliert, so dass eine höhere Kollagenflussrate eine bessere Ausrichtung ergibt. Die Verwendung schmalerer Kanäle in Verbindung mit höheren Vakuumdrücken verbessert die Ausrichtung des Kollagennetzwerks, während ein breiterer Kanal, der in Verbindung mit niedrigem Vakuumdruck verwendet wird, zufällige Matrizen erzeugt. Einmal gemeistert, kann das Gießen von Kollagengelen oder -kanälen in zweieinhalb Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Komponenten vor dem Start einzurichten. Sobald Sie mit dem Kollagen arbeiten, müssen Sie schnell arbeiten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der 3D-Zellbiologie, um die Adhäsion, Migration und Invasion von Zellen in dreidimensionale extrazelluläre Umgebungen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kollagengele unterschiedlicher Dichte gießt und wie man sowohl zufällige als auch ausgerichtete Kollagenmatrizen erzeugt.