Name: Modeling Chemotherapie beständig Leukämie In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Erfahren Sie ein In-vitro-Kokulturmodell zur Untersuchung von Chemoresistenz bei akuter lymphatischer Leukämie. Diese Methode nutzt primäre Knochenmarkstromazellen und Osteoblasten, um therapierefraktäre leukämische Zellen zu isolieren und zu analysieren.

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Unterstützt von den National Institutes of Health (NHLBI) R01 HL056888 (LFG), dem National Cancer Institute (NCI) RO1 CA134573NIH (LFG), P30 GM103488 (LFG), WV CTR-IDEA NIH 1U54 GM104942, dem Alexander B. Osborn Hematopoietic Malignancy and Transplantation Program und dem WV Research Trust Fund. Wir sind dankbar für die Unterstützung von Dr. Kathy Brundage und der West Virginia University Flow Cytometry Core Facility, unterstützt von NIH S10-OD016165 und dem Institutional Development Award (IDeA) des NIH Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (CoBRE P30GM103488 und INBRE P20GM103434).

1. Advanced Vorbereitung <ol><li> Vorbereiten Dextran G10 Partikel. <ol><li> Bereiten G10 Aufschlämmung durch Zugabe von 50 ml 1x PBS zu 10 g G10 Teilchen. Mischen durch Umdrehen und lassen G10 aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4 ° CO / N zu regeln. </li><li> Der Tag des G10-Säule Trennung absaugen PBS aus der ständigen G10-Partikel und 50 ml frischem PBS hinzufügen. Mischen durch Umdrehen. Zweimal wiederholen, Zugabe von 50 ml frischem PBS ständiger G10 Teilchen und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Kultivieren BMSC und OB. <ol><li> Halten beide BMSC oder OB bei 37 ° C in 6% CO 2 und 10 cm-Gewebekulturplatten gezüchtet, bis 90% Konfluenz erreicht wird. </li><li> Trypsinize BMSC oder OB-Zellen und spalten 1: 2 auf neue 10 cm-Platten. Die Zellen werden auf diese Normen herangezogen, bis für leukämische Co-Kultivierung benötigt wird. </li></ol></li></ol> 2. Aufbau und Pflege einer Co-Kultur <ol><li> In 5-20 x 10 6 Leukämiezellen in 10 ml tumorspezifischen Kulturmedien auf einem 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte. HINWEIS: Unser Labor hält Co-Kulturen bei 37 ° C in 5% O 2, um besser die Knochenmark-Mikroumgebung rekapitulieren, die von 1% bis 7% auf einen Bereich 16-18 gezeigt ist. Doch bei diesem Sauerstoffspannung Kokulturen Aufrechterhaltung ist nicht kritisch für die Festlegung der drei Leukämie Subpopulationen und liegt im Ermessen des Labors. </li><li> Jeden 4. Tag alle, aber 1 ml Medium (einschließlich leukämischen Zellen in Suspension) entfernen und mit 9 ml frisch Leukämiekulturmedien ersetzen. Beim Entfernen von 9 ml Medium von der Platte, sein nicht vorsichtig die BMSC oder OB haftende Schicht zu stören. <ol><li> Entfernen Sie das Medium durch Platte zur Seite und absaugen Medien in der Ecke der Platte zu kippen. Außerdem, wenn frisches Medium hinzufügen, achten Sie darauf, tropfenweise in die Ecke der Platte gegen die Seitenwand hinzuzufügen minimaler Unterbrechung des BMSC oder OB haftende Schicht zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Nach dem 12. Tag der Co-Kultur, spülen Leukämiezellen von BMSC oder OB Schicht durch Pipettieren von Kulturmedien von Schale nach oben und unten leicht über der Schale etwa 5 bis 10 mal und dann in 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Reseed auf neu 80% -90% konfluent BMSC oder OB Platte als 2,1 in Schritt beschrieben. HINWEIS: Die schonende Spülung der Co-Kultur wie in Schritt 2.3 wird S und PB leukämischen Zellen ohne Störung des BMSC oder OB-Monoschicht zu entfernen. Dies ermöglicht nur Tumorzellen auf die nächste Co-Kulturplatte überführt werden. Diese 12-Tage-Zyklus kann so oft wie erforderlich auf Bedürfnisse der Nutzer wiederholt werden. </li></ol> 3. Vorbereitung G10 Bead Columns HINWEIS: Wenn sterile Downstream-Analyse oder die Kultivierung folgenden G10-Säule Trennung erforderlich ist, die folgenden Schritte steriler Technik zunutze machen sollten, und G10 Spalten sollte in einem sterilen biologischen Haube sein Setup durchgeführt. <ol><li> Pre-warm Zellkulturmedien auf 37 ° C in einem Wasserbad (~ 30 ml pro Säule). Mit einem 10-ml-Einwegspritze, zu entfernen und Kolben verwerfen. In Glaswolle Spritze. </li><li> Mit einer Pinzette auseinanderziehen Glaswolle in dünne lose Stränge. In mehreren Schichten aus leicht verpackt Glaswolle an der Spritze, bis 2/3 der Spritze mit Glaswolle gefüllt ist. HINWEIS: Die Glaswolle ist entscheidend Verunreinigungen der Leukämiezell Sammlung lose G10 Partikel zu verhindern. Stellen Sie sicher, Glaswolle gepackt genug, um die G-10-Partikel zu unterstützen, aber nicht zu dicht gepackten Medienstrom durch die Säule zu blockieren. </li><li> Bringen 1-Wege-Hahn auf die Spitze der Spritze in die geschlossene Position. </li><li> Clamp Spritze Spalte Ring stehen hoch genug, so eine 50 ml konischen Röhrchen (Sammelrohr) kann unter Absperrhahn platziert werden. Zeigen Sammelröhrchen unter Spritze Spalte. </li><li> Mit einem 10 ml-Pipette hinzufügen, tropfenweise, Partikel G10 in PBS auf die Säule oben aufdie Glaswolle. Fügen Sie weitere G10 Partikel bis zu einem ~ 2 ml Pellet aus G10-Teilchen bildet sich auf der Oberseite des Glaswolle (wie von Abstufungen auf die Spritze gemessen). </li><li> Gleichgewicht kommen die G-10-Säule, die mit vorgewärmten Medien. <ol><li> 2 ml vorgewärmten Medien Spalte. Offene Absperrventil langsam, so dass Medien fließt aus der Spalte tropft. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.6.1 bis insgesamt 10 ml vorgewärmtes Medium wurden über die Säule lief. HINWEIS: Wenn G10 Partikel in der Strömung durch die Sammelrohr gesehen werden, entweder 1) mehr G10-Partikel in den halten ~ 2 ml Pellet dafür, dass keine zusätzlichen G10 Partikel aus der Kolonne entweichen oder 2) ersetzen Säule mit einem unbenutzten ein und wiederholen Schritte 3.4-3.6.1. </li><li> Nach den vorgewärmten Medien Abflüsse aus der Säule, den Wasserhahn schließen und Sammelrohr mit Fluss durch verwerfen. Hinzufügen neuer Sammelröhrchen unter Spalte. Spalte ist bereit, mit Medien + Zellgemisch geladen werden. HINWEIS: Spaltensofort und nicht erlaubt sollten zum Trocknen verwendet werden. </li></ol></li></ol> 4. Die Trennung 3 Subpopulationen in Co-Kultur <ol><li> Sammlung von Suspension (S) Tumor Subpopulation. <ol><li> Absaugen Medien von Co-Kulturplatte mit Pipette und sanft wieder gelten die gleichen Medien, um die Platte zu spülen und Medien, die Leukämiezellen in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln. Die Leukämiezellen gesammelt sind die S-Subpopulation. </li></ol></li><li> Sammlung von Phase Bright (PB) Tumor Subpopulation. <ol><li> 10 ml frisches Medium wieder auf Co-Kulturplatte. Spülen Sie kräftig durch hinzugefügte Medien Auf- und Abpipettieren etwa 5 mal haftLeukämieZellen zu entfernen, aber nicht hart genug haft BMSC / OB Komponente zu entfernen. </li><li> Saugen Sie mit Pipette und sammeln Medien in einem 15 ml konischen Röhrchen. Die gesammelten Zellen sind die PB Subpopulation. </li></ol></li><li> Sammlung von Phase-Dim (PD) Tumor Subpopulation. <ol><li> Rinse-Platte mit 1 ml PBS zu remove Stoffreste. Trypsinize Co-Kulturplatte mit 3 ml Trypsin und Ort in 37 ° C Inkubator für 5 min. </li><li> Entfernen Platte von Inkubator und sanft tippen Seiten der Platte haft BMSC / OB zu entfernen. </li><li> 1 ml fötales Rinderserum (FBS) und Pipette auf und ab 3-5 mal abgesehen große Zellaggregate zu brechen. </li><li> Sammeln Medien mit Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Diese Zellen sind das ungereinigte PD Subpopulation mit BMSC / OB als auch. </li></ol></li><li> Zentrifuge 3 Subpopulationen bei 400 g für 7 min isoliert. Saugen und Überstand verwerfen dann individuell resuspendieren Pellets in 1 ml vorgewärmten Medien. Zellen sind bereit, auf einer G10-Säule geladen werden. </li></ol> 5. Laden Co-Kulturzellen auf G10-Säule HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Hahn wird vor der Zugabe von Medien, die Zellen zu G10-Säule vollständig geschlossen. Außerdem muss jede Unterpopulation über einen separaten G10-Säule lief, so nicht zu introducE keine Vorspannung zwischen Populationen in Downstream-Analyse. <ol><li> Mit einem 1000 ul Pipette, 1 ml von jeder Zell-Subpopulation in vorgewärmten Medien zu einem separaten G10-Säule tropft. Stellen Sie sicher, dass die Medien die Zellen bleibt an der Spitze oder innerhalb G10 Pellet enthält. Erlauben Zellen für 20 min bei RT auf G10 Pellet inkubiert. HINWEIS: Absperrhahn geschlossen bleibt für die Dauer der Inkubation. </li></ol> 6. Sammeln Leukämiezellen von G10-Säule <ol><li> In 1-3 ml vorgewärmt Medien zu den G-10-Säule. Offene Absperrventil und erlauben Medien die Spalte tropfenweise langsam zu beenden. HINWEIS: Es ist wichtig, eine langsame Fließgeschwindigkeit aus der Säule oder der G10-Pellet, das BMSC / OB zu pflegen können aus der Säule zu waschen und die isolierten Leukämiezellen kontaminieren. </li><li> Weiter hinzuzufügen vorgewärmten Medien in kleinen Schritten (1-2 ml) auf G10-Säule, bis insgesamt 15 bis 20 ml hat durch die Säule laufen und gesammelt wurde. Absperrhahn schließen vaSammelröhrchen lve und Kappe. HINWEIS: Wenn ein G10 Partikel-Pellet am Boden des Sammelrohrs gesehen wird, sanft entfernen Medien aus dem Rohr verlassen G10 Partikel-Pellet ungestört und Übertragung auf neue Röhre. </li><li> Zentrifuge gesammelt Medien bei 400 × g für 7 min bei RT. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in Puffer geeignet für Folgeanwendungen. </li><li> Die Zellen sind nun eine reine Population von Leukämiezellen frei von BMSC oder OB Kontamination und sind bereit, bei der Benutzer Ermessen zu Downstream-Anwendungen angewendet werden. HINWEIS: Leukämiezelllebensfähigkeit sollten unverändert bleiben, wenn die Zellen durch G10 Säulen vorbei. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Minimaler Resterkrankung (MRD), das mit Rückfall der Krankheit beiträgt wie vor eine große klinische Herausforderung bei der Behandlung von aggressiven refraktärer ALL, sowie eine Vielzahl von anderen hämatologischen Malignitäten zu sein. Das Knochenmark-Mikroumgebung ist die häufigste Lokalisation eines Rückfalls in ALLEN 3,8. Als solche Modelle, die das Knochenmark-Mikroumgebung sind wichtige Werkzeuge zu testen Hypothesen während der Chemotherapie Exposition gegenüber leukämischen Überleben von Tumorzellen...

Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Methode ist es, einen effizienten, kostengünstigen in vitro Ansatz bereitzustellen, der die Untersuchung der Mechanismen unterstützt, die dem knochenmarkgestützten Überleben von Leukämiezellen während der Chemotherapie-Exposition zugrunde liegen. Es ist gut dokumentiert, dass überlebende Resttumorzellen, die nach der Behandlung bestehen bleiben, zum Rückfall der Krankheit beitragen, der oft aggressiver ist als der bei der Diagnose und oft weniger effektiv behandelt wird1-8. Modelle, die Leukämiezellen isoliert einbeziehen, wie z. B. solche, die auf die Kultivierung von Zellen in Medien allein beschränkt sind, um therapeutische Ansätze zu testen, berücksichtigen diese kritischen Signale oder die Heterogenität der Krankheit nicht, die als Reaktion auf die Verfügbarkeit von Nischen-abgeleiteten Hinweisen auftritt, in denen Tumorzell-Subpopulationen mit sehr spezifischen Wechselwirkungen mit Nischenzellen einen erhöhten Schutz ableiten. Standardmäßige 2D-Co-Kulturmodelle, die aus dem Knochenmark gewonnene Stromazellen und leukämische Zellen co-kultivieren, haben den Beitrag der Knochenmarknische etwas berücksichtigt und gezeigt, dass die Interaktion mit Zellen der Knochenmarkmikroumgebung ihre Resistenz gegen Chemotherapie erhöht und ihre Wachstumseigenschaften verändert9-14. Diese Modelle sind jedoch oft nicht in der Lage, das Langzeitüberleben von Tumorzellen zu rekapitulieren und informieren nicht genau über die Ergebnisse, die mit den resistentesten leukämischen Zellpopulationen verbunden sind, die zur MRD beitragen. In-vivo-Modelle sind nach wie vor von entscheidender Bedeutung und stellen den "Goldstandard" für die Untersuchung innovativer Therapien vor klinischen Studien dar, aber sie werden oft durch den Zeit- und Kostenaufwand für die Überprüfung von Hypothesen in Bezug auf resistente Tumoren und Krankheitsrückfälle in Frage gestellt. Daher wäre die Entwicklung aussagekräftigerer 2D-Modelle für Pilotuntersuchungen von Vorteil, um das Design des nachfolgenden präklinischen Designs auf Mausbasis besser zu informieren. 
Das in vitro 2D-Modell, das in diesem Bericht vorgestellt wird, hat nicht die Komplexität der echten in vivo Mikroumgebung, bietet aber ein kostengünstiges und reproduzierbares Mittel, um Tumorinteraktionen mit der Mikroumgebung zu untersuchen, die sich speziell für die Anreicherung der chemoresistenten Subpopulation von Tumorzellen eignet. Diese Unterscheidung ist wertvoll, da die Bewertung der gesamten Population von Tumorzellen den Phänotyp einer kleineren Gruppe therapieresistenter Tumorzellen maskieren kann, die das wichtigste Ziel darstellen. Ein weiterer Vorteil ist die Skalierbarkeit des Modells, um es an die interessierende Analyse anzupassen. Für Analysen, die eine signifikante Rückgewinnung von Tumorzellen erfordern, können Bulk-Kulturen etabliert werden, während Co-Kulturen in kleinen Maßstäben in Multi-Well-Platten für PCR-basierte Analysen oder mikroskopiebasierte Auswertungen verwendet werden können. 
Basierend auf diesem Bedarf haben wir ein In-vitro-Modell entwickelt, um die Heterogenität der Krankheit zu berücksichtigen, die für die akute lymphatische Leukämie (ALL) der B-Linie charakteristisch ist. Wir zeigen, dass ALLE Zellen, die viele Gemeinsamkeiten mit ihren gesunden Gegenstücken aufweisen, in unterschiedlichen Kompartimenten der BMSC- oder OB-Co-Kultur lokalisiert sind. Es werden drei Populationen von Tumorzellen generiert, die unterschiedliche Phänotypen aufweisen, die für die Untersuchung des therapeutischen Ansprechens wertvoll sind. Insbesondere zeigen wir, dass (ALL)-Zellen, die aus der "Phase Dim"-Population (PD) der Co-Kultur gewonnen wurden, durchweg therapierefraktär sind, mit einem Überleben, das sich Tumorzellen annähert, die keinen zytotoxischen Wirkstoffen ausgesetzt waren. Diese ALL-Zellen, entweder aus etablierten Zelllinien oder primären Patientenproben, wandern unter adhärente Stromazellen oder Osteoblastenschichten, können aber nach der Trypsinisierung von Kulturen und der Trennung von Zelltypen unter Verwendung von Geltyp 10 vernetzten Dextran (G10)-Partikelsäulen15 eingefangen werden. 
Hier präsentieren wir einen Aufbau einer 2D-Co-Kultur, die verwendet werden kann, um Interaktionen zwischen Stromazellen der Knochenmarkmikroumgebung (BMSC/OB) und leukämischen Zellen zu modellieren. Von besonderer Bedeutung ist die Beobachtung, dass leukämische Zellen relativ zur Stromazell-Monoschicht drei räumliche Subpopulationen bilden und dass die PD-Population aufgrund ihrer Interaktion mit dem BMSC oder OB eine Chemotherapie-resistente Tumorpopulation darstellt. Darüber hinaus zeigen wir, wie die leukämischen Zellpopulationen effektiv durch G10-Säulen isoliert werden können. Bemerkenswert ist, dass wir festgestellt haben, dass die Isolierung dieser Subpopulationen eine nachgelagerte Analyse der resistentesten PD-Population ermöglicht, um potenzielle Resistenzmodi zu bestimmen, die diesen Zellen aufgrund ihrer Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks, Stromazellen oder Osteoblasten übertragen werden. Zu den Techniken, die wir diesem Co-Kultur- und Isolationsmodell nachgeschaltet haben, gehören die durchflusszytometrische Bewertung, die proteomische Analyse und die gezielte Bewertung der Proteinexpression sowie die in jüngerer Zeit entwickelte Laserablations-Elektrospray-Ionisation (LAESI) und die Seahorse-Analyse zur Bewertung von Stoffwechselprofilen. Durch die Verwendung dieses Modells in Kombination mit den oben genannten Techniken haben wir festgestellt, dass die Parkinson-Population leukämischer Zellen einen chemotherapieresistenten Phänotyp aufweist, der im Vergleich zu leukämischen Zellen, die allein in Medien kultiviert wurden, oder solchen, die aus den anderen Subpopulationen in derselben Co-Kultur gewonnen wurden, einzigartig ist. Als solches eignet sich dieses Modell für eine strengere Evaluierung, um Strategien zu testen, die auf die chemotherapieresistentesten Leukämiezellen abzielen, die ihren resistenten Phänotyp durch Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks erhalten.

<table><tbody><tr><td>G10 Sephadex Kügelchen</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td>Im Manuskript bezeichnet als Geltyp 10 vernetzte Dextranpartikel</td></tr><tr><td>10 ml sterile Spritze</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Glaswolle</td><td>Pyrex</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>1-Wege-Absperrhähne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>14054-10</td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>World Wide Medical Products</td><td>41021039</td><td>Wird als Sammelröhrchen</td></tr> verwendet <tr><td>15 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>World Wide Medical Products</td><td>41021037</td><td>Wird für die Zellentnahme</td></tr> verwendet <tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin&nbsp;</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm Zellkulturschalen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Nährmedien</td>Osteoblasten-Nährmedien<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>C-27001</td><td>Für humane Osteoblasten&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medien</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-040</td><td>Für die Vorbereitung von Tumormedien&nbsp;</td></tr><tr><td>Zelllinien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhärente Zellen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Menschliche Osteoblasten</td><td>PromoCell</td><td>C-12720</td><td>Humane Osteoblasten wurden gemäß dem Lieferanten kultiviert" Empfehlungen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Humane Knochen-Morrow-Stromazellen</td><td>WVU-Biospecimen-Kern</td><td></td> Die <td>anonymisierten primären menschlichen Leukämie- und Knochenmark-Stromazellen (BMSC) wurden vom Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core und der West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank zur Verfügung gestellt. BMSC-Kulturen wurden wie zuvor beschrieben etabliert (*)</td></tr><tr><td><stark>Leukämische Zellen:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>REH</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CRL-8286</td><td>REH-Zellen wurden gemäß dem Lieferanten kultiviert." Empfehlungen und empfohlene Medien.&nbsp;</td></tr><tr><td>SD-1</td>, <td>DSMZ</td>, <td>ACC 366</td><td>und SD-1 wurden gemäß den Anforderungen des Lieferanten kultiviert. Empfehlungen und empfohlene Medien.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. Störung der Funktion der Stromazellen des Knochenmarks durch Etoposid. Biol Blutmarktransplantation J Am Soc Blutmarktransplantation. 1997 Aug; 3(3):122&ndash;32.</td></tr></tbody></table>

modeling chemotherapie beständig leukämie<em&gt; in vitro</em

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

Es ist allgemein bekannt, dass die Mikroumgebung des Knochenmarks einen einzigartigen Zufluchtsort für hämatopoetische Erkrankungen bietet, die an dieser Stelle sowohl initiieren als auch fortschreiten. Das im aktuellen Bericht vorgestellte Modell verwendet humane primäre Knochenmarkstromazellen und Osteoblasten als zwei repräsentative Zelltypen aus der Knochenmarknische, die den Phänotyp von Tumorzellen beeinflussen. Die in vitro Co-Kulturbedingungen, die für humane leukämische Zellen mit diesen primären Nischenkomponenten beschrieben wurden, unterstützen die Erzeugung einer chemoresistenten Subpopulation von Tumorzellen, die effizient aus der Kultur für die Analyse durch verschiedene Techniken gewonnen werden kann. Ein strenger Fütterungsplan zur Vermeidung von Nährstoffflüssen, gefolgt von Gel-Typ-10-vernetzten Dextran (G10)-Partikeln, der Rückgewinnung der Population von Tumorzellen, die unter die adhärenten Knochenmarkstromazellen (BMSC) oder Osteoblasten (OB) gewandert sind und eine "Phase Dim" (PD)-Population von Tumorzellen erzeugen, bietet eine konsistente Quelle für gereinigte, therapieresistente Leukämiezellen. Diese klinisch relevante Population von Tumorzellen kann mit Standardmethoden zur Untersuchung apoptotischer, metabolischer und zellzyklusspezifischer Regulationswege bewertet werden und bietet ein strengeres Ziel für die Erprobung neuartiger therapeutischer Strategien vor präklinischen Untersuchungen, die auf eine minimale Resterkrankung abzielen.

Erfolgreichen Aufbau und die Kultur dieser Co-Kultur-Modell wird bei der Errichtung von drei Subpopulationen von Leukämiezellen gegenüber dem haft BMSC oder OB-Monoschicht führen. Abbildung 1 zeigt, wie alle in einem BMSC Monoschicht ausgesät Zellen zunächst als nur eine einzige Population von suspendierten erscheinen Leukämiezellen. Im Laufe von 4 Tagen mit dem BMSC Leukämiezellen interagieren 3 Raum Subpopulationen von Leukämiezellen zu bilden (gesperrt (S), Phase hell...

Der vorliegende Bericht fasst ein Protokoll zusammen, das verwendet werden kann, um den Einfluss der Mikroumgebungsnische des Knochenmarks auf leukämische Zellen zu modellieren, wobei der Schwerpunkt auf der Anreicherung der chemoresistentesten Subpopulation liegt.

Modeling Chemotherapie beständig Leukämie<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, resistente akute lymphoblastische Leukämie, oder ALL, in vitro besser zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Behandlung von refraktärer ALL zu beantworten, insbesondere wie das Knochenmark-Mikroumfeld die chemotherapeutische Resistenz von ALL-Zellen beeinflusst. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass sie deutlich kostengünstiger und zeitsparender ist als die Verwendung herkömmlicher Tiermodelle zur Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf refraktäre ALL-Zellen.Beginnen Sie damit, fünf bis 20 Mal 10 hoch 6 leukämische Zellen in 10 Milliliter tumor-spezifischem Kulturmedium auf eine 100-Millimeter-Platte mit 80 bis 90 % konfluenten Knochenmark-stromalen Zellen oder Osteoblasten auszusäen. Alle vier Tage kippen Sie die Platte zur Seite und aspirieren alles Medium bis auf einen Milliliter, wobei Sie darauf achten, die anhaftende Zellschicht nicht zu stören. Fügen Sie dann vorsichtig neun Milliliter frisches Kulturmedium für leukämische Zellen tropfenweise in die Ecke der Platte entlang der Seite hinzu, um eine minimale Störung der anhaftenden Zellen sicherzustellen.Nach dem 12. Tag der Co-Kultur das Kulturmedium vorsichtig etwa fünf bis zehn Mal über die Platte auf- und abpipettieren, um die schwebenden leukämischen Zellen zu sammeln. Anschließend die Zellen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß überführen. Danach die Zellen erneut auf einer neuen Platte mit 80 bis 90 % konfluenten Knochenmark-stromalen Zellen oder Osteoblasten aussäen, wie zuvor gezeigt.Am vierten Tag haben sich drei Subpopulationen leukämischer Zellen gebildet, wobei die suspendierten leukämischen Zellen frei im Medium schwimmen. Die phasenhellen leukämischen Zellen haften an der Oberfläche der adhärenten Zellmonoschicht, und die phasendunklen leukämischen Zellen sind unter die Monoschicht migriert. Um die G10-Perlensäulen vorzubereiten, erwärmen Sie zunächst 30 Milliliter Zellkulturmedium pro Säule in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius.Verwenden Sie anschließend eine Pinzette, um Glaswolle in dünne, lockere Strähnen auseinanderzuziehen, und geben Sie mehrere Schichten dieser locker befüllten Strähnen in eine 10-Milliliter-Spritze pro benötigte Säule. Wenn die Spritze zu zwei Dritteln gefüllt ist, befestigen Sie einen Einweg-Hahn in geschlossener Stellung an der Spitze und klemmen Sie die Spritze an einen Stativhalter, der hoch genug ist, damit ein 50-Milliliter-Kegelröhrchen zur Sammlung unterhalb des Hahns platziert werden kann.Platzieren Sie nun ein Sammelgefäß unter die Spritzen-Säule. Geben Sie mithilfe einer 10-Milliliter-Pipette Tropfen von G10-Partikeln, die in PBS suspendiert sind, auf die Glaswolle. Fahren Sie fort, G10-Partikel hinzuzufügen, bis sich ein zweimillilitergroßes Pellet bildet.Danach zwei Milliliter-Aliquote des vorgewärmten Mediums auf die Säule geben. Langsam das Hahnventil öffnen, sodass das Medium tropfenweise aus der Säule austritt. Wenn 10 Milliliter Medium vollständig durch die Säule abgelaufen sind, das Hahnventil schließen.Entfernen Sie den Durchlauf und setzen Sie ein neues Sammelgefäß unter die Säule. Um die suspendierte Tumorsubpopulation zu gewinnen, aspirieren Sie das Medium aus der leukämischen Zell-Kokulturschale und spülen Sie die Schale ein Mal vorsichtig mit demselben Medium aus. Überführen Sie anschließend die schwimmende, suspendierte leukämische Zellsubpopulation in ein kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen.Um die Phase-helle Tumorsubpopulation zu gewinnen, 10 Milliliter frisches Medium auf die Co-Kulturplatte geben und etwa fünfmal kräftig spülen, um die adhärenten leukämischen Zellen zu entfernen, ohne die adhärente Zellmonoschicht zu lösen. Anschließend die Phase-helle Subpopulation in ein eigenes kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen überführen.Um die Phase-Dim-Tumorsubpopulation zu gewinnen, entfernen Sie das verbleibende Medium durch eine Spülung mit einem Milliliter PBS und lösen Sie die Zellen mit drei Millilitern Trypsin bei 37 Grad Celsius ab. Nach fünf Minuten klopfen Sie vorsichtig an die Seiten der Platte, um die anhaftenden Zellen zu lösen, und geben anschließend ein Milliliter FBS zu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.Danach das Serum drei bis fünfmal spülen, um eventuelle große Zellaggregate aufzubrechen. Die unreine Phase-Dim-Teilpopulation in ein neues kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Wenn alle Teilpopulationen gesammelt wurden, die Zellen abzentrifugieren.Und resuspendieren Sie jedes der Pellets in einem Milliliter vorgewärmtem Medium. Bei vollständig geschlossenem Hahn geben Sie für jede Subpopulation mithilfe einer 1.000-Mikroliter-Pipette das gesamte Ein-Milliliter-Volumen der Zellen tropfenweise auf die Oberfläche einer der vorbereiteten G10-Säulen, wobei sichergestellt werden muss, dass die Zellen auf der Oberfläche oder innerhalb des G10-Pellets verbleiben. Lassen Sie die Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur auf dem G10-Pellet inkubieren.Fügen Sie dann ein bis drei Milliliter frisches, vorgewärmtes Medium zur Säule hinzu. Öffnen Sie den Hahn, sodass das Medium langsam tropfenweise aus der Säule austritt. Geben Sie weiterhin vorgewärmtes Medium in die Säulen, jeweils in Portionen von ein bis zwei Millilitern.Wenn insgesamt 15 bis 20 Milliliter leukämischer Zellen gesammelt wurden, schließen Sie den Hahn und verschließen Sie das Sammelröhrchen. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in dem geeigneten Puffer für die nachfolgende Analyse. Nach der Trypsinisierung der anhaftenden Zellschicht werden zwei unterschiedliche Zellpopulationen durch Vorwärts- im Vergleich zu Seitwärtsstreuungsanalyse beobachtet.Nach der G10-Trennung wird eine reine Population von ALL-Zellen gewonnen. Von besonderem Interesse ist, dass alle aus Knochenmark-Stromazellen oder Osteoblasten-Kokulturen gewonnenen Phase-Dim-Zellen nach Exposition gegenüber zytotoxischer Chemotherapie kaum bis keinen Zelltod zeigen. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Schritte so sorgfältig wie möglich durchzuführen, um phänotypische Veränderungen in den leukämischen Zellen zu minimieren.Diese Technik bietet Forschern auf dem Gebiet der Leukämieforschung die Möglichkeit, die chemotherapieresistente Leukämie in einem In-vitro-Modell zu untersuchen, das der Knochenmarkmikroumgebung stärker ähnelt.

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Research

Forschung

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Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt die Technik für die langfristige 2D-Co-Kultur von Leukämiezellen mit Knochenmarkstromazellen, um ihre Interaktion mit der Mikroumgebung des Knochenmarks zu untersuchen. Das 2D-Kokulturmodell nutzt die akuten lymphatischen Leukämiezellen und die Stroma- oder Osteoblasten des Knochenmarks, die den Phänotyp der Tumorzellen beeinflussen. Diese Studie wird die Untersuchung der Mechanismen unterstützen, die dem knochenmarkgestützten Überleben von Leukämiezellen während der...

2D-Co-Kultur von leukämischen Zellen mit BMSCs: Eine Methode zur Gewinnung von Subpopulationen leukämischer Zellen

Dieses Video beschreibt eine Methode zur räumlichen Trennung von drei leukämischen Zellsubpopulationen: die schwebenden leukämischen Zellen, die frei in den Medien schweben, phasenhelle leukämische Zellen, die an der Oberfläche der mesenchymalen Stromazell-Monoschicht haften, und die phasenschwachen Leukämiezellen, die unter die mesenchymale Stromazell-Monoschicht aus der 2D-Co-Kultur gewandert sind.

Leukämische Subpopulationsernte: Eine Methode zur räumlichen Trennung von leukämischen Zellsubpopulationen aus 2D-Cokulturen

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Wir beschreiben einen Hochdurchsatz-Wirkstoffsensitivitätsassay für primäre multiple Myelomzellen. Es besteht aus einer Rekonstruktion der Mikroumgebung des Knochenmarks (einschließlich extrazellulärer Matrix und Stroma) in Multi-Well-Platten und einer nicht-invasiven Methode zur longitudinalen Quantifizierung der Zellviabilität.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

Das RNAi-Screening (High-Throughput-RNA-Interferenz) unter Verwendung eines Pools lentiviraler shRNAs kann ein Werkzeug sein, um therapeutisch relevante synthetische tödliche Ziele in Malignomen nachzuweisen. Wir bieten einen gepoolten shRNA-Screening-Ansatz zur Untersuchung der epigenetischen Effektoren bei akuter myeloischer Leukämie (AML).

Gepooltes shRNA-Bibliotheksscreening zur Identifizierung von Faktoren, die einen Phänotyp der Arzneimittelresistenz modulieren

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Generierung und Fehlerbehebung von Xenotransplantaten der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beim Menschen aus Zelllinien und frischem Patientenmaterial in transient immunsupprimierten Zebrafischembryonen sowie Richtlinien für die Beurteilung des Ansprechens auf das Arzneimittel mittels Durchflusszytometrie. Die experimentelle Pipeline kann auch für solide Tumore angepasst werden.

Schnelle in vivo Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente mit Hilfe von Leukämiezelltransplantaten in Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt die In-Ovo-Xenotransplantation von patienteneigenen B- und T-Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), die 4 Tage nach der Injektion erfolgt.

In Ovo Xenotransplantation von patienteneigenen Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) (PDX-ALL)

Das Protokoll zielt darauf ab, ein Mausmodell zur Erzeugung von Schüben akuter lymphatischer Leukämie zu beschreiben, basierend auf der Dynamik des Ansprechens auf eine Induktionschemotherapie.

Mausmodell des Leukämie-Rezidivs zur Induktionschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie

Erfahren Sie ein In-vitro-Kokulturmodell zur Untersuchung von Chemoresistenz bei akuter lymphatischer Leukämie. Diese Methode nutzt primäre Knochenmarkstromazellen und Osteoblasten, um therapierefraktäre leukämische Zellen zu isolieren und zu analysieren.

Modeling Chemotherapie beständig Leukämie

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