Name: Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprende el aislamiento inmunomagnético de oligodendrocitos primarios de ratón para estudios de mielinización y neurociencia. Este método logra más del 80% de pureza en aproximadamente una hora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) y los institutos nacionales de salud (R03NS06740402). Los autores agradecen a Dr. Iván Hernández y los miembros de su laboratorio para proporcionar asesoramiento, equipamiento y espacio de laboratorio.

Los ratones utilizados en este estudio fueron atendidos según las directrices del número de protocolo de SUNY Downstate Medical Center División de laboratorio Animal recursos (DLAR) 15-10492.
Nota: Oligodendrocitos primarios fueron aislados de neonatal (P5-P7-tipo C57Bl/6N) ratones. En esta etapa, OLs inmaduros constituyen más del 80% de la materia blanca roedor garantizar alto rendimiento celular. Todos los buffer y composiciones de reactivo están disponibles al final de la Tabla de materiales.
1. cubreobjetos preparación
Nota: Poly-D-lisina (PDL) / cubreobjetos laminina revestido deben estar preparado antes de aislamiento OL.
<ol><li>Lugar #1 alemán cubreobjetos de vidrio en un tubo cónico de 50 mL y añadir 35 mL de 70% EtOH para limpiarlos.</li>
	<li>Cierre el tubo y colocar en un mezclador oscilante incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos mientras mecerse suavemente. Cubreobjetos pueden ser incubadas durante la noche.</li>
	<li>Deseche el EtOH 70%.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos 3 veces con agua desionizada, quitar el agua cada vez con bomba aspirativa.</li>
	<li>Añadir 30-35 mL de PDL 50 μg/mL para el cubreobjetos en el tubo de 50 mL, suficiente para cubrir el cubreobjetos.</li>
	<li>Coloque el tubo de 50 mL que contiene el cubreobjetos en un mezclador oscilante e incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos mientras mecerse suavemente.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos 3 veces con agua desionizada, quitando el agua cada vez con bomba aspirativa.</li>
	<li>Transferir el cubreobjetos en platos de Petri de 60 mm con agua desionizada.</li>
	<li>Utilice una pipeta de P200 para arreglar el cubreobjetos como una capa que cubre toda la superficie de la placa de Petri.</li>
	<li>Con cuidado, retire el agua de los platos con bomba aspirativa.</li>
	<li>Retirar el exceso de agua en el cubreobjetos y deje secar durante la noche con la tapa abierta y debajo de UV luz en la capilla. Nota: PDL revestido vidrio cubreobjetos pueden almacenarse a 4 ° C en placas de Petri estériles hasta por tres meses.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos en placas de 24 pocillos, uno por cada bien, con unas pinzas finas.</li>
	<li>Mover el cubreobjetos hasta el centro de la bien asegurándose de que los bordes no toquen la pared del pozo.</li>
	<li>Añada 100 μl de 10 laminina μg/mL diluido en B27NBMA (véase la Tabla de materiales) comenzando en el centro de cada cubreobjetos y mover en forma circular hacia los bordes para cubrir toda el área. Nota: Puesto que laminina está involucrado en el mantenimiento OL y promueve la diferenciación en OLs madurados, es un factor importante de la supervivencia del OL en vitro cultura41,42,43,44.</li>
	<li>Incube la placa en una incubadora de 37 ° C en 5% CO2 durante al menos 1 hora o hasta que están listos para la galjanoplastia OLs.</li>
</ol>2. ratón cerebro corteza disociación
<ol><li>Postnatal 5-7-día viejo C57Bl/6N ratón cachorros de sacrificio por decapitación rápida con tijeras previamente limpiados en etanol al 70%. Nota: cortezas cerebrales de 5-6 crías de ratones neonatales fueron utilizados para cada preparación. En promedio, un cerebro de ratón rinde 1-1.5 x 106 OLs.</li>
	<li>Cortar la piel del cuero cabelludo a lo largo de la línea media con pequeñas tijeras de disección y retraer para exponer el cráneo.</li>
	<li>Corte del cráneo cuidadosamente a lo largo de la línea media a partir de la apertura en la parte posterior del cráneo hacia la zona frontal, levantando con las tijeras para no dañar el cerebro. Luego, con la apertura en la parte posterior del cráneo corte hacia cada zócalo del ojo a lo largo de la base del cráneo.</li>
	<li>Usar pinzas finas para fastidiar las cortezas del mesencéfalo y transferirlas a una placa de cultivo de tejido de 60 mm que contienen 7 mL de B27NBMA. Repita los pasos 2.2 a 2.4 en cada cerebro, agrupación de las cortezas disecadas.</li>
	<li>Transferir las cortezas a un nuevo plato de cultivo de tejidos de 60 mm, 5 ml de tampón de disociación (B27NBMA, 20-30 U/mL papaína y 2.500 U DNasa I).</li>
	<li>Cortar las cortezas en pedazos pequeños de aproximadamente 1 mm3 usando una hoja de bisturí #15 e incubar durante 20 min a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
	<li>Añadir 1 mL de suero de crecimiento bovina (BGS) para detener la reacción enzimática.</li>
	<li>Transferencia de las cortezas junto con los medios de comunicación de disociación a un tubo cónico de 15 mL con una pipeta serológica de 10 mL.</li>
	<li>Suavemente comienza a disociar el tejido cerebral transfiriendo lentamente hacia arriba y hacia abajo de 6 a 8 veces usando una pipeta serológica de 10 mL, usando cuidado para minimizar las burbujas.</li>
	<li>Permitir que los trozos de tejido para 2-3 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.</li>
	<li>Añadir 3 mL de B27NBMA contiene 10% BGS/2500 U DNasa I para el tejido de pellets.</li>
	<li>Utilizar una pipeta serológica de 5 mL para disociar suavemente el tejido cerebral al pipetear arriba y abajo 6 - 8 veces. Tenga cuidado minimizar las burbujas.</li>
	<li>Permitir que los trozos de tejido colocar 2-3 minutos.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Añadir 3 mL de B27NBMA contiene 10% BGS/DNasa I para el tejido de pellets.</li>
	<li>Disociar el tejido cerebral usando una punta de pipeta P1000, mientras uso la mezcla de medios de comunicación y tejido del cerebro hacia arriba y hacia abajo suavemente. Repetir pasos 2.13 y 2.14 hasta que no queden grandes trozos de tejido o hasta B27NBMA que contiene 10% BGS/DNasa I es agotado, cualquiera viene primero. Tenga cuidado minimizar las burbujas.</li>
	<li>Suspensión de células de piscina con sobrenadantes anteriores.</li>
	<li>Colocar 70 μm células filtro en un tubo de 50 mL. Utilizando una pipeta serológica de 10 mL, pase suavemente la suspensión combinada de células sobre el colador de la célula de 70 μm.</li>
	<li>Lavar el filtro de la célula mediante la adición de 1 mL de B27NBMA contiene 10% BGS/ADNasa I.</li>
	<li>Deseche el filtro de la célula. Llevar el volumen a 30 mL con B27NBMA que contiene 10% BGS/ADNasa I.</li>
	<li>Transferir la suspensión a dos tubos cónicos de 15 mL. Centrifugue la suspensión celular por 10 min a 200 x g.</li>
	<li>Quite el sobrenadante sin salir de las células expuestas al aire. El sobrenadante será nublado debido a restos celulares. Añadir 3 mL de B27NBMA contiene 10% BGS para el pellet.</li>
	<li>Disociar cuidadosamente el sedimento celular utilizando una pipeta P1000. Llevar el volumen a 15 mL con B27NBMA que contiene 10% BGS.</li>
	<li>Pasar la suspensión celular sobre un colador de células frescas de 40 μm.</li>
	<li>Lavar el filtro de la célula mediante la adición de 1mL de B27NBMA contiene 10% BGS. Deseche el filtro de la célula.</li>
	<li>Llevar el volumen a 30 mL con B27NBMA que contiene 10% BGS.</li>
	<li>Transferir la suspensión a tubos cónicos de 2 x 15 mL. Centrifugue la suspensión celular por 10 min a 200 x g.</li>
	<li>Eliminar la mayor parte del sobrenadante sin salir de las células expuestas al aire. Resuspender el pellet celular en 5 mL de hielo frío magnética de la célula clasificación de búfer (MCS).</li>
</ol>3. determinación de conteo celular y viabilidad
<ol><li>Diluir 100 μl de la suspensión de células con 400 μL de solución de azul tripán en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para alcanzar una dilución de 1:5 en 0,4% (w/v).</li>
	<li>Centro de un vidrio de cubierta en una cámara del hemocitómetro y llenar las dos cámaras con 10 μl de la dilución celular utilizando una pipeta P10 y evitando sobrellenar. La solución pasará bajo el vidrio de cubierta por acción capilar.</li>
	<li>Coloque el hemocitómetro en la platina del microscopio y ajustar el foco de 40 aumentos. Nota: Las cuentas de célula se registran utilizando un contador de mano en cada una de cinco plazas (cuatro esquinas y un centro). Sólo células no viables absorben el tinte aparecen azules, mientras que vivo y células sanas aparecen redondos y refractiva y no absorben el tinte de color azul, lo que permite determinar el número de células viables y totales por mililitro.</li>
</ol>4. aislamiento de O4+ oligodendrocitos
<ol><li>Centrifugue la suspensión de células a 200 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Eliminar cuidadosamente el sobrenadante usando extracción con bomba aspirativa, evitando la exposición de las células al aire.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 90 μl de tampón de MCS por 1 x 107 células totales seguido por la adición de 10 μl de anti-O4 perlas por 1 x 107 células.</li>
	<li>Mezclar la suspensión de la célula y los granos por sacudiendo suavemente el tubo cónico de 15 mL con el dedo 4 - 5 veces.</li>
	<li>Incubar la mezcla por 15 min a 4 ° C, agitando el tubo cónico de 15 mL con el dedo 4-5 timesevery 5 min.</li>
	<li>Lavar la mezcla suavemente, añadir 2 mL de tampón de MCS por 1 x 107 células al tubo. Centrifugar la mezcla a 200 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Descartar el sobrenadante cuidadosamente utilizando extracción con bomba aspirativa, evitando la exposición de las células al aire. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de tampón MCS para cada 1 x 107 células.</li>
	<li>Adjuntar un separador magnético para un soporte separador magnético. Conectar una columna de selección para el separador magnético y colocar un filtro de célula 40 μm en la cima de la columna. Coloque dos 15 mL o un tubo cónico de 50 mL por debajo de la columna de la separación para recoger el flujo a través.</li>
	<li>Preenjuague la columna 40 μm células filtro y separación con 3 mL de tampón de MCS y deje el búfer a través de la columna sin dejarlo secar.</li>
	<li>Añadir la mezcla de la suspensión de la célula y los granos a la coladera de la célula y en la columna de selección.</li>
	<li>Lave el filtro de célula μm 40 con 1 mL de tampón MCS.</li>
	<li>Deseche el filtro de la celda y dejar que la mezcla de células, granos y buffer atraviesan la columna sin dejarlo secar.</li>
	<li>Lavar la columna de la separación 3 veces con 3 mL de tampón de MCS y 1 vez con medios de proliferación de OL.</li>
	<li>Quitar la columna de la separación del separador magnético, rápidamente lo coloca en un tubo cónico de 15 mL y añadir 5 mL de medio de proliferación de OL.</li>
	<li>Coloque el émbolo en la cima de la columna y firmemente empuje para eliminar las células marcadas en el tubo cónico de 15 mL.</li>
	<li>Saque 100 μl de suspensión celular para determinar el recuento y viabilidad con azul de tripán y hemocitómetro como se indica en la sección 3. Nota: Viabilidad celular superior al 80% se considera aceptable para proceder con la cultura de OLs y viabilidad mayor al 90% es óptima.</li>
</ol>5. galjanoplastia de O4 aislado+ oligodendrocitos
<ol><li>Diluir la suspensión de células al deseo platear densidad (5 x 105 células por cubreobjetos) utilizando medios de proliferación de OL. Nota: Densidad de siembra es muy importante, para que densidad celular apropiado debe confirmarse mediante un microscopio de cultivo de tejidos antes de proceder. Siembra la densidad por debajo de 10.000 células/cubreobjetos puede conducir a la supervivencia celular pobre. Densidad en 10.000 a 25.000, OL la galjanoplastia diferenciación morfológica es lenta45. Placa de OLs en una densidad de siembra de al menos 50.000 células/cubreobjetos para asegurar la supervivencia de la célula.</li>
	<li>Mover las placas de 24 pocillos que contienen cubreobjetos recubierto con laminina de incubadora a la campana de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Retire cada cubreobjetos de laminina y reemplazarlo con 100 μl de suspensión OL.</li>
	<li>Incubar OLs en la incubadora de2 °C/5% CO 37 para un máximo de 45 min para promover adherencia OL para el cubreobjetos.</li>
	<li>Después de la incubación, retirar las placas de 24 pocillos de la incubadora. Inundación cada bien de la placa de 24 pocillos con 500 μl de medio de proliferación de OL.</li>
	<li>Vuelva a colocar el OLs en la incubadora de2 °C/5% CO 37 24 h adicionales.</li>
	<li>24 h después de la galjanoplastia de OLs, eliminar medios de proliferación y sustituir con los medios de diferenciación OL para inducir la diferenciación.</li>
	<li>Vuelva a colocar el OLs en la incubadora y no se retire hasta que están listas para la fijación de las células. Nota: Cambios en el pH son perjudiciales para la operación y disminuyen la viabilidad celular, por lo tanto debe evitarse la remoción innecesaria de culturas OLs de la incubadora.</li>
</ol>6. tinción de inmunofluorescencia
<ol><li>Para la detección de célula marcadores de superficie (NG2, O1 y O4) quitar los medios de comunicación de los pozos.</li>
	<li>Añadir 250 μl de sobrenadante de hibridoma de ratón que contiene anticuerpos primarios contra O1 (sin diluir)13 y O4 (sin diluir)13 y conejo policlonales contra NG2 (diluido en B27NBMA 1: 150). Nota: Si se utilizan anticuerpos anti-O1 y O4 anti comercialmente disponibles, es aconsejable utilizar diluciones sugeridas por el fabricante.</li>
	<li>Incubar las células con el anticuerpo primario por máxima en un incubador de2 °C/5% CO 37 45 min.</li>
	<li>Lavar dos veces con 0,05% Tween-20 y 1 X PBS. Fijar las células con paraformaldehído al 4% (4% PFA) durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavado tres veces 5 minutos cada uno con 0,05% Tween-20 y 1 X PBS.</li>
	<li>Diluir el conjugado de Alexa 488 cabra anti-ratón IgM o anti-conejo IgG de anticuerpo secundario (1: 400) en B27NBMA.</li>
	<li>Quite el cubreobjetos a 0.05% Tween-20 y 1 X PBS. Incubar las células con el anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lavado tres veces 5 minutos cada uno con 0,05% Tween-20 y 1 X PBS.</li>
	<li>Para la doble tinción para la detección de marcadores internos (GFAP), retire el 0.05% Tween-20 y 1 X PBS y bloque/permeabilizar las células con buffer de bloque/permeabilización durante 15 min a temperatura ambiente. De lo contrario continúe con el paso de 6.17.</li>
	<li>Elimine el bloque/permeabilización de tampón y añadir 250 μl pollo anti-GFAP (1: 100) diluido en buffer de bloqueo/permeabilización.</li>
	<li>Incubar las células con anti-GFAP por 1 h a temperatura ambiente. Lavado tres veces 5 minutos cada uno con 0,05% Tween-20 y 1 X PBS.</li>
	<li>Diluir el cabra conjugado con Alexa 594 anti-pollo IgG anticuerpo secundario (1: 400) en B27NBMA.</li>
	<li>Quite el cubreobjetos a 0.05% Tween-20 y 1 X PBS. Incubar las células con el anticuerpo secundario por 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lavado tres veces 5 minutos cada uno con 0,05% Tween-20 y 1 X PBS.</li>
	<li>Contratinción con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y las células de montaje con montaje de medios que contienen DAPI antifade.</li>
	<li>Deje que el cubreobjetos curan durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.</li>
	<li>Imagen de las células con un microscopio de epifluorescencia. Nota: En el presente Protocolo, las células fueron reflejadas en 40 aumentos con un tiempo de exposición uniforme.</li>
</ol>

Los autores no tienen ninguna revelación.

En esta comunicación, presentamos un método para el aislamiento eficaz de ratón inmaduro altamente purificada oligodendrocyte culturas. Comparado con protocolos previamente publicado39,40, este método produjo una mayor pureza con un nivel mucho más bajo de astrocitos GFAP positivas y un porcentaje muy bajo de otras células no caracterizado. Es importante señalar que estos son inmaduros OLs ya comprometidos con el linaje oligodendroglial. Así, estas células no ser...

Oligodendrocitos (OLs) son las células myelinating del sistema nervioso central (SNC)1. El aislamiento y la cultura de los oligodendrocitos primarios en un entorno fuertemente regulado es una valiosa herramienta para el estudio en vitro del desarrollo de oligodendroglia, así como la biología de enfermedades como la esclerosis múltiple2 desmielinizantes . Esto requiere de un eficiente y robusto del oligodendrocyte aislamiento y cultura método3. En este estudio, aprovechó de la expresión de un marcador superficial de la célula oligodendrocyte distintivo para aplicar una técnica de aislamiento modificado que es rápida y específica.
Se han identificado cuatro diferentes etapas de maduración del oligodendrocyte, cada uno caracterizado por la expresión de marcadores de superficie celular distintiva para cada etapa del desarrollo (figura 1). Estos marcadores de superficie celular pueden ser reconocidos por anticuerpos específicos4,5y se pueden utilizar para aislar OLs en etapas específicas. En la primera etapa, las células del precursor de oligodendrocyte (OPC) tienen la capacidad de proliferar, migrar y específicamente del factor de crecimiento derivado de plaquetas del receptor (PDGF-Rα)6, gangliósido A2B5, proteoglicanos NG27,8 , polysialic ácido-de los nervios de la célula molécula de adhesión9 y grasos ácido proteína-7 (FABP7)10. OPC tiene morfología bipolar con pocos procesos cortos que emanan de los polos opuestos del cuerpo celular, que es característica de precursores neuronales células11.
<img alt="Diagrama de maduración de oligodendrocitos; estadios con marcadores: OPC, Preoligodendrocitos, Inmaduro, Maduro." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Diagrama de maduración de oligodendrocitos; estadios con marcadores: OPC, Preoligodendrocitos, Inmaduro, Maduro."> Figura 1: expresión de marcadores de superficie celular durante el desarrollo del ratón oligodendrocyte. OLs marcadores de superficie de la célula como A2B5, GalC (O1), NG2, O4 y PDGF-Rα pueden utilizarse para aislar específicamente oligodendrocitos en etapa de desarrollo específica mediante el uso de anticuerpos específicos.   <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En la segunda etapa, OPC dan lugar a preoligodendrocytes y expresan en la membrana celular no sólo marcadores OPC, pero también del sulfatide (un galactolipid sulfatada) reconocido por el anticuerpo O412,13y la proteína GPR1714, que persiste hasta la etapa de oligodendrocyte inmaduros (OL). En esta etapa, preoligodendrocytes extender procesos cortos multipolares. Preoligodendrocytes son el escenario OL principales en el día postnatal 2 (P2) en la materia blanca cerebral de rata y ratón con una menor población de inmaduros OLs15.
Durante la tercera etapa, OLs inmaduras continúan express O4, pierden la expresión de marcadores A2B5 y NG2 y comienzan a expresar galactocerebrósido C16. En esta etapa, OLs apuestan por el linaje oligodendroglial y convertirse en células post mitóticas con ramas largas ramificadas17,18. OL inmaduro constituyen más del 80% de la materia blanca roedor en P7, y en este momento se observan las primeras células MBP+ 15,19,20,21. Por lo tanto, el aislamiento de OLs en P7 podría garantizar alto rendimiento celular.
En la cuarta y última etapa del desarrollo de OL, maduro OLs myelinating expresa proteínas (proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), glicoproteína de la mielina asociada (MAG) y del myelin oligodendrocyte glicoproteína (MOG)22,23 ,24,25,26. En esta etapa, madurados OLs extienden las membranas compacto forma enwrapping vainas alrededor de los axones y son capaces de myelinate. Esto coincide con la observación que en cerebro de rata y ratón, MBP+ células se convierten en cada vez más abundantes en la P1419,20,21.
Desde el primer aislamiento de oligodendrocyte Fewster y colegas en 196727, se han implementado varios métodos para el aislamiento de OLs de roedores CNS incluyendo immunopanning28,29,30, celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación aprovechamiento celular antígenos de superficie específicos28,31, centrifugación diferencial de gradiente32,33,34,35 y agitación método basado en la adhesión diferencial de diferentes CNS glia36,37. Sin embargo, los métodos existentes de cultura tienen limitaciones, particularmente en términos de pureza, rendimiento y tiempo necesario para realizar los procedimientos38. Por lo tanto, se requieren métodos más eficientes de aislamiento de oligodendrocitos.
En este trabajo presentamos una simple y método de selección para el aislamiento de Inmunomagnética de etapa tres O4+ las células preoligodendrocytes de crías de ratones neonatales. Este método es una modificación de las técnicas reportadas por Emery et al. 39 y Dincman et al. 40 y una pureza de la preparación de oligodendrocyte superiores al 80% en aproximadamente 4 horas.

<table><tbody><tr><td>Pipetas serológicas de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 10 ml Luer-Loc punta</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; m filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>tubos cónicos de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60 mm placas de cultivo de tejidos</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&micro; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-conejo de cabra anticuerpo secundario IgM (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario de IgM (H+L) anti-conejo de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti-pollo Anticuerpo secundario IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Perlas anti-O4- Anti-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrina humana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil conjunto completo de filtro superior de botella, filtro de 0,22um, 250 ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil filtro superior de botella completo Montaje, 0.22um Filtro, 250ml</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Suero de crecimiento bovino (BGS)</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I (ADNasa I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de epifluorescencia con cámara Olympus DP70</td><td>Bisturíes</td> desechables Olympus <td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>Feather</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio alemán, #1 de grosor, 12 mm de diámetro redondo</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFAP</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>Soporte separador magnético - MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético-MiniSeparador MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22&micro; unidad de filtro m</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje- Prolong Gold con DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-cisteína (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Laminina de ratón natural</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrofina-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Columna de selección-Columnas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Oligoelementos B</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Triyodotironina (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul</td> de <td>Tripán Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487,75 mL medio neurobasal A; 10 mL de suplemento de B27; 1 mL de Primocina; 1,25 mL de Glutamax; Filtre, esterilice y almacene a 4 & grados; C hasta su uso.</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA; 3 mL de suero de crecimiento bovino</td></tr><tr><td>CNTF stock de solución (10 &micro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Pedido de Peprotech (450-50). Envasar de 0,1 a 1 mg/ml según el fabricante. s (puede variar de un lote a otro) en el búfer (por ejemplo, DPBS + 0,2% BSA). Almacenar a -80 &deg;C. Solución de trabajo (10 &micro; g/ml, 1000X) 1. Hacer con 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) en solución de DPBS y filtro de esterilización. 2. Diluir la alícuota del material maestro a 10&micro; g/ml en estéril, refrigerado 0.2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (20&micro; l/tubo) y congele a presión en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>d-Solución madre de biotina (50 &micro; g/ml; 5000X)</td><td></td><td></td><td>Resuspender d-Biotina (Sigma-B4639) en H2O de doble destilación a 50 &micro; g/ml (por ejemplo, 2,5 mg en 50 ml de ddH2O). La resuspensión puede requerir una buena cantidad de agitación/vórtice, o un calentamiento leve brevemente a 37 ° C. Si la d-biotina aún no se solubiliza, está bien hacer una concentración menos concentrada (por ejemplo, 10 y micro; g/ml), y añadir un mayor volumen al B27NBMA (1/1000), en lugar de 1/5000). Almacenar a 4&deg;C.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>madre de DNasa I</td><td>1. Disolver a 12.500 U Desoxirribonucleasa I/ml en HBSS enfriado sobre hielo. 2. Filtro esterilizar en hielo 3. Alícuota a 200 &micro; l y congelar durante la noche a -20 ° C. 4. Guarde las alícuotas a -20 a -30 °C.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (sin Ca2+ y Mg2+)</td><td></td><td></td><td>Disuelva la bolsa en 1 litro de agua para producir 1 litro de medio a 9,6 gramos de polvo por litro de medio. Almacene a 2-8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Solución madre de forskolina (4,2 mg/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Añadir 1 ml de DMSO estéril a 50 mg de forskolina en el frasco (Sigma-F6886) y pipetear hasta que se vuelva a suspender. Transfiera a un tubo de centrífuga de 15 ml y agregue 11 ml de DMSO estéril para obtener 4,2 mg/ml. Alícuota (p. ej. 20 y micro; l) y almacenar a -20°C.</td></tr><tr><td>Hank' s sales equilibradas (HBSS) (Sigma</td><td></td><td></td><td>1. Mida 900 ml de agua (temperatura 15-20 &deg; C) en un cilindro y remover suavemente. 2. Agregue la potencia y revuelva hasta que se disuelva. 3. Enjuague el paquete original con una pequeña cantidad de agua para eliminar todos los rastros del polvo. 4. Agregue a la solución en el paso 2. 5. Añadir 0,35 gr de bicarbonato de sodio (7,5% p/v) por cada litro de volumen final. 6. Siga revolviendo hasta que se disuelva. 7. Ajuste el pH del tampón mientras agita a 0,1-0,3 unidades por debajo de pH= 7,4, ya que puede aumentar durante la filtración. Se recomienda el uso de HCl 1N o NaOH 1N para ajustar el pH. 8. Agregue agua adicional para llevar el volumen final a 1L. 9. Esterilizar por filtración utilizando una membrana con una porosidad de 0,22 micras. 10. Almacene a 2-8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Solución madre de insulina (4000 y micro; g/ml)</td><td></td><td></td><td>Descongele la botella y alícuota 25 &micro; l por tubo de microcentrífuga y almacenar a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de laminina <td>Descongele lentamente la laminina en frío (2 & grados; C a 8 grados; C) para evitar la formación de gel. Luego, alícuota en tubos de polipropileno. Tienda a 5&deg; C a -20 grados; C en alícuotas (por ejemplo, 20 y micro; l) y no congele/descongele repetidamente. La laminina puede almacenarse a estas temperaturas hasta por seis meses.</td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td><td>de clasificación de células magnéticas (MCS)</td><td>Prepare la solución que contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 y albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%, EDTA 0,5 mM, 5&micro; g/ml de insulina, 1 g/l de glucosa. Esterilizar y desgasificar por filtración el tampón pasándolo a través de un 0.22 &micro; m Filtro Millex. Guarde el tampón a 4 grados; C hasta el uso</td></tr><tr><td>de la solución madre de N-acetil-L-cisteína (NAC) (5 mg/ml; 1000X)</td><td></td><td></td><td>Disuelva la N-acetil-L-cisteína (Sigma-A8199) a 5 mg/ml en DMEM (por ejemplo, 50 mg de NAC en 10 ml B27NBMA). Filtro de esterilización y alícuota (p. ej. 20 y micro; l). Almacene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Solución madre NT3 (1 y micro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>Stock principal: Pedido de Peprotech (450-03). Envasar de 0,1 a 1 mg/ml según el fabricante. (puede variar de un lote a otro), en el búfer (por ejemplo, DPBS + 0,2% BSA). Almacenar a -80&deg;C. Stock de trabajo (1&micro; g/ml; 1000X): 1. Hacer con 0.2% BSA en solución DPBS y esterilizar por filtro. 2. Diluir la alícuota del material maestro a 1 &micro; g/ml en estéril, refrigerado 0.2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (por ejemplo, 20&micro; l/tubo) y congele a presión en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 ° C.</td></tr><tr><td>Solución madre de PDGF (10 &micro; g/ml; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>Stock principal: Pedido de Peprotech (100-13A). Envasar de 0,1 a 1 mg/ml según el fabricante. s (pueden variar de un lote a otro) en búfer (por ejemplo, DPBS) + 0,2% BSA). Almacenar a -80&deg;C. Stock de trabajo (1&micro; g/ml; 1000X): 1. Hacer con 0.2% BSA en solución DPBS y esterilizar por filtro. 2. Diluir la alícuota del material maestro a 1&micro; g/ml en estéril, refrigerado 0.2% BSA/DPBS. 3. Alícuota (por ejemplo, 20&micro; l/tubo) y congele a presión en nitrógeno líquido. 4. Almacene las alícuotas a -80 ° C.</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina (1 mg/ml; 100X)</td><td></td><td></td><td>Resuspender poli-D-lisina, peso molecular 70-150 kD (Sigma P6407) a 0,5 mg/ml en ácido bórico 0,15M pH 8,4 (por ejemplo, 50 mg en tampón borato 50 ml). Filtro de esterilización y alícuota (p. ej. 100&micro; l/tubo). Almacene a -20 ° C. Antes de usar, diluya el caldo 100X (1 mg / ml) a 50 ° C; g/ml en agua estéril.</td></tr><tr>Medios <td></td><td></td> de <td>proliferación de oligodendrocitos</td><td>ver <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Tabla suplementaria 1</a></td></tr><tr><td>Medios</td><td></td><td></td> de diferenciación de oligodendrocitos <td>ver <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Tabla suplementaria 1</a></td></tr><tr><td>Suplemento de Sato (100X)</td><td></td><td></td><td>ver <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">Tabla suplementaria 1</a></td></tr><tr><td>Referencias: la lista de reactivos y recetas se adoptó de los protocolos previamente descritos por Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purificación de células del linaje de oligodendrocitos de cortezas de ratón mediante inmunopanning. Primavera Fría Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) y Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos corticales de ratón. J Métodos Neurosci. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

El aislamiento eficiente y robusto y la cultura de los oligodendrocitos primarios (OLs) es una herramienta valiosa para el estudio en vitro del desarrollo de oligodendroglia, así como la biología de demyelinating enfermedades como la esclerosis múltiple y Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher-como (PMLD). Aquí, presentamos un simple y método de selección para el aislamiento de Inmunomagnética de etapa tres O4+ las células preoligodendrocytes de crías de ratones neonatales. Desde OL inmaduro constituyen más del 80% de la materia blanca de cerebro de roedor en el día postnatal 7 (P7) este método de aislamiento no sólo asegura alto rendimiento celular, sino también el aislamiento específico de OLs ya comprometida con el linaje oligodendroglial, disminuyendo la posibilidad de aislar células contaminantes tales como astrocitos y otras células del cerebro de ratón. Este método es una modificación de las técnicas divulgado previamente y proporciona pureza de oligodendrocyte preparación superior al 80% en aproximadamente 4 horas.

El propósito de este estudio fue establecer un método de aislamiento mejorado de O4+ oligodendrocitos primario de ratón que requieren la manipulación lo menos posible de las células diana. Todo el procedimiento de eutanasia de los cachorros para el revestimiento de las células en cubreobjetos toma aproximadamente 4 horas y datos presentados aquí representan tres experimentos independientes. Después de la disociación del tejido, un promedio de 4,3 ± 0,46 x 107 células...

Describimos el aislamiento Inmunomagnética de los oligodendrocitos primario de ratón, que permite el aislamiento rápido y específico de las células para el cultivo en vitro .

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

El objetivo general de esta técnica es utilizar el aislamiento inmunomagnético para seleccionar oligodendrocitos O4 positivos de crías de ratones neonatos para su análisis de cultivo in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ciencia neural relacionadas con el estudio de las enfermedades que afectan a la mielina y la mielinización. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la preparación del cultivo final de oligodendrocitos de una pureza superior al 80% en aproximadamente una hora hora.Comience usando pequeñas tijeras de disección para cortar la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo de un ratón de día cinco a siete después del parto. Retraiga el colgajo de piel para exponer el cráneo y corte el cráneo con cuidado a lo largo de la línea media desde la abertura en la espalda hasta el área frontal. Desde la abertura en la parte posterior del cráneo, corte hacia cada cuenca del ojo a lo largo de la base del hueso y use pinzas finas para separar suavemente las cortezas del mesencéfalo.Luego, transfiera las cortezas a una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros que contenga siete mililitros de medio B-27 Neurobasal A.

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este video, describimos un protocolo para aislar células CD11b, incluida la microglía, de cerebros de cachorros de ratón utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente. Los tejidos cerebrales se homogeneizan para obtener suspensiones unicelulares, que se incuban con microesferas recubiertas de anticuerpos anti-CD11b, seguidas de una separación basada en columna magnética para purificar la población de células CD11b+.

Aislamiento magnético de microglía a partir de cerebros de cachorros de ratón

Este video muestra una técnica para aislar y cultivar células precursoras de oligodendrocitos (OPCs) de la corteza cerebral de una cría de ratón.

Aislamiento y cultivo de células precursoras de oligodendrocitos de la corteza cerebral de cachorros de ratón

Este video muestra un método para aislar células primarias de oligodendrocitos de una suspensión de células neuronales obtenida de una cría de ratón utilizando separación magnética. La técnica emplea perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos específicos contra los antígenos de los oligodendrocitos, lo que permite el aislamiento selectivo de estas células.

Aislamiento de oligodendrocitos primarios murinos mediante perlas inmunomagnéticas

Este video muestra un protocolo para extraer células microgliales de lesiones desmielinizantes en cerebros de ratones utilizando la clasificación magnética de células. El protocolo consiste en diseccionar el tejido cerebral lesionado que contiene células microgliales, tratar el tejido con enzimas específicas para obtener una suspensión unicelular y utilizar perlas magnéticas específicas del receptor microglial para aislar las células microgliales.

Aislamiento de microglía de lesiones desmielinizantes del cerebro de ratón mediante clasificación de células activadas magnéticamente

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.

Aislamiento de microglia específica de la región del hemisferio cerebral de un ratón adulto para la secuenciación profunda del ARN de una sola célula

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y purificar la microglía primaria en modelos animales de enfermedades desmielinizantes, utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente columnares.

Aislamiento de la microglía primaria del ratón mediante clasificación celular activada magnéticamente en modelos animales de desmielinización

Hasta la fecha, los protocolos para el aislamiento simultáneo de todos los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central del mismo ratón son una demanda insatisfecha. El protocolo muestra un procedimiento aplicable en ratones con encefalomielitis autoinmune naïve y experimental para investigar redes celulares complejas durante la neuroinflamación y, al mismo tiempo, reducir el número de ratones requerido.

Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Aprende el aislamiento inmunomagnético de oligodendrocitos primarios de ratón para estudios de mielinización y neurociencia. Este método logra más del 80% de pureza en aproximadamente una hora.

Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

Explorar más videos