Funktionelle Komplementierung Analyse (FCA): A Laboratory Übung konzipiert und umgesetzt, die Lehre von Biochemical Pathways zur Ergänzung

Das übergeordnete Ziel des Functional Complementation Essays ist es, die Aktivität eines Enzyms aufzuklären, indem eine funktionelle Kopie des entsprechenden Gens in eine mutierte Zelle eingeführt wird, um zu sehen, ob sie einen Wildtyp-Phänotyp im mutierten Hintergrund wiederherstellt. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in einer Vielzahl von Bereichen zu beantworten, wie z. B. Biochemie, Mikrobiologie, Genetik, Pflanzenbiologie, Evolution und andere. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Funktion, Aktivität und/oder Rolle eines Enzyms unter In-vivo-Bedingungen bewertet, die normalerweise physiologischer Natur sind, im Gegensatz zu In-vitro-Bedingungen, die normalerweise künstlicher Natur sind.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Identifizierung und/oder Aufklärung der Funktion von nicht charakterisierten Enzymen und solchen, die noch vermeintliche oder vorhergesagte Funktionen haben. Taylor Harkness, Student im Hauptfach Biotechnologie und molekulare Biowissenschaften, demonstriert dieses Verfahren der funktionellen Komplementierung, ein Student in meinem Labor. Nach der Klonierung der Gene DapL, TarB, MurE und RSH gemäß dem Textprotokoll werden 50 Milliliter flüssiges Medium mit einer einzigen Kolonie mutierter Bakterienzellen beimpft, die mit einem Gen von Interesse transformiert werden und über Nacht wachsen.

Verwenden Sie am zweiten Tag die 50-Milliliter-Übernachtkultur, um 1 Liter des entsprechenden Mediums zu beimpfen und wachsen Sie bei 30 Grad Celsius bis zur Lock-Phase oder auf eine OD600 von 0,4 bis 0,6. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Dekantieren Sie dann den Überstand und verwenden Sie 500 Milliliter steriles, eiskaltes, destilliertes Wasser, um das Pellet wieder zu suspendieren.

Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und verwenden Sie nach dem Dekantieren des Überstands 250 Milliliter steriles, eiskaltes 10%iges Glycerin, um das Pellet zu resuspendieren. Nachdem Sie die Zellen ein letztes Mal gedreht haben, verwenden Sie zwei Milliliter 10%iges Glycerin, um die Zellen zu resuspendieren. Füllen Sie 50 Mikroliter Aliquote in Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie sie sofort ein, indem Sie die Röhrchen in ein Trockeneis-Ethanolbad legen.

Lagern Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius für die Elektroporation. Um eine Elektroporation durchzuführen, fügen Sie 1 Mikroliter rekombinantes Plasmid zu einem 50-Mikroliter-Aliquot kompetenter Zellen hinzu und legen Sie es fünf Minuten lang auf Eis. Übertragen Sie die Zellen in eine Elektroporationsküvette und stellen Sie das Elektroporationsgerät auf die folgenden Einstellungen ein: 25 Grad Fahrenheit Kapazität, 2,5 Kilovolt und 200 Ohm Widerstand.

Sie dann mit der Küvette im Gerät einen Impuls ab. Geben Sie 1 Milliliter Rückgewinnungsmedium in die Küvette und geben Sie die Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Zellen sich erholen, indem Sie die Kultur in einem Schüttelinkubator mit sanfter Rotation für 60 Minuten bei der für die Mutante erforderlichen Temperatur inkubieren.

Zur Auswahl der Transformantien pipettieren Sie 100 Mikroliter der Kultur auf ein Medium mit Agarplatten und verwenden Sie einen sterilen Spreader, um die Lösung zu verteilen. Dann über Nacht bei der entsprechenden Temperatur inkubieren. Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll.

Um eine Komplementationsanalyse durchzuführen, transformieren Sie AOH1 mit dem leeren Vektor pBAD33 oder mit dapL-Expressionsvektoren mittels Elektroporation, wie gerade gezeigt. Die Transformationsmischung wird auf LB-Agar-Medium aufgetragen, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Dap, 34 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol und 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, bevor Sie die Ergebnisse beobachten.

Mit dem leeren Vektor pBAD33 oder mit dem murE-Exprimationsvektor transformieren Sie die TKL-11-Mutante mittels Elektroporation, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Plattieren Sie die Transformanten auf LB-Agar, ergänzt mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Thiamin und 34 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol, und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, bevor Sie nach Transformatoren suchen. Testen Sie die Komplementation, indem Sie Kolonien sowohl aus der Kontroll- als auch aus der experimentellen Transformation auf zwei Platten LB-Medium plus 0,2 % Arabinose und 50 Mikrogramm pro Milliliter Thiamin streifen oder plattieren.

Inkubieren Sie eine Platte bei 30 Grad Celsius und die andere bei 42 Grad Celsius für 24 Stunden, bevor Sie den Wachstumsphänotyp beurteilen. Transformieren Sie den mutierten Hx699-Stamm und den Wildtyp-Rr217-Stamm der Nowosphingobium-Spezies mit dem leeren Vektor pRK290 oder einem Vektor, der das native rshNsp-Gen enthält, in jeweils zwei separaten Transformationsereignissen, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Die Transformanten auf Kartoffeldextrose oder PD-Agar auffüllen, die mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Tetracyclin ergänzt werden, und mindestens 72 Stunden lang inkubieren, oder bis Transformanten auftreten.

Streichen Sie dann die Transformanten in einem X-Muster auf frische PD-Agarplatten mit Tetracyclin. Nach einer Inkubation bei 30 Grad Celsius für mindestens vier Tage wird der Wachstumsphänotyp beider Platten visuell untersucht. Die E.coli-Doppelmutante AOH1 beherbergt eine Mutation im DapE-Gen und eine Deletion des DapD-Gens und wächst nicht, wenn Dap nicht zur Verfügung gestellt wird.

Wie hier zu sehen ist, ist die AOH1-Mutante, die DapLs exprimiert, in der Lage, auf LLDap-freiem Medium zu wachsen, indem sie THDP in LLDap im Dap-Lyseweg umwandelt. Das MurE-Enzym erleichtert die Zugabe von m-DAP in das Peptidoglykan gramnegativer Bakterien. Die E.coli-MurE-Mutante TKL-11 kann bei 42 Grad Celsius nicht wachsen.

In diesem Experiment wachsen nur TKL-11-Zellen, die mit MurE transformiert wurden, bei 42 Grad Celsius. Eine Mutation im TyrB-Gen verhindert die Synthese von Tyrosin und Phenylalanin. Wie hier gezeigt, wächst der TyrB-mutierte DL39-Stamm, wenn er das A.thaliana At5g36160-Gen exprimiert, auf M9-Medium, dem Tyrosin und Phenylalanin fehlen, was zeigt, dass das Enzym Tyrosin synthetisieren kann.

Die Hx699-Mutante in Nowosphingobium-Spezies beherbergt ein nicht-funktionelles RSH-Protein und erzeugt einen hypomukoidalen Phänotyp. Die Transformation mit dem nativen RSH-Gen produziert jedoch löslichere extrazelluläre Polysaccharide im multizellulären X-Streifen, der hypermukoidal ist. Im Gegensatz dazu erzeugt die Hx699-Mutante, wenn sie mit einem leeren Vektor transformiert wird, einen hypomukoidalen Phänotyp.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa 24 bis 48 Stunden durchgeführt werden. Bei sachgemäßer Durchführung in Abhängigkeit vom Wachstum des verwendeten Modellorganismus, mit Ausnahme der Klonierung, Kompetenz der Präparations- und Transformationsschritte. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich an die Wachstumsbedingungen der Mutanten zu erinnern, die in der funktionellen Komplementationsanalyse verwendet werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. traditionelle in-vitro-axiomatische Charakterisierungen, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Substratspezifität, Temperatur- und pH-Optima sowie somatische Geschwindigkeitsraten usw. zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biologie und vieler Unterabteilungen, wie z. B. der Mikrobiologie, den Weg, um die In-vivo-Funktion oder -Rolle von Enzymen aus einer Vielzahl von Organismen aufzuklären. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man elektrokompetente Bakterienzellen herstellt, wie man Bakterien durch Elektroporation transformiert und wie man die Funktion von Genen/Enzymen durch funktionelle Komplementierung bewertet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit pathogenen Organismen äußerst gefährlich sein kann und die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.