Name: Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Lernen Sie eine hocheffiziente Methode zur Isolierung von dendritischen Zell-Subpopulationen aus der Milz von Mäusen unter Verwendung von Flt-3-Ligand. Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung hochreiner, funktionell unterschiedlicher Zellfraktionen für immunologische Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von NIH / NIAID Zuschuss AI45889 zu SAP Flow-Zytometrie unterstützten Studien wurden unter Verwendung von Kernanlagen durch die Einstein Cancer Center (NIH / NCI CA013330) und Zentrum für AIDS-Forschung (NIH / NIAID AI51519) unterstützt FACS durchgeführt.

Tierversuche werden in Übereinstimmung mit genehmigten Richtlinien der institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss (IACUC) durchgeführt. Alle Verfahren erfordern Sterilität sind in einem Bio-Sicherheitsschrank durchgeführt. 1. Die Implantation von B16.Flt3L Melanom bei Mäusen <ol><li> Kultur der Flt-3 exprimierenden B16 - Melanomzelllinie in T25 - Gewebekulturkolben in einer Dichte von 0,5 x 10 6 Zellen / ml in komplettem DMEM - Medium mit 10% CO 2 bei 37 ° C. Wachsen, bis die Zellen erreichen ~ 90% Konfluenz (~ 20 h). </li><li> Ernte der Zellen durch Trypsin-Verdau. Absaugen Zellkulturmedien und waschen Sie die anhaftenden Zellen mit PBS. 5 ml 0,05% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für 5 min. Cold 20 ml komplettes DMEM-Medium (4 ° C) fötalem Kälberserum (FCS), enthaltend die Protease-Verdauung zu quenchen. Heben Sie die Zellen aus, indem Sie leicht durch sanftes Auf- und Abpipettieren gefolgt tippen. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300xg für 10 min bei 4 ° C. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer oder eines automatisierten Zelllebensfähigkeit Zähler. Resuspendieren zu einer Dichte von 10 8 Zellen / ml in PBS. </li><li> Implantat - Mäuse (C57BL / 6 oder ein anderes histokompatiblen Stamm) mit Tumorzellen durch subkutane Injektion , wie beschrieben von Machholz et al. 19 an der Basis des Halses mit 100 ul Zellsuspension (10 7 Zellen). </li><li> Lassen Sie den Tumor bis greifbar oder sichtbar zu wachsen (2 bis 10 mm im Durchmesser, in der Regel 7 bis 12 Tage), bevor die Tiere für Organentnahmen zu opfern. </li></ol> 2. Herstellung von Splenic Einzelzellsuspension von Tumor-tragenden Mäusen <ol><li> Anesthetize Mäuse mit einer Überdosis von Isofluran (Flussrate von Isofluran auf&gt; 5% einstellen und weiterhin Anschläge Exposition mindestens 2 Minuten nach der Atmung). Opfere die Flt-3-Melanomtumoren tragenden Mäusen durch Genickbruch gemäß gültiger Richtlinien für Sterbehilfe. </li><li> Disinfect die Haut mit 70% Ethanol und Ernte Milz unter aseptischen Bedingungen mit Hilfe einer sterilen Schere 20. </li><li> Legen Sie die Milz in eine sterile Petrischale für den Transport zur Biosicherheit Schrank. Führen Sie alle Schritte von hier auf unter sterilen Bedingungen. </li><li> Übertragen Milz auf eine frische Petrischale und waschen mit RPMI-Medium. Schneiden Sie die Milz in kleine (~ 0,2 cm 2) Stücke mit einem Skalpell. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C mit 10 ml Kollagenase / DNase-Lösung. </li><li> Gießen Sie die teilweise verdaute Suspension von Milzgewebe auf eine 70 um Zelle Sieb. Komprimieren der verbleibenden Gewebefragmente durch die Maschen des Siebs eine 5 ml Spritzenkolben verwendet. </li><li> Waschen Sie den Netzfilter mit 10 ml frischem Medium und entsorgen Sie den Filter. Zentrifugiere die Suspension bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Aspirieren den Überstand und Zellpellet in 2 ml Puffer RBC-Lyse. Inkubieren bei RT foder 10 min. Quench den Puffer RBC-Lyse von 10 ml komplettem RPMI-Medium hinzugefügt wird. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Resuspendieren in geeigneten Volumen Zelldichte von 10 8 Zellen / ml in Zellsortierungspuffer (beispielsweise MACS) , enthaltend 20 ug / ml Fc-block - Antikörper (2.4G2) zu erreichen. </li></ol> 3. Reinigung von Plasmazytoide DCs, CD8a Pos DCs und CD8a Neg DCs von Splenic Einzelzellsuspension Hinweis: Isolierung der splenic DC Untergruppen von Einzelzellsuspension ist ein mehrstufiges Verfahren , wie in 1 dargestellt Führen alle Schritte unter Verwendung von vorgekühlten Puffer und einem Eiswasserbad Temperatur bei 4 zu halten - 8 ° C.. Alle Reagenzienvolumina in dem folgenden Abschnitt des Protokolls für eine anfängliche Eingabe von 200 ul splenic Zellsuspension bei 10 8 Zellen / ml) berechnet. Dies kann skaliert werden odernach Bedarf auf nach unten durch das Volumen der Zellsuspension Ändern (immer bei einer Dichte von 1 × 10 8 Zellen / ml) und andere Reagenzien proportional in dem Anfangsschritt (3.1.1 und 3.2.1). Stellen Sie Reagenzvolumina in allen späteren Schritten entsprechend. Wenn beginnend mit 100 &amp; mgr; l von Milz- Zellsuspension zum Beispiel bei 1 x 10 8 / ml, verwenden Sie die Hälfte der angegebenen Reagenzienvolumina in allen Schritten. <ol><li> Isolierung von Plasmazytoide DCs (PDC) <ol><li> In 300 ul Biotin-markierte Antikörper-Cocktail in der plasmazytoiden DC-Extraktions-Kit zu 200 ul splenic Zellsuspension zur Verfügung gestellt. </li><li> Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen Sie das Röhrchen alle 3 min zu halten Zellen suspendiert und zu maximieren Antikörperbindung. </li><li> Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen. </li><li> Resuspendieren der Zellein 500 ul Zellsortierpuffer pelletieren. In 300 ul Anti-Biotin-Antikörper-konjugierten Perlen. Wiederholen Sie Schritt 3.1.2 und 3.1.3. </li><li> Überstand verwerfen und Zellpellet in 2 ml Zellsortierungspuffer. Führen Sie alle Schritte von diesem Zeitpunkt an bei RT mit vorgekühlten Puffer. </li><li> Legen Sie eine frische magnetische activated cell sorting LS Spalte im magnetischen stehen. Waschen und equilibrieren Säule mit 5 ml Zellsortierpuffer. </li><li> Pipette die Zellsuspension auf die Säule, Aufbringen sie sanft in die Mitte der Oberfläche des Säulenbettes. Sammeln Sie die Strömung durch. </li><li> Die Säule wird mit 10 ml Zellsortierungspuffer. Sammeln Sie diese Strömung durch und verbinden sich mit dem Strom durch von Schritt 3.1.7. Die pDCs werden in dieser Spalte Fluss durch (FT1) angereichert. </li><li> Pelletierung der Zellen von FT1 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C, Resuspendieren in 2 ml Zellsortierungspuffer und die Zellen durch eine frische LS Säule passierendurch die Schritte 3.1.6 Wiederholung - 3.1.8. Diese Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Spalten ergibt eine verbesserte Reinheit der isolierten Zellen. </li><li> Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und Resuspension mit 2 ml komplettem RPMI. Auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol></li><li> Isolierung von CD8a Pos und CD8a Neg DCs Hinweis: Der erste Schritt in diesem Verfahren ist Depletion von B, pDC, T und NK-Zellen. <ol><li> Beginnend mit der ganzen Milz - Zellsuspension (1 ml von 10 ml 8 Zellen / in Schritt 2.8), 100 &amp; mgr; l Biotin-konjugiertem Antikörper - Cocktail im Kit Pos DC Isolations CD8a vorgesehen. </li><li> Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. Tippen das Röhrchen sanft alle 3 min Bindung von Biotin-markiertem Antikörper an ihre Zielzellen zu maximieren. </li><li> Hinzufügen 12 ml Zellenpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. absaugen Supernatant ungebundenen biotinylierten Antikörper zu entfernen. </li><li> Zugabe von 150 ul Zellsortierpuffer und 100 ul anti-Biotin versehen Kügelchen in der CD8a Pos DC - Extraktions - Kit. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. </li><li> 10 ml Zellpuffer Sortier- und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Die Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und eine neue LS-Säule übergehen nach dem Verfahren in den Schritten 3.1.6 bis 3.1.8. </li><li> Sammeln Sie die unbeschriftete Fluss durch 2 (FT2) und die Spalte Retentat verwerfen. Diese unmarkierten Fraktion wird für CD8a Pos und CD8a Neg DCs angereichert. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen in FT2 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 1 ml Zellsortierpuffer und mit 200 &amp; mgr; l anti-CD8a konjugierten magnetischen Kügelchen im Kit Pos DC Isolation CD8a zur Verfügung gestellt. </li><li> Vertreteressen Schritte 3.2.2 bis 3.2.6. Der Fluß durch die Säule wird für CD8a Neg DCs angereichert und CD8a Pos DCs abgereichert. Dies wird Fluss durch 3 (FT3) markiert. </li><li> Um die CD8a Pos DCs in der Säule zurückgehalten, entfernen Sie die Säule aus dem Magneten eluieren, 5 ml Zellsortierpuffer und spülen Sie die Spaltenmatrix mit den Kolben mit dem LS - Säule zur Verfügung gestellt. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. Absaugen Überstand und resuspendieren in 1 ml Zellsortierpuffer. Um die Reinheit zu erhöhen, laufen wieder die eluierten Zellen durch eine frische LS-Säule durch die Schritte 3.1.6 bis 3.1.8: Wiederholung, mit Ausnahme der Strömung durch verwerfen und sammeln beibehalten Zellen wie in 3.2.11. </li><li> Um die CD8a Neg DCs aus der FT3 Suspension reinigen, pelletieren Sie die FT3 durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren in 300 &amp; mgr; l Zellsortierungspuffer. </li><li> 100 l anti-CD11c magmagnetischen Perlen. Gut mischen und Inkubation in Eiswasser-Bad für 15 min. </li><li> 10 ml Zellsortierungspuffer und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 bis 3.1.8. Die CD8a Neg DCs sind positiv mit CD11c beads ausgewählt und an die Säule gebunden. Die Strömung kann durch verworfen werden. </li><li> Eluieren in der Säule zurückgehalten Zellen als 3.2.11 in Schritt beschrieben , die das gereinigte CD8a Neg DCs zu sammeln. </li></ol></li></ol> 4. Pulsing APCs mit Antigenen und Zelltransfer <ol><li> Zählen Sie die lebenden Zellen nach der Reinigung Trypanblauausschluß 21 zu unterscheiden lebenden und toten Zellen. </li><li> Inkubieren der Zellen mit dem Antigen der Wahl. Verwenden Sie Analoga von Glycolipid - Antigen genannt alpha-Galactosyl - Ceramid (αGalCer) bei 100 nM Konzentration 13. Typischerweise Platte 10 6 lebensfähigen Zellen / Vertiefung in komplettem RPMI - Medium unter Verwendung von Ultra-Low - attachment U-Boden-96-Well-Platten Zellanhaftung zu minimieren. Inkubieren der Zellen in einem 5% CO 2 -Atmosphäre bei 37 ° C für 1 - 4 Stunden. </li><li> Ernten Sie die Zellen durch mehrere Male sanft Pipettieren. Verwenden Sie weite Bohrung Pipettenspitzen Zellschäden durch Scherkräfte zu minimieren. Waschen Sie die Vertiefungen mit PBS und bündeln diese Wäschen Zellernte zu maximieren. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und Resuspendierung in gewünschte Dichte in PBS. Typischerweise injizieren 1 Million Zellen in 200 ul pro Empfängertier. Halten Sie die Zellen auf Eis zu maximieren Lebensfähigkeit vor der Verabreichung in Wirtstiere. </li><li> Injizieren Zellen intravenös in Mäuse entweder durch den seitlichen Schwanz vergeblich oder dem retroorbitalen Venenplexus 19. Verwenden Sie eine 27 G-Nadel auf einer 1-ml-Spritze und injizieren ein maximales Volumen von 0,1 ml pro Maus. </li></ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antigen+processing+by+dendritic+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Differential antigen processing by dendritic cell subsets in vivo.</a> Science. 315 (5808), 107-111 (2007).</li>
<li>Belz, G. T., Nutt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+the+dendritic+cell+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of the dendritic cell network.</a> Nat Rev Immunol. 12 (2), 101-113 (2012).</li>
<li>den Haan, J. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+versus+activation-dependent+cross-presentation+of+immune+complexes+by+CD8%28%2B%29+and+CD8%28-%29+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive versus activation-dependent cross-presentation of immune complexes by CD8(+) and CD8(-) dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 196 (6), 817-827 (2002).</li>
<li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation%3A+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li>
<li>Yamazaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+CD205%2B+splenic+dendritic+cells+are+specialized+to+induce+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ CD205+ splenic dendritic cells are specialized to induce Foxp3+ regulatory T cells.</a> J Immunol. 181 (10), 6923-6933 (2008).</li>
<li>Mukherjee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+steady-state+dendritic+cells+induces+deletion+of+diabetogenic+CD8%28%2B%29+T+cells+independently+of+PD-1+and+PD-L1%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">DEC-205-mediated antigen targeting to steady-state dendritic cells induces deletion of diabetogenic CD8(+) T cells independently of PD-1 and PD-L1.</a> Int Immunol. 25 (11), 651-660 (2013).</li>
<li>Melief, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Regulation+of+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+by+dendritic+cells%3A+peaceful+coexistence+of+cross-priming+and+direct+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Regulation of cytotoxic T lymphocyte responses by dendritic cells: peaceful coexistence of cross-priming and direct priming.</a> Eur J Immunol. 33 (10), 2645-2654 (2003).</li>
<li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annu Rev Immunol. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Benlagha, K., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1d-restricted+mouse+V+alpha+14+and+human+V+alpha+24+T+cells%3A+lymphocytes+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1d-restricted mouse V alpha 14 and human V alpha 24 T cells: lymphocytes of innate immunity.</a> Semin Immunol. 12 (6), 537-542 (2000).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Arora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+subset+of+dendritic+cells+controls+the+cytokine+bias+of+natural+killer+T+cell+responses+to+diverse+glycolipid+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single subset of dendritic cells controls the cytokine bias of natural killer T cell responses to diverse glycolipid antigens.</a> Immunity. 40 (1), 105-116 (2014).</li>
<li>Semmling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+cross-priming+through+CCL17-CCR4-mediated+attraction+of+CTLs+toward+NKT+cell-licensed+DCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative cross-priming through CCL17-CCR4-mediated attraction of CTLs toward NKT cell-licensed DCs.</a> Nat Immunol. 11 (4), 313-320 (2010).</li>
<li>Duriancik, D. M., Hoag, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+and+enumeration+of+dendritic+cell+populations+from+individual+mouse+spleen+and+Peyer%27s+patches+using+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The identification and enumeration of dendritic cell populations from individual mouse spleen and Peyer's patches using flow cytometric analysis.</a> Cytometry A. 75 (11), 951-959 (2009).</li>
<li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3%2B+lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3%2B+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J Exp Med. 198 (2), 305-313 (2003).</li>
<li>Mach, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+dendritic+cells+stimulated+in+vivo+by+tumors+engineered+to+secrete+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+Flt3-ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand.</a> Cancer Res. 60 (12), 3239-3246 (2000).</li>
<li>Vremec, D., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+purification+of+large+numbers+of+antigen+presenting+dendritic+cells+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The purification of large numbers of antigen presenting dendritic cells from mouse spleen.</a> Methods Mol Biol. 960, 327-350 (2013).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. Unit 1.9, Removal of lymphoid organs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aReeves%2C+JP+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2001).</li>
<li>Strober, W. Appendix 3B, Trypan blue exclusion test of cell viability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2001).</li>
<li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+dendritic+cell+viability+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Maintaining dendritic cell viability in culture.</a> Mol Immunol. 63 (2), 264-267 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Dendritische Zellen werden akzeptiert die wichtigsten professionellen Antigen zu sein Zellen beteiligt in der Priming von T-Zell-Antworten zu präsentieren. Ihre Hauptfunktion ist es, die Gewebe-Mikroumgebung Umfrage durch die Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen für die Präsentation an T-Zellen. Um die Funktion von spezifischen DC Untergruppen zu untersuchen, müssen diese in ausreichender Zahl isoliert werden, um einen Ansatz, der ihren normalen Phänotyp und Funktionen beibehält. Die meisten Protokolle basieren auf d...

Dendritische Zellen (DC) wurden vor fast vierzig Jahren entdeckt , als die &quot;große stel (griechisch Dendron) Zelle&quot; 1 in lymphatischen Organen. Viele Studien haben gezeigt , dass DCs die einzigen Antigen - präsentierende Zellen sind , die effektiv naiver T - Zellen zu stimulieren 2. Eine wichtige Funktion dieser Zellen ist die Aufnahme und Präsentation von Antigenen und deren effiziente Verarbeitung und Laden derselben auf Antigen-präsentierenden Molekülen. In der Milz der Maus können DCs in plasmazytoiden und konventionelle Subsets getrennt werden. Die plasmazytoiden DCs zeichnen sich durch niedrige Expression von CD11c und ein hohes Maß an B220 und Gr-1 aus. Sie sind auch positiv für die Oberflächenmarker mPDCA1 und absondern Typ I in Reaktion auf maut Interferon like Rezeptor 9 (TLR9) Liganden. Die herkömmlichen DCs sind hoch für CD11c und MHC-Klasse-II-Expression. Sie können auf der Grundlage der Oberflächenexpression von phänotypischen Markern wie CD4, CD8a, DEC205, CD in drei verschiedene Untergruppen aufgeteilt werden,11b und dendritischen Zellen hemmenden Rezeptor 2 (DCIR2, anerkannt durch den 33D1 - Antikörper) Proteine ​​3,4. Die CD8a Pos DCs sind auch als CDC1 bekannt ist , sind positiv für DEC205, aber negativ für myeloische Marker wie CD11b und 33D1. Die CD8a Neg DCs, auch cdc2 genannt, sind positiv für 33D1, CD11b und CD4 aber es fehlt DEC205. Die doppelt negative Untergruppe (dh negativ für beide CD4 und CD8a) ist relativ selten, und ist negativ für DEC205 und 33D1. Es ist die am wenigsten charakterisierten Teilmenge und kann eine weniger differenzierte Form von CD8a Neg DC sein. Phänotypischen Unterschiede in den verschiedenen Teilmengen DC auch auf ihre in vivo - Funktionen erweitern. Die CD8a Neg DCs sind stark phagozytierenden und werden gedacht , exogene Antigen zu präsentieren hauptsächlich über MHC - Klasse - II an CD4 - T - Zellen 3. Im Gegensatz dazu sind die CD8a Pos DCs Fach zur Präsentation von löslichem Protein - Antigen auf MHC - Klasse Iin einem Mechanismus Kreuzpräsentation genannt. Das Ergebnis der Kreuzpräsentation hängt von der Aktivierungsstatus dieser DCs 5, und kann entweder zur Expansion von zytotoxischen T - Zellen (CTL) oder die Entwicklung von regulatorischen T - Zellen 6 2,7 führen. Targeting von Antigen an CD8a Pos DCs unter Verwendung von Anti-DEC205-Antikörper-vermittelte Abgabe resultiert im Wesentlichen in der Streichung von T - Zellen 8, während Präsentation von infizierten apoptotischen Zellen abgeleiteten Antigenen induziert eine starke CTL - Antwort 9. Zusätzlich zur Erkennung von Peptidantigenen, hat das Immunsystem von Säugetieren entwickelt Lipid und Glycolipid-Antigene zu erkennen. Diese Antigene werden von CD1-Molekülen präsentiert werden, welche MHC-Klasse-I-like Zelloberflächenproteine, die in mehreren verwandten Formen in verschiedenen Säugetieren existieren. Bei Mäusen, die so genannte eine einzige Art von hochkonservierten CD1 - Molekül ist CD1d verantwortlich für die Präsentation von Glycolipid - Antigenen 10. Der Bürgermeister<html> Population von T-Zellen, die CD1d / Glykolipid Komplexe erkennen ist invariant NKT-Zellen (iNKT Zellen) genannt. Diese Zellen exprimieren ein semi-invariant T - Zell - Rezeptor (TCR) einer invariant TCR &amp; agr; Kette zusammengesetzt , die mit TCR &amp; bgr; Ketten gekoppelt ist , die 11 Vielfalt begrenzt haben. Im Gegensatz zu herkömmlichen T - Zellen , die aktiviert Effektor - T - Zellen zu vermehren und zu differenzieren müssen zu werden, existieren iNKT Zellen als Effektor Bevölkerung und beginnen schnell nach Glykolipid Verwaltung 12 reagiert. Identifizierung von physiologisch relevanten präsentierenden Zellen Lipid-Antigen ist ein aktives Forschungsgebiet, und mehrere verschiedene Zelltypen, wie beispielsweise B-Zellen, Makrophagen und DCs wurden vorgeschlagen, um diese Funktion auszuführen. Es wurde jedoch gezeigt , dass die CD8a Pos Teilmenge von DCs die primäre Zelle ist vermittelnde Aufnahme und Präsentation von Antigenen auf Lipid Maus iNKT Zellen 13 und Glycolipid - vermittelten cross-Priming von CD8 - T - Zellen 14. ove_content &quot;&gt; Um die Effizienz der Antigen-Präsentation durch verschiedene Antigen-präsentierende Zellen zu vergleichen, ein einfacher Ansatz ist, verschiedene Arten von gereinigten APCs gepulst mit äquivalenten Mengen an Antigen in naiven hosts. Cell Transfer Experimente dieses Typs übertragen werden häufig für immunologische Untersuchungen durchgeführt. Allerdings Durchführen eines Transferstudien mit ex vivo Antigen behandelt DCs ist eine Herausforderung, da diese Zellen so selten Populationen in lymphatischen Organen bestehen , wo sie machen weniger als 2% der gesamten Zellen 15. daher ist es notwendig , die Entwicklung dieser Zellen in Spendertiere zu verbessern die Effizienz der Isolation Protokolle zu erhöhen. Es ist bekannt , dass die gemeinsame lymphoiden und myeloiden Vorläufern gemeinsamen, die zur Erzeugung von pDC, CD8 Pos und CD8 Neg DC Subsets express fms-verwandte Rezeptor - Tyrosinkinase 3 (Flt-3) erforderlich sind. Bei der In - vivo - Flt-3 - Ligand (Flt-3L) Verwaltung, emigratIon von Flt-3 - Vorläuferzellen aus dem Knochenmark exprimiert , wird erhöht, 16 in der erhöhten Aussaat von peripheren lymphatischen Organen und den Ausbau ihrer reifen DC Nachkommen zur Folge hat . Die Expression von Flt-3 wird während der Verpflichtung zur B, T oder NK-Zell-Differenzierungswege verloren. Daher ist nur eine minimale Veränderungen in diesen Zellen auf Flt-3L Verabreichung beobachtet. Ähnliche Expansion in DC - Populationen in Mäusen beobachtet tragenden Tumoren , die durch Implantation eines B16-Melanomzelllinie sekretierenden murinen Flt-3L, die für die Bereitstellung anhalt systemische Spiegel von Flt-3L 17,18 , ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur Verfügung stellt. Unter Verwendung dieses Ansatzes haben wir ein Protokoll basiert auf der Implantation von B16-Melanomzellen sezer Flt-3L entwickelt, um die Expansion aller normalen DC Untergruppen in der Milz der Maus zu stimulieren und somit erheblich die Ausbeuten dieser Zellen zu erhöhen, die für die nachfolgenden Experimenten isoliert werden kann . Wir finden immer wieder, dass innerhalb von 10 bis 14 Tagen nach subkutaner imPlantage des Tumors Flt-3 sezernierenden, Mäuse entwickeln Splenomegalie mit deutlichen Anreicherung von DCs 40 zu bilden - 60% der gesamten Milz-Zellen. Aus diesen Milzen können verschiedene DC Untergruppen mit hoher Reinheit unter Verwendung von handelsüblichen Zellreinigung Kits isoliert werden, die Teilmenge spezifischen phänotypischen Marker verwenden.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (trockenes Pulver)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>Zur Herstellung von 70 % Ethanol</td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Medium mit L-Glutamin&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>nicht essentielle MEM-Aminosäuren&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM essentielle Aminosäuren&nbsp;</td><td>Lebenstechnologien</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS Ca2+ und Mg2+ frei pH 7,2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s PBS (DPBS mit Ca2+ und Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M Ethylendiamintetraacetat (EDTA)-Lösung&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau (trockenes Pulver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>Bereiten Sie 0,08 % mit PBS vor</td></tr><tr><td>Plasmazytoid Dendritische Zellen Isolationskit II, Maus</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Magnetische Kügelchen, konjugiert mit Anti-Maus CD11c&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&alpha; Pos Maus-DC-Isolationskit&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Fc-gamma-Rezeptor-blockierender Antikörper (Klon 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-CD8&alpha;-PerCP&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus B220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritzen&nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 Nadel&nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischale&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Instrumente&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb (70 & Mikro; m)</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Große Petriplatten&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfiltrationssystem (500 ml (0,22 &Mikro; m))</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>LS-Säulen&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Ständer MACS Separator&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Breitbohrung 200 &mu; l Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>111623</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well-Platten mit extrem niedrigem Aufsatz&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>6-8 Wochen altes weibliches C57BL/6 Mäuse&nbsp;</td><td>Jackson Research Laboratories, Jax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L Melanom-Zelllinie</td><td></td><td></td><td>, beschrieben von Mach et al., 2000</td></tr><tr><td>serumfreie DMEM- und RPMI-Medien 500 ml DMEM mit L-Glutamin, oder 500 ml RPMI-1640 mit L-Glutamin 5 ml MEM nichtessentielle Aminosäuren (100x, 10&nbsp; mM) 5 ml HEPES-Puffer (1 M) 5 ml L-Glutamin (200&nbsp; mM) 0,5 ml 2-Mercaptoethanol (5,5 x 10-2 M)</td><td></td><td></td><td>Mischen Sie alle Zutaten in einer Biosicherheitswerkbank je nach Bedarf entweder mit DMEM- oder RPMI-Medien. Der Filter sterilisiert das Medium, indem er durch einen 0,22 & Mikro m Vakuum-Filtersystem.</td></tr><tr><td>Complete RPMI- und DMEM-Medien</td><td>Geben Sie 50 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum zu serumfreien RPMI- oder DMEM-Medien</td><td></td><td></td>, um ein vollständiges Medium zu erhalten.</tr><tr><td>MACS-Puffer</td><td></td><td></td>Geben <td>Sie 2 ml 0,5 M EDTA und 10 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum zu 500 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Ca2+ und Mg2+ frei, pH 7,2) und 2&nbsp; &Mikro; g/ml 2,4G2 (Fc-Block Antikörper).</td></tr><tr><td><stark>FACS-Färbepuffer</stark></td><td></td><td></td><td>Natriumazid auf 0,05 % (0,25 g pro 500 ml) in MACS-Puffer auflösen, um FACS-Färbepuffer</td></tr> <tr><td>zu erhalten<stark>10x Kollagenase D und DNase 1 Stammlösung 
Lösen Sie 1 g Kollagenase D und 0,2 ml DNase 1-Stamm (1 mg/ml, 100x) in 20 ml PBS, die Ca2+ und Mg2+ enthalten, um eine Lösung von etwa 1.000-2.000 Einheiten Kollagenaseaktivität pro ml zu erhalten.</td><td></td><td></td><td>Diese 10-fache Stammlösung kann im Voraus zubereitet und bei -20 Grad gelagert werden. C für mehrere Wochen. Verdünnen Sie 1 ml davon unmittelbar vor der Anwendung mit 9 ml serumfreiem RPMI.</td></tr></tbody></table>

eine effiziente und high-yield-methode zur isolierung von maus über dendritische zellen subsets

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, in erster Linie verantwortlich für die Erfassung, Verarbeitung und Antigenen auf Antigen-präsentierenden Molekülen präsentiert T-Zellen vermittelte Immunität zu initiieren. Dendritische Zellen können in mehrere phänotypisch und funktionell heterogenen Untergruppen getrennt werden. Drei wichtige Untergruppen von Milz- dendritischen Zellen sind plasmazytoiden, CD8a Pos und CD8a Neg Zellen. Die plasmazytoiden DCs sind natürliche Produzenten von Typ I Interferon und sind wichtig für die anti-virale T-Zell-Immunität. Die CD8a Neg DC Teilmenge wird für MHC - Klasse - II - Antigen - Präsentation spezialisiert und ist in Priming CD4 - T - Zellen zentral beteiligt. Die CD8a Pos DCs sind in erster Linie verantwortlich für die Kreuzpräsentation von exogenen Antigenen und CD8 T - Zellen - Priming. Die CD8a Pos DCs nachgewiesen wurden bei der Präsentation von Glycolipid - Antigenen durch CD1d Moleküle an eine spezialisierte T cel am effizientestenl Bevölkerung als unveränderliche natürliche Killer-T (iNKT) Zellen bekannt. Verabreichung von Flt-3-Ligand erhöht die Frequenz der Migration der dendritischen Zellvorläuferzellen aus Knochenmark, letztendlich in Expansion der dendritischen Zellen in peripheren lymphoiden Organen in murinen Modellen resultiert. Wir haben dieses Modell angepasst für eine große Anzahl von funktionellen dendritischen Zellen zu reinigen , die Verwendung in der Zellübertragung Experimente in vivo Fähigkeits verschiedener DC Untergruppen zu vergleichen.

Die Ergebnisse dieses Verfahrens beruht auf der Expansion des DC Untergruppen durch murine Flt-3L durch die implantierten Melanomzellen exprimiert wird. Der B16.Flt3L Tumor wurde aus einer C57BL / 6-Maus abgeleitet und sollte mit diesem Stamm Hintergrund, um in Tiere implantiert werden Versagen des Tumors zu vermeiden wegen Ablehnung zu etablieren. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, genetisch veränderte Mäuse verwenden DCs mit bekannten Defekten in Signalwege oder Rezeptoren v...

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Entwicklung eines hocheffizienten und ertragreichen Verfahrens zur Erzeugung von dendritischen Zellen oder DCs, die ihre phänotypische und funktionelle Divergenz in vivo schicksalhaft widerspiegeln. Dendritische Zellen existieren als große Populationen in lymphatischen Organen. Daher verwenden wir Filterliganden, um die Häufigkeit dieser essentiellen Zellen im Spendergewebe zu erhöhen und diese Isolierung zu erleichtern.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Generierung aller DC-Teilmengen in geeigneter Anzahl für die Analyse nur mit den kommerziell erhältlichen Agenten entfernt wird. Um flt-3-Liganden, die B16-Melanomzellen exprimieren, aus einer 90%igen konfluenten Kultur zu gewinnen, waschen Sie die Zellen zunächst mit PBS und inkubieren Sie die Kultur mit 05%Trypsin bei 37 Grad Celsius. Nach 5 Minuten wird die Proteaseaktivität mit 20 Millilitern 4 Grad Celsius vollständigem Dima-Medium abgeschreckt und die adhärente Zellmodellschicht mit leichtem Klopfen und sanftem Pipettieren abgelöst.Entnehmen Sie die Zellen durch Zentrifugation und zählen Sie sie. Dann resuspendieren Sie die Einzelzellsuspension auf das 1-fache der Konzentration von 8 Zellen pro Milliliter in PBS für ihre subkutane Injektion in C57 Black 6 Empfängermäuse. Wenn der Tumor einen Durchmesser von zwei bis zehn Millilitern erreicht, entnehmen Sie die Milz von den tumortragenden Tieren und legen Sie die Milz in eine Petrischale mit frischem RPMI-Medium.Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in 0,2 Quadratzentimeter große Stücke und inkubieren Sie die Fragmente dann in zehn Millilitern Kollagenase und Dnase bei 37 Grad Celsius. Gießen Sie nach 30 Minuten die teilweise verdaute Gewebeaufschlämmung auf ein 70-Mikron-Zellsieb und drücken Sie die restlichen Gewebefragmente mit einem Fünf-Milliliter-Spritzenkolben durch das Netz des Siebs. Spülen Sie den Filter mit 10 Millilitern frischem Medium, mischen Sie die Wäsche mit dem Rest der Einzelzellensuspension und pelletieren Sie die Zellen.Wir suspendieren das Zellpellet in 2 Millilitern Lysepuffer für rote Blutkörperchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Waschen Sie dann die Zellen in 10 Millilitern frischem RPMI-Medium und suspendieren Sie sie bei 1 mal 10 zu den 8 Zellen pro Milliliter in einem Zellsortierpuffer, der den FC-Block enthält. Um die Plasmazytod-DCs zu isolieren, mischen Sie gründlich 300 Mikroliter Biotin-markierten Antikörpercocktail aus einem Plasmazytod-DC-Isolationskit mit 200 Mikrolitern der Milz-Einzelzellsuspension.Legen Sie die Zellen für 15 Minuten in ein Eiswasserbad, wobei Sie alle drei Minuten sanft klopfen. Waschen Sie dann die Zellen mit 12 Millilitern Zellsortierpuffer und suspendieren Sie das Pellet wieder in 500 Mikrolitern frischem Sortierpuffer. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern Anti-Biotin, Antikörper-konjugierten Kügelchen für weitere 15 Minuten im Eiswasser unter regelmäßigem Klopfen.Nachdem Sie die Zellen in frischem Sortierpuffer gewaschen haben, suspendieren Sie die Palette wieder in 2 Milliliter Zellsortierpuffer und laden Sie eine Magnetsäule geeigneter Größe auf den entsprechenden Magneten. Äquilibrieren Sie die Säule mit fünf Millilitern frischem 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer. Wenn der gesamte Puffer von der Oberseite der Säule abgeflossen ist, fügen Sie die Zellen vorsichtig in die Mitte der Oberfläche des Säulenkopfes ein, und sammeln Sie den Durchfluss.Anschließend wird die Säule mit 10 Millilitern frischem, 4 Grad Celsius heißem Sortierpuffer gewaschen und der Durchfluss im selben Röhrchen aufgefangen. Nach der Passage durch eine zweite magnetische Säule kann eine plasmazytodische dendritische Zellpopulation mit einer Reinheit von mehr als 94% erwartet werden. Um die CD8aplha+ und CD8alpha-DCs zu isolieren, mischen Sie den Rest der Milzzellsuspension mit 100 Mikrolitern biotion-konjugiertem Antikörpercocktail aus einem CD8alpha+dendritischen Zellisolationskit für 15 Minuten auf Eis mit leichtem Klopfen, wie gerade gezeigt.Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation in 12 Millilitern 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer und suspendieren Sie das Pellet wieder in 150 Mikrolitern frischem 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer. Mischen Sie anschließend die Zellen mit 100 Mikrolitern des Anti-Biotin-Kügelchens CD8alpha+dendritische Zellisolationskit. Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten auf Eis mit leichtem Klopfen in 10 Millilitern 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer und suspendieren Sie das Pellet wieder in 1 Milliliter frischem 4 Grad Celsius Sortierpuffer.Am Ende der Inkubation sortieren Sie die Zellen durch magnetische Perlentrennung, wie gerade gezeigt, und sammeln Sie den Durchfluss und die erste Wäsche. Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter frischem 4 Grad Celsius Zellsortierpuffer. Markieren Sie nun die Zellen mit 200 Mikrolitern anti-CD8aplha-konjugierten magnetischen Kügelchen aus dem Kit und führen Sie die Zellen durch eine neue Säule, wobei der Durchfluss der CD8alpha-dendritischen Zellen aufgefangen wird.Um die CD8alpha+DCs zu sammeln, geben Sie die Säule in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und tauchen Sie 5 Milliliter frischen 4-Grad-Celsius-Zellsortierpuffer durch die Säule. Nachdem die Zellen durch eine zweite Säule geführt wurden, kann eine Population von mehr als 96%CD8alpha+dendritischen Zellen erwartet werden. Um die CD8alpha-Zellen zu isolieren, drehen Sie die CD8alpha-Durchfluss-Zellsuspension.Markieren Sie dann die Zellen mit 100 Mikrolitern anti-CD11 c-magnetischen Kügelchen und sammeln Sie die magnetische Kügelchen-positive Zellpopulation, wie gerade gezeigt, um eine mehr als 97%ige CD8alpha-dendritische Zelluntergruppe zu erhalten. Bestimmen Sie schließlich die Anzahl der lebenden Zellen durch Trypanblau-Ausschluss. Sobald der Tumor tastbar wird, zeigen die Mäuse, die einen B16-flt-3-Liganden tragen, durchweg eine dramatische Zunahme der Milzzellularität, die mit der Ausdehnung der dendritischen Zelluntergruppen der Milz korreliert.Interessanterweise wird für die konventionellen DCs bei diesen Tieren ein 15- bis 20-facher Anstieg der absoluten Zellzahlen beobachtet, während für die DC-Untergruppe der Plasmazytode nur ein etwa 4-facher Anstieg beobachtet wird. Die verschiedenen dendritischen Zelluntergruppen werden nach ihrer B220-, CD11b-, CD11c- und CD8alpha-Expression charakterisiert. Die Zellpopulationen weisen jedoch auch andere einzigartige Subset-Marker auf, wobei mPDCA1 ausschließlich auf den Plasmazytod-DCs DEC205 stark auf den CD8alpa+DCs exprimiert wird, während CD11b und 33D1 am prominentesten auf den CD8alpha-DCs nachgewiesen werden.Mit dieser Methode haben wir gezeigt, dass CD8alpa+DCs am effizientesten bei der Präsentation von Antigenen durch CD-Bindungsmoleküle an eine spezialisierte T-Zell-Population, die als invariante NKT-Zellen bekannt sind, sind. Das wichtigste Merkmal der DC-Isolierung ist die Aufrechterhaltung strenger Sterilität und antidoxantfreier Bedingungen. Während der Eingriffe reagieren diese T-Zellen sehr gut auf Antidoxanten.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, an einen schonenden Umgang mit den Zellen zu denken, da eine wiederholte mechanische Stimulation den Reifungszustand der dendtritischen Zellen verändern kann. Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um eine große Anzahl aller wichtigen DC-Untergruppen aus einer einzelnen Milz zu isolieren. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

an-efficient-high-yield-method-for-isolation-mouse-dendritic-cell

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Isolation von Lymphozyten mit der Miltenyi MACs Kit ist eine zuverlässige Methode, um Zellen aus ganzen lymphatischen Gewebe-Homogenaten zu reinigen. Cells unter Verwendung der Miltenyi-System sind in der Regel ≥ 96% rein. Hier zeigen wir, welche Schritte unternommen wurden, um CD4 + T-Zellen, einer der vielen Kits von Miltenyi angeboten isolieren.

Isolierung von CD4 + T-Zellen aus Maus-Lymphknoten mit Miltenyi MACS Purification

Ein hoch gereinigte Präparation von Mauslunge dendritischen Zellen beschrieben wird. Besonderer Nachdruck wird auf die Isolierung von konventionellen dendritischen Zellen Teilmenge gegeben.

Isolierung von Maus Lung Dendritischen Zellen

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

Dieses Video zeigt ein Verfahren für den adoptiven Transfer von mit hohem Salzgehalt behandelten Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen (DCs) in Mäuse. Murine CD11c+ dendritische Zellen (DCs) werden einem Medium ausgesetzt, das hohe Mengen an Natrium enthält, und bilden in den Zellen Isolevuglandin (IsoLG)-Protein-Addukte. Diese Addukte dienen als Neoantigene und werden auf der Oberfläche von DCs präsentiert. Die mit hohem Salzgehalt behandelten Zellen werden durch adoptiven Zelltransfer...

Ein Verfahren zur Behandlung dendritischer Zellen mit hohem Salzgehalt und deren adoptiver Transfer in Mäuse

Diese Protokollinformationen ein Verfahren zur Isolierung von Antigen-präsentierenden Zellen menschlichen Thymus über verschiedene Schritte der enzymatischen Verdauung des Gewebes, gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation der Einzelzellsuspension und schließlich magnetisch und / oder FACS-Sortierung von Zellpopulationen von Interesse.

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dendritische Zellen aus murinen Milz von magnetischen Zellsortierung und späteren Adoptiveltern Übertragung ins naive Mäuse zu isolieren. Das Modell von hohem Salzgehalt aktivierten dendritischen Zellen wurde gewählt, um die schrittweisen Verfahren Adoptiv-Transfer und Durchflusszytometrie zu erklären.

Isolation und Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt Antigen-präsentierende dendritische Zellen

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Lernen Sie eine hocheffiziente Methode zur Isolierung von dendritischen Zell-Subpopulationen aus der Milz von Mäusen unter Verwendung von Flt-3-Ligand. Dieses Protokoll ermöglicht die Gewinnung hochreiner, funktionell unterschiedlicher Zellfraktionen für immunologische Studien.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Weitere Videos entdecken