Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Entwicklung eines hocheffizienten und ertragreichen Verfahrens zur Erzeugung von dendritischen Zellen oder DCs, die ihre phänotypische und funktionelle Divergenz in vivo schicksalhaft widerspiegeln. Dendritische Zellen existieren als große Populationen in lymphatischen Organen. Daher verwenden wir Filterliganden, um die Häufigkeit dieser essentiellen Zellen im Spendergewebe zu erhöhen und diese Isolierung zu erleichtern.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Generierung aller DC-Teilmengen in geeigneter Anzahl für die Analyse nur mit den kommerziell erhältlichen Agenten entfernt wird. Um flt-3-Liganden, die B16-Melanomzellen exprimieren, aus einer 90%igen konfluenten Kultur zu gewinnen, waschen Sie die Zellen zunächst mit PBS und inkubieren Sie die Kultur mit 05%Trypsin bei 37 Grad Celsius. Nach 5 Minuten wird die Proteaseaktivität mit 20 Millilitern 4 Grad Celsius vollständigem Dima-Medium abgeschreckt und die adhärente Zellmodellschicht mit leichtem Klopfen und sanftem Pipettieren abgelöst.

Entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation und zählen Sie sie. Dann resuspendieren Sie die Einzelzellsuspension auf das 1-fache der Konzentration von 8 Zellen pro Milliliter in PBS für ihre subkutane Injektion in C57 Black 6 Empfängermäuse. Wenn der Tumor einen Durchmesser von zwei bis zehn Millilitern erreicht, entnehmen Sie die Milz von den tumortragenden Tieren und legen Sie die Milz in eine Petrischale mit frischem RPMI-Medium.

Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in 0,2 Quadratzentimeter große Stücke und inkubieren Sie die Fragmente dann in zehn Millilitern Kollagenase und Dnase bei 37 Grad Celsius. Gießen Sie nach 30 Minuten die teilweise verdaute Gewebeaufschlämmung auf ein 70-Mikron-Zellsieb und drücken Sie die restlichen Gewebefragmente mit einem Fünf-Milliliter-Spritzenkolben durch das Netz des Siebs. Spülen Sie den Filter mit 10 Millilitern frischem Medium, mischen Sie die Wäsche mit dem Rest der Einzelzellensuspension und pelletieren Sie die Zellen.

Wir suspendieren das Zellpellet in 2 Millilitern Lysepuffer für rote Blutkörperchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Waschen Sie dann die Zellen in 10 Millilitern frischem RPMI-Medium und suspendieren Sie sie bei 1 mal 10 zu den 8 Zellen pro Milliliter in einem Zellsortierpuffer, der den FC-Block enthält. Um die Plasmazytod-DCs zu isolieren, mischen Sie gründlich 300 Mikroliter Biotin-markierten Antikörpercocktail aus einem Plasmazytod-DC-Isolationskit mit 200 Mikrolitern der Milz-Einzelzellsuspension.

Legen Sie die Zellen für 15 Minuten in ein Eiswasserbad, wobei Sie alle drei Minuten sanft klopfen. Waschen Sie dann die Zellen mit 12 Millilitern Zellsortierpuffer und suspendieren Sie das Pellet wieder in 500 Mikrolitern frischem Sortierpuffer. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern Anti-Biotin, Antikörper-konjugierten Kügelchen für weitere 15 Minuten im Eiswasser unter regelmäßigem Klopfen.

Nachdem Sie die Zellen in frischem Sortierpuffer gewaschen haben, suspendieren Sie die Palette wieder in 2 Milliliter Zellsortierpuffer und laden Sie eine Magnetsäule geeigneter Größe auf den entsprechenden Magneten. Äquilibrieren Sie die Säule mit fünf Millilitern frischem 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer. Wenn der gesamte Puffer von der Oberseite der Säule abgeflossen ist, fügen Sie die Zellen vorsichtig in die Mitte der Oberfläche des Säulenkopfes ein, und sammeln Sie den Durchfluss.

Anschließend wird die Säule mit 10 Millilitern frischem, 4 Grad Celsius heißem Sortierpuffer gewaschen und der Durchfluss im selben Röhrchen aufgefangen. Nach der Passage durch eine zweite magnetische Säule kann eine plasmazytodische dendritische Zellpopulation mit einer Reinheit von mehr als 94% erwartet werden. Um die CD8aplha+ und CD8alpha-DCs zu isolieren, mischen Sie den Rest der Milzzellsuspension mit 100 Mikrolitern biotion-konjugiertem Antikörpercocktail aus einem CD8alpha+dendritischen Zellisolationskit für 15 Minuten auf Eis mit leichtem Klopfen, wie gerade gezeigt.

Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in 12 Millilitern 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer und suspendieren Sie das Pellet wieder in 150 Mikrolitern frischem 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer. Mischen Sie anschließend die Zellen mit 100 Mikrolitern des Anti-Biotin-Kügelchens CD8alpha+dendritische Zellisolationskit. Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten auf Eis mit leichtem Klopfen in 10 Millilitern 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer und suspendieren Sie das Pellet wieder in 1 Milliliter frischem 4 Grad Celsius Sortierpuffer.

Am Ende der Inkubation sortieren Sie die Zellen durch magnetische Perlentrennung, wie gerade gezeigt, und sammeln Sie den Durchfluss und die erste Wäsche. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter frischem 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer. Markieren Sie nun die Zellen mit 200 Mikrolitern anti-CD8aplha-konjugierten magnetischen Kügelchen aus dem Kit und führen Sie die Zellen durch eine neue Säule, wobei der Durchfluss der CD8alpha-dendritischen Zellen aufgefangen wird.

Um die CD8alpha+DCs zu sammeln, geben Sie die Säule in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und tauchen Sie 5 Milliliter frischen 4-Grad-Celsius-Zellsortierpuffer durch die Säule. Nachdem die Zellen durch eine zweite Säule geführt wurden, kann eine Population von mehr als 96%CD8alpha+dendritischen Zellen erwartet werden. Um die CD8alpha-Zellen zu isolieren, drehen Sie die CD8alpha-Durchfluss-Zellsuspension.

Markieren Sie dann die Zellen mit 100 Mikrolitern anti-CD11 c-magnetischen Kügelchen und sammeln Sie die magnetische Kügelchen-positive Zellpopulation, wie gerade gezeigt, um eine mehr als 97%ige CD8alpha-dendritische Zelluntergruppe zu erhalten. Bestimmen Sie schließlich die Anzahl der lebenden Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. Sobald der Tumor tastbar wird, zeigen die Mäuse, die einen B16-flt-3-Liganden tragen, durchweg eine dramatische Zunahme der Milzzellularität, die mit der Ausdehnung der dendritischen Zelluntergruppen der Milz korreliert.

Interessanterweise wird für die konventionellen DCs bei diesen Tieren ein 15- bis 20-facher Anstieg der absoluten Zellzahlen beobachtet, während für die DC-Untergruppe der Plasmazytode nur ein etwa 4-facher Anstieg beobachtet wird. Die verschiedenen dendritischen Zelluntergruppen werden nach ihrer B220-, CD11b-, CD11c- und CD8alpha-Expression charakterisiert. Die Zellpopulationen weisen jedoch auch andere einzigartige Subset-Marker auf, wobei mPDCA1 ausschließlich auf den Plasmazytod-DCs DEC205 stark auf den CD8alpa+DCs exprimiert wird, während CD11b und 33D1 am prominentesten auf den CD8alpha-DCs nachgewiesen werden.

Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass CD8alpa+DCs am effizientesten bei der Präsentation von Antigenen durch CD-Bindungsmoleküle an eine spezialisierte T-Zell-Population, die als invariante NKT-Zellen bekannt sind, sind. Das wichtigste Merkmal der DC-Isolierung ist die Aufrechterhaltung strenger Sterilität und antidoxantfreier Bedingungen. Während der Eingriffe reagieren diese T-Zellen sehr gut auf Antidoxanten.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, an einen schonenden Umgang mit den Zellen zu denken, da eine wiederholte mechanische Stimulation den Reifungszustand der dendtritischen Zellen verändern kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um eine große Anzahl aller wichtigen DC-Untergruppen aus einer einzelnen Milz zu isolieren. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.