Beurteilung der strukturellen Integrität der neuromuskulären Verbindungen des dorsalen Längsmuskels bei Drosophila

Beginnen Sie mit chemisch fixierten Wildtyp- und transgenen Drosophila-Thoracas in einem Puffer.

Bei transgenen thoraken enthalten die neuromuskulären Verbindungen der dorsalen Längsmuskulatur Neuronen, die ein mutiertes Protein exprimieren, das die Neurodegeneration induziert.

Entfernen Sie den Puffer und frieren Sie die Thorsen schockfrosten, um Gewebeschäden während der Bisektionierung zu vermeiden.

Frischen Puffer hinzufügen und die Thorazen in die Sezierschalen geben.

Positionieren Sie einen Thorax mit der Bauchseite nach oben und entfernen Sie die Nervenzellcluster, um die Mittellinie freizulegen.

Halbieren Sie entlang der Mittellinie, um Hemithoraces zu erhalten.

Überschüssiges Gewebe entfernen.

Inkubieren Sie die Hemithoraces in einem Blockierungspuffer, um die Membranen zu permeabilisieren und eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu, die auf ein Glykoprotein abzielen, das in NMJ-Neuronen und Muskelaktinfilamenten exprimiert wird.

Entfernen Sie ungebundene Antikörper.

Ordnen Sie die Hemithoraces auf einem Brückenschlitten an, fügen Sie Einbettmedien hinzu und montieren Sie die Taschentücher.

Visualisieren Sie unter einem Mikroskop.

Im Vergleich zum Wildtyp zeigen die Mutanten eine reduzierte neuronale Färbung, was auf eine Neurodegeneration hinweist, während die Muskeln eine intakte Fluoreszenz aufweisen.

Bevor Sie mit den Bisektionen beginnen, ziehen Sie Kryoschutzhandschuhe und eine Schutzbrille an und füllen Sie einen Dewargefäß mit flüssigem Stickstoff. Verwende einen Klingenbrecher, um eine Federklinge in einem Winkel zu greifen, und biege die Klinge, um ein kleines Stück abzubrechen. Verwenden Sie den Klingenbrecher, um die Klinge in Position zu halten, und verwenden Sie eine Pasteurpipette aus Glas, um das gesamte PBS aus den Probenröhrchen zu entfernen.

Tauchen Sie die Röhrchen mit einer kryogenen Pinzette in den Kolben mit flüssigem Stickstoff. Nach 10 Sekunden geben Sie mit einer Pasteur-Pipette etwa 300 Mikroliter eiskaltes PBS in jedes Röhrchen auf Eis und legen Sie einen Thorax mit der Bauchseite nach oben in eine 10 Zentimeter große, mit Silikonelastomer beschichtete Dissektionsschale, die eiskaltes PBS enthält. Verwende eine stumpfe Pinzette, um den Thorax zu positionieren, und eine feine Pinzette, um einen Teil der Brustganglien zu entfernen, um die Mittellinie des Thorax freizulegen.

Nehmen Sie die Mittellinie des Brustkorbs als Führung, verwenden Sie die Klinge, um einen flachen Schnitt durch ein Drittel des Brustkorbs zu machen, und verwenden Sie die stumpfe Pinzette, um den Brustkorb in einem 45-Grad-Winkel zu positionieren. Schneiden Sie mit der Klinge gerade die Mittellinie des Brustkorbs ab, um zwei Bluthämothorace zu erhalten, und machen Sie vorsichtig ein oder zwei Schnitte, um das überschüssige Gewebe zu entfernen, ohne die dorsalen Längsmuskeln zu beschädigen. Geben Sie dann die Muskelgewebeproben in ein entsprechend beschriftetes Röhrchen mit PBS.

Wenn alle Thoraxproben halbiert wurden, permeabilisieren Sie das Gewebe mindestens eine Stunde lang bei 4 Grad Celsius in einem Blockierungspuffer. Am Ende der Inkubation die frisch zubereitete strukturelle Fleckenlösung vortexen und 150 Mikroliter des Flecks zu jeder Probe für eine zweistündige Inkubation auf einem Rotator bei Raumtemperatur im Dunkeln hinzufügen. Waschen Sie die Proben nach dem Färben in PBST und legen Sie fünf Verstärkungsetiketten gestapelt und in zwei Hälften geschnitten im Abstand von 15 Millilitern auf einen Objektträger mit Glasmikroskop.

Verwenden Sie eine modifizierte Mikropipettenspitze, um die Thorasen auf jeden Objektträger zu übertragen, und verwenden Sie ein Labortuch, um überschüssiges PBST zu entfernen. Ordnen Sie die Proben mit einer Pinzette so an, dass die Brustmuskeln mit der Muskelseite nach oben zeigen. Wenn die Proben richtig ausgerichtet sind, tragen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze 70 Mikroliter Eindeckmedium auf jeden Objektträger auf und bedecken Sie jeden Objektträger mit einem Deckglas. Verwenden Sie dann Nagellack, um die Außenkanten der Deckgläser großzügig zu beschichten, um eine vollständige Abdichtung um jedes Gewebe zu erhalten.