Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, aus humanen embryonalen Stamm- oder ES-Zellen erzeugte endodermale Zellen zu reinigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellenforschung zur endodermalen Differenzierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass nach der Entfernung undifferenzierter Zellen eine reine Population endodermaler Zellen erhalten werden kann.

Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, beschichten Sie sechs-Well-Zellkulturgefäße mit je einem Milliliter Basalmembran-Matrix pro Vertiefung. Belassen Sie diese mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um die humanen ES-Zellen zu gewinnen, saugen Sie anschließend das Medium aus einer 80 bis 90 % konfluenten Kultur humaner embryonaler Stammzellen mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette ab.

Und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS pro Vertiefung. Schütteln Sie die Platte und aspirieren Sie die Salzlösung, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Danach lösen Sie vorsichtig die Zellklumpen mit einem Milliliter enzymfreier Passagierungsreagenzlösung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf, bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Auflösung in kleinere Klumpen zeigen.

Nach etwa sieben Minuten ein Milliliter DMMF12-Medium in die Vertiefungen geben. Mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf- und abpipettieren, um die verbleibenden Zellaggregate in eine Einzelzell-Suspension zu lösen. Mit derselben Pipette die Zellen in ein Zentrifigierrohr überführen und die Vertiefungen mit einem Milliliter frischem DMMF12-Medium ausspülen, wobei die Spülansätze im selben Rohr gesammelt werden.

Nachdem die Zellen abgeschleudert wurden, das Pellet in fünf Milliliter ES-Zellkulturmedium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, resuspendieren. Die Zellen zählen und 1,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung auf mit basement membrane matrix beschichteten Platten in Kulturmedium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, ansäen, um Apoptose zu verhindern. Die Zellen für etwa 24 Stunden inkubieren.

Verwenden Sie dann eine sterile, gläserne Pasteur-Pipette, um das Medium in jedem Well durch 2 Milliliter Primitivstreifen-Induktionsmedium zu ersetzen. Nach weiteren 24 Stunden Kultivierung ersetzen Sie das Medium durch Endoderm-Induktionsmedium und inkubieren für 48 Stunden mit täglichen Mediumwechseln. Am letzten Kultivierungstag und mindestens eine Stunde vor der Zellgewinnung geben Sie frischen ROCK-Inhibitor zum Kulturmedium hinzu.

Verwenden Sie anschließend eine sterile, gläserne Pasteurpipette, um das Medium aus jedem der Wells zu aspirieren, und lösen Sie die Zellen wie zuvor gezeigt mit einer enzymfreien Passagierungslösung auf. Sobald eine Einzelzell-Suspension erreicht ist, zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie. Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass das Medium und alle Puffer den ROCK-Inhibitor enthalten, um das Absterben der Zellen zu verhindern.

Andernfalls werden sie nach dem Zurückziehen nicht richtig angeheftet. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern PEB-Puffer, ergänzt mit ROCK-Inhibitor pro 1 × 10⁷ Zellen. Fügen Sie dann CXCR4-APC-Antikörper zu den Zellen hinzu.

Vorsichtiges Schwenken des Röhrchens zur Mischung. Nach 15 Minuten bei 4 Grad Celsius die Zellen in ein bis zwei Milliliter PEB-Puffer waschen und mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette das Überstandsvolumen abpipettieren. Den Pellet in 80 Mikroliter PEB-Puffer pro 1 × 10⁷ Zellen resuspendieren und 20 Mikroliter Anti-APC-Mikroperlen zu den Zellen hinzufügen.

Mischen Sie die Probe vorsichtig durch leichtes Anflicken. Anschließend inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit ein bis zwei Milliliter PEB-Puffer, der mit ROCK-Inhibitor angereichert ist.

Und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikroliter frischem PEB-Puffer mit Inhibitor. Um die CXCR4+-Zellen durch magnetische Bead-Trennung zu isolieren, setzen Sie eine mittelgroße magnetische Säule auf einen passenden Magneten und spülen die Säule vorab mit 500 Mikroliter PEB-Puffer mit ROCK-Inhibitor. Sobald die gesamte Waschpufferlösung aus dem oberen Teil der Säule abgelaufen ist, geben Sie das gesamte mit magnetischen Beads markierte Zellvolumen auf die Säule und sammeln das Durchflussvolumen in einem kegelförmigen Reagenzglas.

Spülen Sie die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor. Danach überführen Sie die Säule vom Magneten in ein geeignetes Sammelröhrchen. Und pressen Sie ein Milliliter PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor durch die Säule, um die CXCR4+-Zellen zu sammeln.

Optional können alle Durchlaufproben getrennt gesammelt und 20 µL-Aliquote aus jeder Probe verwendet werden, um den Prozentsatz der CXCR4+-Zellen in jedem Aliquot mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen. Dieses Verfahren kann mit dem ersten Durchlauf wiederholt werden, um Zellen zu sammeln, die nicht an die Säule gebunden haben. Anschließend werden beide gesammelten CXCR4+-Proben vereinigt und zentrifugiert.

Schließlich das Pellet in einem Milliliter Endoderm-Induktionsmedium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt ist, resuspendieren und die Zellen mit der geeigneten Dichte in einem mit einer Basalmembran-Matrix beschichteten Zellkulturbehälter aussäen. Vor ihrer Differenzierung exprimieren humane ES-Zellen hohe Mengen des Pluripotenz-Markers SOX2, während der Marker für definitives Endoderm, FOXA2, nicht nachweisbar ist.

Nach der Differenzierung durchlaufen die ES-Zellen drastische Veränderungen in der Gen- und Proteinausprägung. Tatsächlich werden nach vier Tagen in Differenzierungsmedium SOX17 und FOXA2 einheitlich im Kern vieler ehemaliger ES-Zellen gemeinsam exprimiert, ein Kennzeichen der Verpflichtung zum definitiven Endoderm. Einige Zellen widerstehen dem Differenzierungsprozess und exprimieren keines der beiden Markerproteine.

Und tatsächlich behalten sie die Expression des Pluripotenzmarkers SOX2 bei. In diesem repräsentativen Experiment exprimierte am dritten Tag der Differenzierung nahezu 60 % der gewonnenen ES-Zellen CXCR4, deren Reinheit nach der magnetischen Bead-Aufreinigung der pluripotenten und anderer unerwünschter Linienzellen auf über 85 % angereichert wurde. Nach der Aussaat der gereinigten CXCR4+-Zellen werden nur wenige SOX2+-Zellen nachgewiesen, während der Großteil der ausgesäten Zellen FOXA2 exprimiert.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere ähnliche Methoden wie die immunhistochemische Färbung oder die qPCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zum Differenzierungsprozess zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Endodermzellen mittels magnetischer Zellaufreinigung angereichert werden können.