La neurogénesis en la evaluación primaria

El objetivo general de este experimento consiste en permitir la visualización rápida y sencilla de diferentes poblaciones de células neuronales en el cerebro embrionario en desarrollo de Xenopus. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurogénesis primaria, como observar el proceso de regulación de la diferenciación neuronal en el sistema nervioso central de Xenopus. La principal ventaja de esta técnica es que permite la observación simultánea del grupo de progenitores de células madre neurales, así como de un grupo neural primario diferenciado, dentro de un único experimento.

Para comenzar este procedimiento, aspire cuidadosamente de cinco a diez embriones del vial de vidrio utilizando una pipeta de plástico o vidrio sin introducir burbujas de aire. Transfiera los embriones a la cámara de montaje y obsérvelos bajo un estereoscopio. Llene completamente la cámara de montaje con solución de gelatina para asegurar la rigidez del bloque de sección.

A continuación, coloque los embriones uno al lado del otro utilizando un par de pinzas de punta fina. Marque la orientación de la cabeza dibujando una flecha en el borde de la cámara con un marcador compatible con criogenia. Para múltiples grupos de embriones, anote la descripción de cada grupo en el borde de la cámara correspondiente.

Luego, coloque cuidadosamente la cámara en posición horizontal dentro de una caja de espuma llenada hasta la mitad con hielo seco. Cierre la tapa y deje que la cámara de montaje se congele una a la vez durante cinco a diez minutos. Después, continúe con la criosección o conserve las muestras congeladas a 80 grados Celsius durante al menos una o dos semanas sin perder inmunogenicidad.

En este procedimiento, retire el bloque de muestra congelado de la cámara presionando la parte inferior de la cámara con un palillo romo o con un dedo. Luego, agregue varias gotas de medio de congelación de tejidos sobre el disco portamuestras. Coloque el bloque de muestra con el extremo anterior de los embriones orientado hacia arriba y deje que el bloque montado permanezca dentro de la cámara del criostato durante aproximadamente un minuto, o hasta que el medio de congelación de tejidos se vuelva opaco.

Instale inmediatamente el disco portamuestras en el micrótomo con el lado inferior del bloque de muestra orientado hacia arriba. Recorte una porción del bloque de muestra utilizando una cuchilla mientras el bloque de muestra aún esté relativamente blando. Luego, deje el disco portamuestras en el micrótomo durante al menos cinco minutos para permitir que su temperatura alcance el equilibrio.

Posteriormente, recorte gradualmente el bloque de muestra hasta que las cabezas de las ranas de cola sean visibles a través de la gelatina translúcida. Para aumentar la velocidad del recorte, aumente el grosor de la sección. Supervise el rendimiento del criostato, como la nitidez y el ángulo de la cuchilla, para asegurar que las secciones posteriores se generen en una tira larga.

Una vez que las cabezas de las larvas sean visibles, ajuste la configuración del criostato nuevamente a la normal para asegurarse de que los cortes terminados formen tiras y no se superpongan ni adhieran a la cuchilla. Luego, continúe recortando hasta que las cabezas de las larvas estén casi expuestas. Retire con un pincel cualquier sección residual en la platina antes de comenzar a recolectar las secciones de muestra.

Realice aproximadamente de 10 a 15 secciones y deje que formen una tira larga. Gire la placa de vidrio cubreobjetos gruesa hacia un lado y retire suavemente la tira de la cuchilla utilizando un pincel de punta fina. A continuación, colóquela sobre la platina con el eje largo paralelo a la cuchilla.

Realice de 10 a 15 secciones y deje que formen una tira larga sin interrupciones. Puede no ser fácil y requiere práctica. Un truco consiste en no aplicar una velocidad demasiado alta en la rueda manual.

Por el contrario, gire cuidadosa y lentamente la rueda manual. Después, tome un portaobjetos cargado positivamente a temperatura ambiente y etiquételo con un lápiz. Luego, presiónelo rápidamente y con firmeza sobre la tira, con el lado etiquetado hacia abajo.

Posteriormente, retire el portaobjetos de la cámara del criostato. Repita este paso para colocar de 20 a 30 cortes en paralelo sobre cada portaobjetos. Seque los portaobjetos al aire durante 10 minutos y luego proceda inmediatamente al procedimiento de inmunotinción o almacénelos en una caja para portaobjetos a 80 grados Celsius durante un período de tres a seis meses antes de realizar la inmunotinción.

Aquí, podemos observar los planos seccionales correspondientes al prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo y médula espinal de una larva de Xenopus, que se utilizarán como referencias posicionales para las siguientes imágenes. Las secciones transversales correspondientes, teñidas con Anti-Sox3, Anti-tubulina acetilada y DAPI, muestran las ubicaciones relativas de los reservorios de células madre neurales, así como de los neurofilamentos dentro del tubo neural. Y aquí se presentan las secciones transversales correspondientes teñidas con Anti-MyT1 y DAPI, que muestran las ubicaciones relativas de las neuronas primarias diferenciadas dentro del tubo neural.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurar un tiempo suficiente de enfriamiento para el bloque de muestra en hielo seco. De lo contrario, el bloque de muestra podría no ser lo suficientemente duro y, por tanto, difícil de cortar.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia del desarrollo exploraran la diferenciación neural en los sistemas nerviosos centrales de Xenopus. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar secciones y observar grupos específicos de células neuronales en un sistema nervioso central de Xenopus.