Name: Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen aus humanen embryonalen Stammzellen mittels magnetischer Bead-Sortierung. Diese Technik ermöglicht reine Zellpopulationen für die Stammzellforschung.

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1. Differenzierung humaner ESC in Richtung Definitive Endoderm <ol><li> Kultivieren humaner embryonaler Stammzellen ( ES- Zellen) in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Mantel ein neues 6-Well-Zellkulturplatte mit 1 ml einer Basalmembranmatrix und brüten die Kultur-ware für mindestens 30 min bei RT. Für spezielle Informationen wenden Sie sich an die Anweisungen des jeweiligen Herstellers. </li><li> Bestätigen Sie, dass die kultivierten menschlichen WSR 80% -90% Konfluenz unter dem Mikroskop erreicht haben eine geringe Vergrößerung (zB, 4X). Anzusaugen, das Medium aus den Hohlräumen durch das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette Absaugen. Waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Lösung. Dazu werden 2 ml PBS in jede Vertiefung sanft die Platte schütteln und die Lösung absaugen, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> 1 ml der enzymfreien Passagierung Lösung Reagenz für sanfte Dissoziation von Zellclustern. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C eind 5% CO 2 , bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Störung in kleinen Clustern zeigen. HINWEIS: Die Inkubationszeit auf dem Reagenz hängt verwendet. Für die enzymfreie Passagierbarkeit Lösung in dem Materialien Abschnitt erwähnt, ist die Inkubationszeit etwa 7 min. </li><li> 1 ml DMEM / F-12-Medium und stören die verbleibenden Zellaggregate in einzelne Zellen durch Pipettieren nach oben und unten eine 1 ml Pipettenspitze. Verwenden, die Zellen von der Oberfläche zu spülen und die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. Um alle Zellen abrufen, waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM / F-12-Medium und fügen Sie das Medium zu dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in 5 ml ES-Zellkulturmedium 10 uM Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor enthält. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer und Samen 150.000 - 400.000 Zellen pro 6-well oder in einem anderen Plattenlayout, abhängig von der ES-Zelllinie verwendet. Verwenden culture - Medium , das 10 uM ROCK Inhibitor der Apoptose und Kultur der Zellen in einem Inkubator zu vermeiden , bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Etwa 24 Stunden nach der absaugen das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette Säen und 2 ml Primitivstreifen Induktionsmedium. Hinweis: Dieses Medium enthält Endkonzentrationen von 1% Glutamin, 0,2% FCS, 5 uM CHIR-99021 und 50 ng / ml Activin A in Advanced RPMI-1640 - Medium. Üblicherweise verwenden 2 ml Medium für den Anbau in 6-Well-Platten. </li><li> 48 Stunden nach dem Aussäen, ersetzen Sie das Medium Induktionsmedium zu Entoderm. Pflegen Sie die Zellen in diesem Medium für weitere 48 Stunden mit täglicher Mediumwechsel. HINWEIS: Dieses Medium enthält 1% Glutamin, 0,2% FCS und 50 ng / ml Activin A in Advanced RPMI-1640 - Medium. Die Zellen, die in Richtung der endgültigen endoderm begangen werden, um die Oberflächenmarker CXCR4 exprimieren. Die Färbung von CXCR4 kann verwendet werden, um die Anzahl der DE-determinierten Zellen zu quantifizieren. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Anfärben von CXCR4 + Definitive Entodermzellen für die Durchflusszytometrie-Analyse <ol><li> Für den letzten 24 Stunden, aber mindestens 1 Stunde vor der Ernte die Zellen werden 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor zu dem Kulturmedium. </li><li> Bestreichen Sie die Zellkultur-ware, die zur Wiederverwendung Impfen mit einer Basalmembranmatrix verwendet werden, das heißt, 12-Well - Platten für die qPCR - Analyse oder eine Kammer Dias für Immunfluoreszenzanfärbung. Inkubieren der Platten oder Folien für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Anzusaugen, das Medium mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette aus den Vertiefungen der differenzierten Zellen verwendet zum Färben und / oder sortiert werden. </li><li> 1 ml enzymfreien Passagierung Lösung Reagens zur schonenden Spaltung von Zellclustern. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 , bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Störung in kleinen Clustern zeigen. HINWEIS: Die Inkubationszeit auf dem Reagenz hängt verwendet. Für die enzymfreien Passagierung Lösung im Materi erwähntals Abschnitt, ist die Inkubationszeit etwa 7 min. </li><li> 1 ml DMEM / F-12-Medium und stören verbleibenden Zellaggregate in einzelne Zellen durch Pipettieren nach oben und unten eine 1 ml-Spitze mit. Verwenden, die Zellen von der Oberfläche zu spülen und die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. Um alle Zellen abrufen, waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml DMEM / F-12-Medium w / o FCS und fügen Sie das Medium zu dem Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. Zellen von drei Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen in 10-15 x 10 6 Zellen nach drei Tagen der Differenzierung führen. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g. HINWEIS: Die genaue Zahl der erhaltenen Zellen wird auf der pluripotenten Zelllinie für die Differenzierung verwendet abhängen. </li><li> Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellen in PEB-Puffer 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor enthält. Verwenden von 100 &amp; mgr; l dieses Puffers für bis zu 10 7 Zellen. Fügen Sie die 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor am Tag der staining. Verwenden Sie diesen Puffer für alle Downstream-Anwendungen (bezeichnet als PEB-Puffer + RI). HINWEIS: PEB - Puffer 0,5% BSA und 2 mM EDTA in PBS enthält. Wenn mehr Zellen werden gefärbt sind, justieren Sie entsprechend den Puffervolumen. </li><li> In 10 ul eines CXCR4-APC - Antikörper pro 10 7 Zellen in 100 &amp; mgr; l, das entspricht etwa einer Verdünnung von 1:10. HINWEIS: Die Verwendung eines APC-verknüpften Antikörper ist nicht zwingend. Stattdessen kann es verwendet in Abhängigkeit von den Mikrokugeln ersetzt werden. Wenn mehr Zellen entsprechend den Antikörper Volumen gefärbt werden sind einzustellen. </li><li> Mischen Sie vorsichtig den Schlauch mit den Fingern blätterte und Inkubation bei 4 ° C im Kühlschrank für 15 min. Resuspendieren der Zellen mit 1-2 ml PEB-Puffer. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g. </li><li> Saugen Sie den Überstand mit einer sterilen Pasteur - Glaspipette und Zellpellet in 80 ul PEB pro 10 7 Zellen und fügen Sie 20 ul anti-APC - Mikrokügelchen. HINWEIS: </strong&gt; Wenn mehr Zellen werden gefärbt sind, stellen Sie die Mikroperlen Volumen entsprechend. </li><li> Mischen Sie vorsichtig den Schlauch mit den Fingern blätterte und Inkubation bei 4 ° C im Kühlschrank für 15 min. Resuspendieren der Zellen mit 1-2 ml PEB-Puffer + RI. Zentrifugation der Zellen 5 min bei 300 x g. Absaugen den Puffer. Resuspendieren in 500 ul PEB-Puffer + RI. </li></ol> 3. Magnetische Trennung von CXCR4 + Zellen <ol><li> Legen Sie eine mittlere magnetische Säule in einem Magnetfeld nach Herstellung Anweisungen. Vorspülen der Säule mit 500 ul PEB-Puffer + RI. Tragen Sie die gesamte Zellsuspension auf die Säule. Sammeln Sie die Strömung durch, da nicht alle Zellen an die Säule binden. Achten Sie darauf, nicht die Spalten für eine optimale Wiedergewinnung von CXCR4 + Zellen zu stören. </li><li> Die Säule wird dreimal mit 500 ul PEB-Puffer + RI. Sammeln Sie die erste Strömung durch und kombinieren es mit den gesammelten Zellen aus Schritt 3.1. Entfernen Sie die Magnetsäule aus dem Magnetfeld und legen Sie sie in eingeeignete Sammelröhrchen. 1 ml PEB-Puffer + RI auf die Säule. Zum Eluieren die Zellen drücken Sie fest um den Kolben in die Säule. </li><li> Optional: Sammeln Sie alle Fluss durch Proben getrennt und verwenden 20 ul jeweils die Anzahl der CXCR4 + Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Ihre Zahl sollte mit jedem Waschschritt zurückgehen. HINWEIS: Mindestens 2 x 10 4 lebensfähig, sollte gated Zellen für zuverlässige Ergebnisse gezählt werden. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,3 mit dem gesammelten Strom durch Probe aus Schritt 3.1 und der ersten Strömung durch Probe aus Schritt 3.2 eine neue Spalte. Sie nicht die vorherige Spalte wiederverwenden. Durch die Verwendung der Kolben Luft in die Säule gedrückt werden, es blockier. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. Abhängig von der Effizienz der Differenzierung von bis zu 6 x 10 6 Zellen kann zunächst und noch 1 x 10 6 Zellen sortiert werden , indem eine zweite Spalte bei 10 7 Zellen für das Verfahren. </li&gt; <li> Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 5 min. Absaugen und der Überstand wird mit einer sterilen Pasteur-Glaspipette und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Endoderm Induktionsmedium aus Schritt 1.9 mit zusätzlichen 10 &amp; mgr; M ROCK-Inhibitor. </li><li> Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop eine Zählkammer. Seed die Zellen bei einer geeigneten Dichte, dh ~ 4 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well - Platte (ca. 3,6 cm 2 Fläche) oder ~ 1,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung eines 8-Well - Kammer-Folie. </li></ol> 4. Optional: Analyse von gereinigtem Definitive Endoderm Bevölkerung <ol><li> Für Immunfluoreszenzanfärbung fixieren die gereinigten Zellen aus Schritt 3.7 in etwa 24 Stunden nach der mit 4% Paraformaldehyd und Beize für die endgültige Endoderm (DE) und / oder Pluripotenz Markerproteine ​​Aussaat. HINWEIS: Häufig verwendete DE Marker umfassen FOXA2 und SOX17, häufig verwendete Pluripotenz Marker umfassen OCT3 / 4, NANOG und SOX2 6, 8. </li><li> for RT-qPCR-Analyse, ernten die gereinigten Zellen direkt oder 24 h nach dem Aussäen extrahieren Total-RNA und transkribieren Reverse-cDNA aus den extrahierten Gesamt-RNA-Proben. Verwenden , 10 ng cDNA als Matrize pro RT-qPCR - Reaktion (Triplikaten) 6, um die Expression von DE und Pluripotenz Markergene 8 zu analysieren. HINWEIS: Häufig verwendete Markergene werden in Schritt 4.1 erwähnt. Zyklusbedingungen sind 5 min bei 95 ° C und 40 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Derzeit verwendete Differenzierungsprotokolle ergeben sich selten 100% differenzierte Zellen. Aus Gründen, die noch einige Zellen angesprochen werden müssen widerstehen, den Differenzierungsprozess. Abhängig von der Effizienz der verwendeten Differenzierungsprotokoll und die Neigung des ESC Zeile eine bestimmte Anzahl von Rest pluripotenten Zellen häufig beobachtet werden, selbst nach der Differenzierung in die definitive Entoderm. Diese Restzellen können nachgeschaltete Differenzierungen beeinträchtigen oder weitere An...

Pluripotente Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) haben die Fähigkeit, in nahezu jedem Zelltyp des menschlichen Körpers zu unterscheiden. Somit können in vitro Differenzierungsprotokollen verwendet werden , um zahlreiche adulten Zelltypen wie Kardiomyozyten 1, Hepatozyten 2, beta - Zellen 3, 4 oder Lungenepithelzellen neuronalen Zellen 5 erzeugen. Dies macht WSR ein wertvolles Werkzeug für die mögliche Behandlung von verschiedenen degenerativen Erkrankungen 3. Die in vitro Differenzierung von ES- Zellen gegenüber adulten Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert eine pseudo-Gastrulation in Zellen erinnert an die definitive Endoderm (DE) 6. Da stromabwärts Differenzierung gegenüber den zuvor erwähnten Arten somatischer Zellen wesentlich weniger effizient ist, wird eine optimale Differenzierung Endoderm gilt als geschwindigkeitsbestimmender 7. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie begangen werden laufen characteristic Veränderungen in ihrem Genexpressionsprofil. Pluripotenz Master - Regulator - Gene herunterreguliert, während die Expression von anderen Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA - Familie und der Oberflächenrezeptor CXCR4 hoch 6 hochreguliert wird, 8, 9. CXCR4 bekannt durch SMAD2 zu trans / 3, hinter Nodal / TGF-β - Signalisierung und SOX17 aufgrund der spezifischen Bindungsstellen in seiner Promotorregion 10. Somit ist es ein sehr geeignet in einer Reihe von Berichten verwendet Marker 6, 8, 11-13. Diese Expressions Änderungen spiegelt eine Pseudo-gastrulation Ereignis, bei dem WSR erste Merkmale eines primitiven streifenartige Zellpopulation zu erwerben und anschließend begehen in die endoderm Keimschicht 6. Allerdings sind Differenzierungsprotokolle selten 100% effizient wie wenige Zellen den Differenzierungsprozess widerstehen kann oder Differenzierung gegenüber anderen unbeabsichtigten Linien 14. Diese Zellen können sich negativ auf Influence weitere Differenzierung. Darüber hinaus bergen Rest undifferenzierten Zellen große Risiken für spätere Experimente Transplantation und kann zu teratomas 15-17 geben. So entfernen Sie können diese unerwünschten Zellen früh auf den Oberflächenmarker CXCR4 zur Reinigung von Zellen verwendet werden , die in Richtung der DE 18 verpflichtet sind. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die positive Selektion von CXCR4 + -Zellen aus DE Differenzierungskulturen. Hierzu wird die Oberflächenmarker CXCR4 durch einen Antikörper gebunden, der dann wiederum mit magnetischen Microbeads bindet. Im Gegensatz zu den harten Bedingungen während FACS-Sortierung, die magnetisch markierten DE-ähnlichen Zellen können dann leicht in einem Benchtop-Format gereinigt werden, um eine sanfte Reinigungsverfahren verwendet wird. Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode zur Entfernung von Zellpopulationen, die die DE Differenzierungsprozess widerstanden.

<table><tbody><tr><td>Hues8 humane embryonale Stammzelllinie</td><td>Harvard Department of stem cell & regenerative</td><td></td> biology <td>Geeignete Zelllinie für die Endodermgenerierung</td></tr><tr><td>Hes3 humane embryonale Stammzelllinie</td><td>ES Cell International</td><td></td><td>Geeignete und robuste Zelllinie für die Endodermgenerierung</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td>ESC Kulturmedium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1860</td><td></td></tr><tr><td>Advanced RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>CD184 (CXCR4)-APC, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-357</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC</td><td>MicroBeads Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Magnetfeld</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1049</td><td>ROCK-Inhibitor</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für sanfte Zelldissoziation</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>Enzymfrei Passaging-Lösung, alternativ: Trypsin/EDTA</td></tr><tr><td>Matrigel*</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Basalmembranmatrix * lösen und in Aliquoten bei -80 &° lagern; C wie im Lieferantenhandbuch beschrieben. Nach Gebrauch auf Eis auftauen, in 25 ml eiskaltem Knockout-Knockout DMEM/F-12 verdünnen. 1 ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und 45 min bei Raumtemperatur inkubieren. Das Matrigel entfernen und sofort verwenden. </td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>30-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Mensch FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga</td><td>Life Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mensch FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt</td><td>Leben Technologien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOX17 TaqMan Assay</td><td>Angewandte Biosysteme</td><td>Hs00751752_s1</td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human POU5F1 REV ctgcagtgggtgtttcgggca</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t </td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FOXA2</td><td>MerckMillipore</td><td>07-633</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td></td></tr></tbody></table>

eine schnelle und effiziente methode zur reinigung von entodermzellen generiert aus humanen embryonalen stammzellen

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

Die Differenzierung Fähigkeiten von pluripotenten Stammzellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) ermöglichen eine mögliche therapeutische Anwendung für Zell-Ersatz-Therapien. Ausdifferenzierten Zelltypen könnten für die Behandlung von verschiedenen degenerativen Krankheiten verwendet werden. In vitro Differenzierung dieser Zellen gegenüber Geweben der Lunge, der Leber und der Bauchspeicheldrüse erfordert als ersten Schritt die Erzeugung von endgültigen endodermalen Zellen. Dieser Schritt ist geschwindigkeitsbestimmend für die weitere Differenzierung zu endständig gereiften Zelltypen, wie beispielsweise Insulin-produzierenden Beta-Zellen, Hepatozyten oder anderen Endoderm-abgeleiteten Zelltypen. Die Zellen, die in Richtung der endoderm Linie verpflichtet sind ausdrücken sehr eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren wie FOXA2, SOX17, HNF1B, die Mitglieder der GATA-Familie, und der Oberflächenrezeptor CXCR4. Allerdings Differenzierungsprotokolle sind selten 100% effizient. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung eines CXCR4 + Zellpopulation nach der Differenzierungin der DE durch magnetische Mikrokugeln verwendet. Diese Reinigung entfernt zusätzlich Zellen von unerwünschten Linien. Die sanfte Reinigungsverfahren ist schnell und zuverlässig und kann verwendet werden, Downstream-Anwendungen und Differenzierungen zu verbessern.

Bei der Differenzierung WSR laufen drastischen Veränderungen in der Gen und Proteinexpression. Figur 1 typische Markergene darstellt , die verwendet werden können , eine erfolgreiche Endoderm Differenzierung zu verifizieren. Prime Ziele für eine Genexpressionsanalyse sind GSC, FOXA2 und SOX17. In einer relativen Analyse der Genexpression insbesondere FOXA2 und SOX17 erhöht von&gt; 2.000 - fache , wenn sie un...

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, aus humanen embryonalen Stamm- oder ES-Zellen erzeugte endodermale Zellen zu reinigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stammzellenforschung zur endodermalen Differenzierung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass nach der Entfernung undifferenzierter Zellen eine reine Population endodermaler Zellen erhalten werden kann.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, beschichten Sie sechs-Well-Zellkulturgefäße mit je einem Milliliter Basalmembran-Matrix pro Vertiefung. Belassen Sie diese mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Um die humanen ES-Zellen zu gewinnen, saugen Sie anschließend das Medium aus einer 80 bis 90 % konfluenten Kultur humaner embryonaler Stammzellen mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette ab.Und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern PBS pro Vertiefung. Schütteln Sie die Platte und aspirieren Sie die Salzlösung, um tote Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Danach lösen Sie vorsichtig die Zellklumpen mit einem Milliliter enzymfreier Passagierungsreagenzlösung bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf, bis die Zellen deutliche Anzeichen einer Auflösung in kleinere Klumpen zeigen.Nach etwa sieben Minuten ein Milliliter DMMF12-Medium in die Vertiefungen geben. Mehrmals mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf- und abpipettieren, um die verbleibenden Zellaggregate in eine Einzelzell-Suspension zu lösen. Mit derselben Pipette die Zellen in ein Zentrifigierrohr überführen und die Vertiefungen mit einem Milliliter frischem DMMF12-Medium ausspülen, wobei die Spülansätze im selben Rohr gesammelt werden.Nachdem die Zellen abgeschleudert wurden, das Pellet in fünf Milliliter ES-Zellkulturmedium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, resuspendieren. Die Zellen zählen und 1,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung auf mit basement membrane matrix beschichteten Platten in Kulturmedium, ergänzt mit ROCK-Inhibitor, ansäen, um Apoptose zu verhindern. Die Zellen für etwa 24 Stunden inkubieren.Verwenden Sie dann eine sterile, gläserne Pasteur-Pipette, um das Medium in jedem Well durch 2 Milliliter Primitivstreifen-Induktionsmedium zu ersetzen. Nach weiteren 24 Stunden Kultivierung ersetzen Sie das Medium durch Endoderm-Induktionsmedium und inkubieren für 48 Stunden mit täglichen Mediumwechseln. Am letzten Kultivierungstag und mindestens eine Stunde vor der Zellgewinnung geben Sie frischen ROCK-Inhibitor zum Kulturmedium hinzu.Verwenden Sie anschließend eine sterile, gläserne Pasteurpipette, um das Medium aus jedem der Wells zu aspirieren, und lösen Sie die Zellen wie zuvor gezeigt mit einer enzymfreien Passagierungslösung auf. Sobald eine Einzelzell-Suspension erreicht ist, zählen Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie. Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass das Medium und alle Puffer den ROCK-Inhibitor enthalten, um das Absterben der Zellen zu verhindern.Andernfalls werden sie nach dem Zurückziehen nicht richtig angeheftet. Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern PEB-Puffer, ergänzt mit ROCK-Inhibitor pro 1 × 10⁷ Zellen. Fügen Sie dann CXCR4-APC-Antikörper zu den Zellen hinzu.Vorsichtiges Schwenken des Röhrchens zur Mischung. Nach 15 Minuten bei 4 Grad Celsius die Zellen in ein bis zwei Milliliter PEB-Puffer waschen und mit einer sterilen Glas-Pasteurpipette das Überstandsvolumen abpipettieren. Den Pellet in 80 Mikroliter PEB-Puffer pro 1 × 10⁷ Zellen resuspendieren und 20 Mikroliter Anti-APC-Mikroperlen zu den Zellen hinzufügen.Mischen Sie die Probe vorsichtig durch leichtes Anflicken. Anschließend inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen mit ein bis zwei Milliliter PEB-Puffer, der mit ROCK-Inhibitor angereichert ist.Und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikroliter frischem PEB-Puffer mit Inhibitor. Um die CXCR4+-Zellen durch magnetische Bead-Trennung zu isolieren, setzen Sie eine mittelgroße magnetische Säule auf einen passenden Magneten und spülen die Säule vorab mit 500 Mikroliter PEB-Puffer mit ROCK-Inhibitor. Sobald die gesamte Waschpufferlösung aus dem oberen Teil der Säule abgelaufen ist, geben Sie das gesamte mit magnetischen Beads markierte Zellvolumen auf die Säule und sammeln das Durchflussvolumen in einem kegelförmigen Reagenzglas.Spülen Sie die Säule dreimal mit jeweils 500 Mikrolitern PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor. Danach überführen Sie die Säule vom Magneten in ein geeignetes Sammelröhrchen. Und pressen Sie ein Milliliter PEB-Puffer plus ROCK-Inhibitor durch die Säule, um die CXCR4+-Zellen zu sammeln.Optional können alle Durchlaufproben getrennt gesammelt und 20 µL-Aliquote aus jeder Probe verwendet werden, um den Prozentsatz der CXCR4+-Zellen in jedem Aliquot mittels Durchflusszytometrie zu bestimmen. Dieses Verfahren kann mit dem ersten Durchlauf wiederholt werden, um Zellen zu sammeln, die nicht an die Säule gebunden haben. Anschließend werden beide gesammelten CXCR4+-Proben vereinigt und zentrifugiert.Schließlich das Pellet in einem Milliliter Endoderm-Induktionsmedium, das mit ROCK-Inhibitor ergänzt ist, resuspendieren und die Zellen mit der geeigneten Dichte in einem mit einer Basalmembran-Matrix beschichteten Zellkulturbehälter aussäen. Vor ihrer Differenzierung exprimieren humane ES-Zellen hohe Mengen des Pluripotenz-Markers SOX2, während der Marker für definitives Endoderm, FOXA2, nicht nachweisbar ist.Nach der Differenzierung durchlaufen die ES-Zellen drastische Veränderungen in der Gen- und Proteinausprägung. Tatsächlich werden nach vier Tagen in Differenzierungsmedium SOX17 und FOXA2 einheitlich im Kern vieler ehemaliger ES-Zellen gemeinsam exprimiert, ein Kennzeichen der Verpflichtung zum definitiven Endoderm. Einige Zellen widerstehen dem Differenzierungsprozess und exprimieren keines der beiden Markerproteine.Und tatsächlich behalten sie die Expression des Pluripotenzmarkers SOX2 bei. In diesem repräsentativen Experiment exprimierte am dritten Tag der Differenzierung nahezu 60 % der gewonnenen ES-Zellen CXCR4, deren Reinheit nach der magnetischen Bead-Aufreinigung der pluripotenten und anderer unerwünschter Linienzellen auf über 85 % angereichert wurde. Nach der Aussaat der gereinigten CXCR4+-Zellen werden nur wenige SOX2+-Zellen nachgewiesen, während der Großteil der ausgesäten Zellen FOXA2 exprimiert.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können weitere ähnliche Methoden wie die immunhistochemische Färbung oder die qPCR durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zum Differenzierungsprozess zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Endodermzellen mittels magnetischer Zellaufreinigung angereichert werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren...

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Dieser Artikel wird auf die Erzeugung von menschlichen Leber Entoderm aus humanen embryonalen Stammzell-Populationen zu konzentrieren.

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Trotz anhaltender Bemühungen, um den Übergang Kulturen Feeder-freien Bedingungen, bleiben die Ableitung und Kultur von humanen embryonalen Stammzellen (hES) weitgehend abhängig von Co-Kulturen mit embryonalen Feeder (MEF). Hier zeigen wir eine neuartige Methode zur schnellen Beseitigung Zubringer vom hESC Kulturen vor den Experimenten.

Schnelle Fibroblast Entfernung aus High Density humanen embryonalen Stammzellen Kulturen

Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.

Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2

Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hESCs) in funktionelle hepatozytenähnliche Zellen (HLCs) durch kontinuierliche Ergänzung von Activin A und CHIR99021 während der hESC-Differenzierung zu definitivem Endoderm (DE).

Eine effiziente Methode zur gerichteten Hepatozyten-ähnlichen Zellinduktion aus menschlichen embryonalen Stammzellen

Um die Einschränkungen zu vermeiden, die mit der enzymatischen oder mechanischen Passage von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) verbunden sind, die auf Feederzellen kultiviert wurden, haben wir eine schnelle, effektive, kosteneffiziente und ertragreiche Methode zur Gewinnung von hESC- oder hiPSC-Kolonien etabliert, die auf einer Feederzellschicht menschlicher Vorhautfibroblasten gehalten werden, indem wir EDTA-vermittelte...

Schnelle, kostengünstige, enzymfreie Passage von humanen pluripotenten Stammzellen auf Feederzellen durch Ethylendiamintetraessigsäure-vermittelte Disadhäsion

Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.

Generierung natürlicher Killerzellen aus humanen Stammzellen mit erweitertem Potenzial

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von schnellen und reproduzierbaren endodermalen Leberorganoiden (eHEPOs). Mit diesem Protokoll können eHEPOs innerhalb von 2 Wochen hergestellt werden und langfristig (mehr als 1 Jahr) expandieren, ohne ihre Differenzierung und Funktionalität zu verlieren.

Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen aus humanen embryonalen Stammzellen mittels magnetischer Bead-Sortierung. Diese Technik ermöglicht reine Zellpopulationen für die Stammzellforschung.

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

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