Leukämische Subpopulationsernte: Eine Methode zur räumlichen Trennung von leukämischen Zellsubpopulationen aus 2D-Cokulturen

- Wenn leukämische Zellen mit mesenchymalen Stromazellen co-kultiviert werden, interagieren sie mit Stromazellen und bilden drei Subpopulationen. Frei schwebende suspendierte Zellen, phasenhelle Zellen, die an der Oberfläche der mesenchymalen Monoschicht haften, und phasenschwache Zellen unter der mesenchymalen Monoschicht. Um jede Subpopulation zu trennen, nehmen Sie eine Gewebekulturplatte mit einer mesenchymalen Stromazell-Monoschicht.

Leukämische Zellen, die in tumorspezifischen Nährmedien vorliegen, werden auf die Monoschicht gesät und die Platte für die gewünschte Dauer inkubiert. Sammeln Sie anschließend Tumorzellen in Suspension, indem Sie die frei schwebenden Zellen in ein separates Röhrchen pipettieren. Geben Sie nun das frische Medium auf die Platte und pipettieren Sie kräftig, um die phasenhellen Tumorzellen von der mesenchymalen Monoschichtoberfläche zu lösen.

Sammeln Sie diese Zellen, indem Sie sie in ein separates Röhrchen pipettieren. Geben Sie Trypsin in die Platte, um die anhaftenden mesenchymalen Zellen zu entfernen. Fügen Sie fötales Rinderserum oder FBS hinzu, um die Wirkung von Trypsin zu stoppen und die Zellaggregate aufzubrechen. Sammeln Sie nun die Phase-Dim-Zellen in einem Röhrchen. Zentrifugieren Sie alle drei Röhrchen mit unterschiedlichen Zellsubpopulationen einzeln und resuspendieren Sie das Pellet in frischem Medium für die weitere Analyse. Im folgenden Protokoll werden wir suspensions-, phasenhelle und phasendämmende leukämische Zellen aus 2D-Cokulturen isolieren.

- Um die suspendierte Tumorsubpopulation zu entnehmen, aspirieren Sie das Medium aus der Co-Kulturplatte der leukämischen Zellen und spülen Sie die Platte mit demselben Medium einmal vorsichtig aus. Übertragen Sie dann die Subpopulation der schwimmenden Suspensionsleukämiezellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Um die phasenhelle Tumorsubpopulation zu ernten, geben Sie 10 Milliliter frisches Medium zurück auf die Co-Kulturplatte

und spülen Sie etwa fünfmal kräftig genug, um die adhärenten leukämischen Zellen zu entfernen, ohne die adhärente Zellmonoschicht zu entfernen. Übertragen Sie dann die phasenhelle Subpopulation in ein eigenes konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Um die Phase-Dim-Tumorsubpopulation zu gewinnen, entfernen Sie das restliche Medium mit einer PBS-Spülung von einem Milliliter und lösen Sie die Zellen mit drei Millilitern Trypsin bei 37 Grad Celsius.

Nach fünf Minuten klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten der Platte, um die anhaftenden Zellen zu entfernen, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter FBS, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Spülen Sie dann das Serum drei- bis fünfmal aus, um alle großen Zellaggregate aufzubrechen, und übertragen Sie die ungereinigte Phase-Dim-Subpopulation in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn alle Subpopulationen gesammelt wurden, schleudern Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie jedes der Pellets in einem Milliliter vorgewärmtem Medium.