Bewertung der Wirksamkeit der Krebsmedikament Sensibilisierung In-vitro- Und In-vivo-

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Wirksamkeit der Sensibilisierung von Krebsmedikamenten durch Messung von Veränderungen des Zellstoffwechsels in vitro und der Metastasierungshäufigkeit in vivo zu bewerten. Dies wird erreicht, indem Krebszellen zunächst in vitro mit Antisense-Molekülen durchtrennt werden, um das gewünschte Ziel auszuschalten. Anschließend werden die transfizierten Zellen auf Biosensor-Chips plattiert und in ein Stoffwechselmesssystem geladen, um Veränderungen der Versauerung, der Atmung und der Adhäsion während der medikamentösen Behandlung aufzulisten.

Unabhängig davon werden transfizierte Zellen mit einem Medikament behandelt und in den venösen Kreislauf eines Hühnerembryos injiziert, um die Auswirkungen auf die Metastasierungshäufigkeit zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen eine Sensibilisierung von Krebsmedikamenten, die durch Veränderungen im Zellstoffwechsel und in der Metastasierungshäufigkeit veranschaulicht wird. Diese Technik erweitert die Entwicklung der Krebstherapie, da sie die gleichzeitige Bewertung von Parametern ermöglicht, die bei der herkömmlichen präklinischen Erprobung von Wirkstoffzielen oder -verbindungen nicht immer berücksichtigt werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in neuartige Wirkstoffziele geben kann, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, kann sie auch zur Zielvalidierung in anderen Systemen wie der Zellzykluskontrolle eingesetzt werden. Nach der Durchtrennung von Tumorzellen mit Antisense-Oligonukleotiden gemäß dem Textprotokoll in einer sterilen Umgebung verwenden Sie 400 Mikroliter PBS, um sechs Biosensor-Chips sorgfältig zu waschen Um die Chips zu sterilisieren, entfernen Sie das PBS und fügen Sie 400 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu Inkubieren Sie 20 Minuten lang, bevor Sie PBS verwenden, um die Chips dreimal zu waschen. Jeweils drei Chips werden in sterile Kulturschalen gelegt, mit der Bezeichnung "Kontrolle" und "Target of Interest" beschriftet, und zwei 50-Milliliter-Röhrchen auf ähnliche Weise beschriftet.

Verwenden Sie anschließend PBS, um die transfizierten Zellen zu waschen, bevor Sie ein entsprechendes Volumen von 0,25 % Trypsin-EDTA hinzufügen, warten Sie, bis sich die Monoschicht ablöst, und übertragen Sie die Zellsuspension in das entsprechende Röhrchen. Nach dem Zählen der Zellen wird das Volumen so angepasst, dass eine Endkonzentration von 6,0 mal 10 bis zur fünften Zellen pro Milliliter erreicht wird, indem Sie entweder Medium hinzufügen oder die Zellen konzentrieren. Bereiten Sie jeweils eine Gruppe vor und fügen Sie jedem Biosensorchip 250 Mikroliter Zelllösung hinzu.

Stellen Sie die sterilen Schalen mit den Chips in eine Feuchtigkeitskammer, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht, um Stoffwechselmessungen gemäß der experimentellen Beschreibung durchzuführen, die auf dem Etikett des Textprotokolls beschrieben ist. 1450 Milliliter Röhrchen und fügen Sie 50 Milliliter Wachstum, Medium plus 0,2 % FBS und ein x Penicillin und Streptomycin hinzu. Oder PS. Legen Sie sechs Röhrchen in ein Stoffwechselmesssystem, sechs Röhrchengestelle in ein anderes und das restliche Röhrchen in ein drittes Röhrchengestell, das ebenfalls Röhrchen mit Cisplatin enthält. Verwenden Sie eine luftdurchlässige Membran, um die ersten beiden Racks abzudichten, um eine Verdunstung zu verhindern.

Bereiten Sie als Nächstes ein geeignetes Volumen von sechs mikromolaren Cisplatin in Medium mit 0,2 % FBS und einem XPS vor. Geben Sie das erforderliche Volumen des Mediums in vier beschriftete 50-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie sie wieder in die vier Schlitze des dritten Racks für das Stoffwechselmessröhrchen ein. Verwenden Sie eine luftdurchlässige Membran, um die Rohre abzudichten.

Beschriften Sie sechs 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie jeweils 20 Milliliter zu 0,1 %iger Triton X-Lösung hinzu. In Medium legt die Triton X-Lösung alle verbleibenden Zellen und liefert einen Nullwert für jeden Chip. Legen Sie die Röhrchen in ein viertes Röhrchengestell und verschließen Sie sie. Laden Sie dann die Chips in die Bio-Module.

Laden Sie die beiden Bracks in die beiden Brackhalter und starten Sie dann das Experiment. Nach der Präparation von Hühnerembryonen, wie im Textprotokoll beschrieben, am zweiten Tag der Zelltransfektion sind die Kontroll- und Zielinteressengruppen in zwei Kolben für das Vehikel und zwei für Cisplatin zu unterteilen. Aspirieren Sie das Medium und verwenden Sie entweder drei Milliliter frisches, mittleres oder mittleres Medium mit sechs mikromolaren Cisplatin zum Auffüllen.

Die Kolben inkubieren sechs Stunden lang. Nach der Inkubation aspirieren Sie das Medium, waschen und tryps anisieren die Zellen, überführen die Zellsuspension in vier entsprechend gekennzeichnete 15-Milliliter-Röhrchen, bevor Sie die Zellen schleudern und mit PBS dreimal waschen. Und dann nach der Zählung verwenden Sie PBS zum Verdünnen oder Zentrifugieren, um die Zellen auf eine Endkonzentration von 1,0 mal 10 bis zum sechsten Zellen pro Milliliter zu konzentrieren.

Die Zellsuspension in fünf Milliliter-Röhrchen überführen, die für die Injektion gekennzeichnet sind, und auf Eis legen. Als nächstes legen Sie 24 9 Tage alte Hühnerembryonen für die Injektion unter einem Stereomikroskop beiseite und verwenden Sie eine Glasnadel, die an einem flexiblen Schlauch befestigt ist, der mit einer langsamen pulsierenden Bewegung mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist. Injizieren Sie 1,0 mal 10 bis die fünften Zellen in einem Volumen von 100 Mikrolitern mit einem weichen Tuch in den venösen Kreislauf der Choal-Toic-Membran oder des Cams.

Tupfen Sie die Injektionsstelle vorsichtig ab, um den Blutfluss zu stoppen und verschüttete Schleudern zu absorbieren. Beschriften Sie jeden Embryobehälter nach jeder Injektion unter einem Fluoreszenzmikroskop entsprechend. Bestätigen Sie das Vorhandensein und die Verteilung von Fluoreszenzzellen im Gefäßsystem der Cam.

Achten Sie auf Embryonen, bei denen die Anzahl der Tumorzellen gering oder die Verteilung schlecht erscheint. Schließlich legen Sie die Hühnerembryonen in eine Feuchtigkeitskammer und inkubieren sie sieben bis neun Tage lang, bevor Sie Metastasierungsherde aufzählen, wie im Textprotokoll beschrieben, wie hier gezeigt. Nach 24 Stunden zeigten 5 bis 49 Lungenkrebszellen, die mit BRCA zwei behandelt wurden, die auf eine SO und Cisplatin abzielten, eine frühe und irreversible Abnahme der Atmung im Vergleich zu Zellen, die Kontroll-SO und Cisplatin allein erhielten. Die Abnahme um 39 % im Vergleich zu den mit Kontrollzellen behandelten Zellen begann etwa 10 Stunden vor einem nachweisbaren Abfall der Zelladhäsion, was darauf hindeutet, dass sie unabhängig von Veränderungen der Zellzahl auftrat und dass es sich um ein prägendes Ereignis handeln könnte, das dem Zelltod vorausgeht, wie hier gezeigt.

Während des 72-stündigen Experiments wurde kein Unterschied in der Ansäuerung beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit BRCA two, a SO und Cisplatin wenig bis gar keinen Einfluss auf den Glukosestoffwechsel hatte. In diesem Experiment wurden humane A 5 49 Lungenkrebszellen mit der Kontrolle a SO oder BRCA zwei A SO in Gegenwart oder Abwesenheit von Cisplatin behandelt und in den venösen Kreislauf der Cam injiziert. Neun Tage später wiesen Zellen, die mit BRCA two a SO und Cisplatin behandelt wurden, eine um 77 % geringere Häufigkeit von Metastasierungsherden auf als Zellen, die mit Kontroll-a-SO und Cisplatin oder BRCA two A SSO allein behandelt wurden, was darauf hindeutet, dass die Behandlung mit BRCA two a SO und Cisplatin das Potenzial hat, die Metastasierungslast bei Patienten mit soliden Tumoren zu verringern oder zu verhindern.

Im Anschluss an dieses Verfahren können traditionellere Methoden wie Zellproliferation, Assays und In-vivo-Xenotransplantatstudien durchgeführt werden, um den Beitrag eines bestimmten Ziels zur erhöhten Arzneimittelempfindlichkeit weiter zu untersuchen.