Modeling Chemotherapie beständig Leukämie In Vitro

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, resistente akute lymphatische Leukämie (ALL) in vitro besser zu modellieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Behandlung von refraktärer ALL zu beantworten, wie die Mikroumgebung des Knochenmarks die chemotherapeutische Resistenz von ALL-Zellen beeinflusst. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie erheblich billiger und weniger zeitaufwändig ist als die Verwendung herkömmlicher Tiermodelle zur Untersuchung der Arzneimittelempfehlung bei refraktären ALL-Zellen.

Beginnen Sie mit der Aussaat von fünf bis 20 mal 10 bis sechs Leukämiezellen in 10 Millilitern tumorspezifischem Kulturmedium auf eine 100-Millimeter-Platte mit 80 bis 90 % konfluenten Knochenmarkstromazellen oder Osteoblasten. Kippen Sie jeden vierten Tag die Platte zur Seite und saugen Sie alle bis auf einen Milliliter des Mediums ab, wobei Sie darauf achten, die anhaftende Zellschicht nicht zu stören. Geben Sie dann vorsichtig neun Milliliter frisches leukämisches Zellkulturmedium tropfenweise in die Ecke der Platte an der Seite, um eine minimale Störung der adhärenten Zellen zu gewährleisten.

Nach dem 12. Tag der Co-Kultur pipettieren Sie das Kulturmedium etwa fünf bis 10 Mal vorsichtig auf und ab über die Platte, um die schwimmenden leukämischen Zellen zu sammeln. Und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Dann säen Sie die Zellen auf eine neue Platte aus 80 bis 90 % konfluenten Knochenmarkstromazellen oder Osteoblasten, wie gerade gezeigt.

Bis zum vierten Tag haben sich drei Subpopulationen von Leukämiezellen gebildet, wobei die suspendierten Leukämiezellen frei im Medium schweben. Die Phase Bright Leukämiezellen haften an der Oberfläche der adhärenten Zellmonoschicht, und die Phase Dim Leukämiezellen wanderten unter die Monoschicht. Um die G10-Bead-Säulen vorzubereiten, erwärmen Sie zunächst 30 Milliliter Zellkulturmedium pro Säule in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius.

Ziehe dann mit einer Pinzette Glaswolle in dünne, lose Stränge. Und fügen Sie mehrere Schichten leicht gepackter Stränge zu einer benötigten 10-Milliliter-Spritze pro Säule hinzu. Wenn die Spritze zu 2/3 gefüllt ist, befestigen Sie einen Einweg-Absperrhahn in geschlossener Position an der Spitze und klemmen Sie die Spritze auf einen Ringständer, der hoch genug ist, dass ein konisches 50-Milliliter-Auffangröhrchen unter den Absperrhahn gelegt werden kann.

Legen Sie nun ein Sammelröhrchen unter die Spritzensäule. Und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um Tropfen von G10-Partikeln, die in PBS suspendiert sind, auf die Glaswolle zu geben. Fügen Sie die G10-Partikel hinzu, bis sich ein zwei Milliliter großes Pellet bildet.

Geben Sie dann zwei Milliliter-Aliquots des vorgewärmten Mediums in die Säule. Und öffnen Sie langsam das Absperrventil, so dass das Medium tropfenweise aus der Säule fließt. Wenn 10 Milliliter Medium vollständig durch die Säule abgeflossen sind, schließen Sie den Absperrhahn.

Entsorgen Sie den Durchfluss und legen Sie ein neues Auffangrohr unter die Säule. Um die suspendierte Tumorsubpopulation zu entnehmen, aspirieren Sie das Medium aus der Co-Kulturplatte der leukämischen Zellen und spülen Sie die Platte mit demselben Medium einmal vorsichtig aus. Übertragen Sie dann die Subpopulation der schwimmenden Suspensionsleukämiezellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Um die Phase Bright-Tumorsubpopulation zu ernten, geben Sie 10 Milliliter frisches Medium zurück auf die Co-Kulturplatte. Und spülen Sie etwa fünfmal kräftig genug, um die adhärenten leukämischen Zellen zu entfernen, ohne die adhärente Zellmonoschicht zu entfernen. Übertragen Sie dann die Phasenhell-Subpopulation in ein eigenes konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Um die Phase-Dim-Tumorsubpopulation zu entnehmen, entfernen Sie das restliche Medium mit einer PBS-Spülung von einem Milliliter. Und lösen Sie die Zellen mit drei Millilitern Trypsin bei 37 Grad Celsius ab. Nach fünf Minuten klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, um die anhaftenden Zellen zu entfernen, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter FBS, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.

Spülen Sie dann das Serum drei- bis fünfmal aus, um alle großen Zellaggregate aufzubrechen. Und übertragen Sie die ungereinigte Phase-Dim-Subpopulation in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn alle Subpopulationen gesammelt wurden, drehen Sie die Zellen nach unten.

Und suspendieren Sie jedes der Pellets wieder in einem Milliliter vorgewärmtem Medium. Wenn der Absperrhahn vollständig geschlossen ist, wird für jede Subpopulation mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette das gesamte Volumen der Zellen von einem Milliliter tropfenweise auf eine der vorbereiteten G10-Säulen gegeben, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen auf oder innerhalb des G10-Pellets verbleiben. Lassen Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem G10-Pellet inkubieren.

Geben Sie dann ein bis drei Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium in die Säule. Und öffnen Sie den Absperrhahn, so dass das Medium langsam tropfenweise aus den Säulen austritt. Fügen Sie den Säulen weiterhin vorgewärmtes Medium in Schritten von ein bis zwei Millilitern hinzu.

Wenn insgesamt 15 bis 20 Milliliter leukämische Zellen entnommen wurden, schließen Sie den Absperrhahn und verschließen Sie das Entnahmeröhrchen. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder in dem entsprechenden nachgeschalteten Analysepuffer. Nach der Trypsinisierung der adhärenten Zellschicht werden zwei unterschiedliche Zellpopulationen durch Vorwärts- und Seitenstreuanalyse beobachtet.

Nach der G10-Trennung wird eine reine Population von ALL-Zellen gewonnen. Von besonderem Interesse ist, dass alle Phase-Dim-Zellen, die aus Knochenmark-Stromazellen oder Osteoblasten-Cokulturen gewonnen wurden, nach der Exposition gegenüber zytotoxischen Chemotherapien wenig bis gar keinen Tod aufweisen. Beim Versuch dieser Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, diese Schritte so richtig wie möglich durchzuführen, um phänotypische Veränderungen, die in den leukämischen Zellen auftreten können, zu reduzieren.

Diese Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der Leukämieforschung die Möglichkeit, die Chemotherapie-resistente Leukämie in einem In-vitro-Modell zu modellieren, das der Mikroumgebung des Knochenmarks ähnlicher ist.