Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Reinigung von endodermalen Zellen, die aus humanen embryonalen Stamm- oder ES-Zellen erzeugt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellen zur endodermalen Differenzierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nach der Entnahme undifferenzierter Zellen eine reine Endodermzellpopulation erhalten werden kann.

Beschichten Sie vor Beginn des Eingriffs sechs Well-Zellkulturplatten mit einem Milliliter Basalmembranmatrix pro Well. Mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur erhitzen. Um dann die menschlichen ES-Zellen zu ernten, aspirieren Sie das Medium aus einer 80 bis 90 % konfluenten menschlichen embryonalen Stammzellkultur mit einer sterilen Pasture-Glaspipette.

Und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS pro Vertiefung. Schütteln Sie die Platte und saugen Sie die Kochsalzlösung ab, um die abgestorbenen Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Als nächstes dissoziieren Sie die Zellcluster vorsichtig mit einem Milliliter enzymfreiem Reagenz für die Passagelösung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Spaltung in kleinere Cluster zeigen.

Geben Sie nach etwa sieben Minuten einen Milliliter DMMF12 Medium in die Vertiefungen. Und pipettieren Sie einige Male mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf und ab, um die restlichen Zellaggregate in eine einzelne Zellsuspension zu lösen. Übertragen Sie die Zellen mit derselben Pipette in ein Zentrifugationsröhrchen und spülen Sie die Vertiefungen mit einem Milliliter frischem DMMF12-Medium, wobei Sie die Spülungen im Röhrchen sammeln.

Nachdem Sie die Zellen heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern ES-Zellkulturmedium, das mit einem ROCK-Inhibitor ergänzt ist. Zählen Sie die Zellen und den Samen 1,5:4 mal 10 bis zur fünften Zellen pro Vertiefung auf den mit Basalmembranmatrix beschichteten Platten in Kulturmedium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt wurde, um Apoptose zu verhindern. Inkubieren Sie die Zellen für ca. 24 Stunden.

Verwenden Sie dann eine sterile Pasteurpipette aus Glas, um das Medium in jeder Vertiefung durch 2 Milliliter primitives Streifeninduktionsmedium zu ersetzen. Ersetzen Sie nach weiteren 24 Stunden Kultur das Medium durch das Endoderm-Induktionsmedium für eine 48-stündige Inkubation mit täglichem Mediumwechsel. Am letzten Tag der Kultur und mindestens eine Stunde vor der Entnahme der Zellen ist frischer ROCK-Inhibitor in das Kulturmedium zu geben.

Verwenden Sie dann eine sterile Pasteurpipette aus Glas, um das Medium aus jeder der Vertiefungen zu aspirieren, und dissoziieren Sie die Zellen mit einem enzymfreien Reagenz der Passaging-Lösung, wie gerade gezeigt. Wenn eine einzellige Suspension erreicht wurde, werden die Zellen gezählt und zentrifugiert. Stellen Sie sicher, dass ab diesem Zeitpunkt alle Medien und Puffer den ROCK-Inhibitor enthalten, um ein Absterben der Zellen zu verhindern.

Andernfalls werden sie nach dem Zurückweichen nicht richtig befestigt. Das Pellet in 100 Mikrolitern PEB-Puffer, ergänzt mit ROCK-Inhibitor pro 1 mal 10 bis zu den siebten Zellen, resuspendieren. Geben Sie dann CXCR4 APC-Antikörper zu den Zellen.

Schnippen Sie vorsichtig mit der Tube, um zu mischen. Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten bei 4 Grad Celsius in ein bis zwei Millilitern PEB-Puffer und verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette aus Glas, um den Überstand abzusaugen. Suspendieren Sie das Pellet in 80 Mikrolitern PEB-Puffer pro 1 mal 10 in die siebten Zellen und fügen Sie den Zellen 20 Mikroliter Anti-APC-Mikrokügelchen hinzu.

Mischen Sie die Probe mit leichtem Schnippen. Dann inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit ein bis zwei Millilitern PEB-Puffer, der mit ROCK-Inhibitor ergänzt ist.

Und suspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem PEB-Puffer plus Inhibitor. Um die CXCR4+-Zellen durch magnetische Bead-Trennung zu isolieren, laden Sie eine mittelgroße magnetische Säule auf einen Magneten geeigneter Größe und spülen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor vor. Wenn die gesamte Wäsche von der Oberseite der Säule abgeflossen ist, tragen Sie das gesamte mit der magnetischen Perle beschriftete Zellvolumen auf die Säule auf und sammeln Sie den Durchfluss in einem konischen Rohr.

Waschen Sie die Säule mit drei Anwendungen von 500 Mikrolitern PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor. Übertragen Sie dann die Säule vom Magneten in ein geeignetes Auffangröhrchen. Und tauchen Sie einen Milliliter PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor durch die Säule, um die CXCR4+-Zellen zu sammeln.

Optional können alle Durchflussproben separat entnommen werden, und 20 Mikroliter-Aliquote aus jeder Probe können verwendet werden, um den Prozentsatz der CXCR4+-Zellen in jeder Alouette durch Durchflusszytometrie zu bestimmen. Dieser Vorgang kann mit dem ersten Durchfluss wiederholt werden, um Zellen zu sammeln, die nicht an die Säule gebunden sind. Anschließend werden beide CXCR4+-Proben gepoolt und zentrifugiert.

Zum Schluss wird das Pellet in einem Milliliter Endoderm-Induktionsmedium, das mit einem ROCK-Inhibitor ergänzt ist, erneut suspendiert und die Zellen in einem mit Basalmembranmatrix beschichteten Zellkulturbehälter in der entsprechenden Dichte ausgesät. Vor ihrer Differenzierung exprimieren humane ES-Zellen hohe Spiegel des Pluripotenzmarkers SOX2. Während der definitive Endodermmarker, FOXA2, nicht nachgewiesen wird.

Bei der Differenzierung verändern die ES-Zellen drastische Veränderungen in ihrer Gen- und Proteinexpression. Tatsächlich werden SOX17 und FOXA2 nach vier Tagen im Differenzierungsmedium gleichmäßig in den Zellkernen vieler der ehemaligen ES-Zellen koexprimiert, ein Kennzeichen für die definitive Bindung des Endoderms. Einige Zellen widersetzen sich dem Differenzierungsprozess und exprimieren keines der beiden Markerproteine.

Und in der Tat behalten sie ihre Pluripotenzmarker-SOX2-Expression bei. In diesem repräsentativen Experiment exprimierten am dritten Tag der Differenzierung fast 60 % der geernteten ES-Zellen CXCR4, dessen Reinheit nach magnetischer Perlensortierung der pluripotenten und anderer unerwünschter Zellen auf über 85 % angereichert wurde. Nach dem Aussäen der gereinigten CXCR4+-Zellen werden nur wenige SOX2+-Zellen nachgewiesen, wobei die Mehrheit der ausgesäten Zellen FOXA2 exprimiert.

Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere wie Immunhistochemie oder QPCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Differenzierungsprozess zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Endodermzellen durch magnetische Perlensortierung reinigt.