Aislamiento Inmunomagnética rápida y específica de los oligodendrocitos primarios de ratón

El objetivo general de esta técnica es utilizar el aislamiento inmunomagnético para seleccionar oligodendrocitos O4 positivos de crías de ratones neonatos para su análisis de cultivo in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ciencia neural relacionadas con el estudio de las enfermedades que afectan a la mielina y la mielinización. La principal ventaja de esta técnica es que facilita la preparación del cultivo final de oligodendrocitos de una pureza superior al 80% en aproximadamente una hora hora.

Comience usando pequeñas tijeras de disección para cortar la piel a lo largo de la línea media del cuero cabelludo de un ratón de día cinco a siete después del parto. Retraiga el colgajo de piel para exponer el cráneo y corte el cráneo con cuidado a lo largo de la línea media desde la abertura en la espalda hasta el área frontal. Desde la abertura en la parte posterior del cráneo, corte hacia cada cuenca del ojo a lo largo de la base del hueso y use pinzas finas para separar suavemente las cortezas del mesencéfalo.

Luego, transfiera las cortezas a una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros que contenga siete mililitros de medio B-27 Neurobasal A. Cuando se hayan recolectado todos los cerebros, transfiera las cortezas a una nueva placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros que contenga cinco mililitros de tampón de disociación y use una hoja de bisturí número 15 para cortar las cortezas en pedazos de un milímetro al cubo. Incube las piezas de cerebro en una incubadora de CO2 al 5% de 37 grados centígrados durante 20 minutos.

A continuación, añade un mililitro de Suero de Crecimiento Bovino para detener la reacción enzimática. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, transfiera la suspensión de tejido a un tubo cónico de 15 mililitros y disocie suavemente el tejido cerebral de seis a ocho veces con pipeteo. Deje que los trozos de tejido disociados se asienten durante dos o tres minutos.

Luego, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, añada tres mililitros de Neurobasal A Medium, suplementado con Suero de Crecimiento Bovino y DNasa I a los tejidos, y utilice una pipeta de cinco mililitros para disociar suavemente los tejidos con más pipeteo. Verá, la fuerza de pipeteo adecuada es crucial para garantizar un alto rendimiento de células viables.

Si el pipeteo es demasiado duro, la viabilidad puede ser baja. Mientras que si el pipeteo es demasiado suave, el rendimiento celular puede ser bajo. Deje que los trozos de tejido se asienten durante otros dos o tres minutos.

A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y añada tres mililitros de Medio Neurobasal A fresco, suplementado con Suero de Crecimiento Bovino y DNasa I al tejido. Disocie suavemente el tejido cerebral con una punta de pipeta P-1000 hasta que no quede ningún trozo grande de tejido, teniendo cuidado de evitar burbujas. Utilice una pipeta de 10 mililitros para filtrar la solución celular a través de un filtro celular de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros, y lleve el volumen final de la suspensión unicelular a 30 mililitros con Neurobasal A Medio fresco, complementado con Suero de Crecimiento Bovino y DNasa I. Divida la suspensión celular en dos tubos cónicos de 15 mililitros, y pellet las células neurales por centrifugación.

Retire todos los microlitros, excepto los últimos cinco a 10 microlitros de sobrenadante turbio y agregue tres mililitros de Medio Neurobasal A suplementado con Suero de Crecimiento Bovino a las células. Vuelva a suspender con cuidado el pellet de células y eleve el volumen final a 15 mililitros con Neurobasal A Medium fresco que contiene un 10% de suero de crecimiento bovino. Filtre la solución celular a través de un filtro celular de 40 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y eleve el volumen final a 30 mililitros con Neurobasal A Medium fresco que contiene un 10% de suero de crecimiento bovino.

A continuación, divida la suspensión de células filtradas entre dos tubos cónicos de 15 mililitros para la centrifugación. y vuelva a suspender los gránulos en 2,5 mililitros de tampón de clasificación de células magnéticas heladas antes de agrupar las células. Después de contar, centrifugue las celdas nuevamente y vuelva a suspender el pellet en 90 microlitros de tampón de clasificación de celdas magnéticas frescas por una vez 10 a las siete celdas.

A continuación, agregue 10 microlitros de perlas anti-04 por una vez 10 a las siete celdas, y mezcle la solución celular con un suave golpeteo. Después de 15 minutos a cuatro grados centígrados con un suave movimiento cada cinco minutos, agregue suavemente dos mililitros de tampón de clasificación de células magnéticas por una vez 10 a las siete celdas para un lavado por centrifugación y deseche el sobrenadante mediante una aspiración ventosa cuidadosa. Vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de clasificación de celdas magnéticas nuevo por cada una de 10 a las siete celdas, y coloque una columna de clasificación de perlas magnéticas de tamaño adecuado en su separador magnético correspondiente.

Coloque un colador de 40 micras en la columna y enjuague previamente el colador con tres mililitros de tampón de clasificación de celdas magnéticas, dejando que el tampón corra a través de la columna sin dejar que la columna se seque. Agregue las células al colador, seguido de un lavado de un mililitro con tampón de clasificación de celdas magnéticas. Lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón de clasificación de células magnéticas por lavado y una vez con medio de proliferación de oligodendrocitos.

Luego, transfiera la columna a un tubo de 15 mililitros y use el émbolo para enjuagar inmediatamente cinco mililitros de medio de proliferación de oligodendrocitos frescos a través de la columna. Después de contar, diluya las células a una densidad de recubrimiento adecuada y reemplace la laminina de los cubreobjetos prerrecubiertos en una placa de 24 pocillos con 100 microlitros de medio de proliferación de oligodendrocitos. Incubar los oligodendrocitos a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante no más de 45 minutos para promover la adhesión de los oligodendrocitos a los cubreobjetos.

Luego, inunde cada pocillo de la placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medio de proliferación de oligodendrocitos para una incubación de 24 horas. Al día siguiente, reemplace los sobrenadantes con medio de diferenciación de oligodendrocitos y devuelva las células a la incubadora hasta que estén listas para la fijación. 24 horas después de la siembra, las células parecen ser bipolares o tripolares bajo microscopía de contraste de fase, un rasgo característico de los oligodendrocitos proliferantes en etapa temprana.

La tinción con inmunofluorescencia muestra que 24 horas después de la siembra, la mayoría de estos pre-oligodendrocitos también muestran un marcaje de NG2 y O4, mientras que el marcaje con GFAP y anticuerpos anti-01 es mucho menos común, lo que sugiere que la mayoría de las células en esta etapa son pre-oligodendrocitos con pocos oligodendrocitos inmaduros o maduros. A las 72 horas, la morfología de los oligodendrocitos parece ser más compleja que a las 24 horas, y hay una frecuencia mucho menor de células positivas para el marcador temprano de oligodendrocitos, NG2. Además, la mayoría de las células muestran un marcado de O4, y casi la mitad de las células se tiñeron para el anticuerpo 01 en esta etapa, lo que sugiere que las células se están diferenciando hacia un fenotipo más maduro.

En particular, la presencia de astrocitos sigue siendo extremadamente baja. Estos resultados indican que, con el tiempo, los oligodendrocitos inmunomagnéticamente aislados son capaces de diferenciarse in vitro en la tercera etapa de maduración con muy poca contaminación de otros tipos de células, como los astrocitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar oligodendrocitos primarios de crías de ratones neonatales mediante aislamiento inmunomagnético.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en cuatro horas, si se realiza correctamente. Gracias por mirar. Buena suerte con tus experimentos.