Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein System zur Erzeugung unmarkierter Mutanten in den cyanobakteriellen Synechocystis-Spezies PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus-Spezies PCC7002 zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Cyanobakteriengenetik zu beantworten. Zum Beispiel, wie man chromosomale Veränderungen in einen Stamm einführt.

Durch Insertion eines Antibiotikaresistenzgens, gefolgt von einer anschließenden Entfernung dieser Kassette, unter Verwendung eines negativ selektierbaren Markers. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stämme wiederholt genetisch manipuliert werden können. So können so viele Wechsel in eine Dehnung eingeführt werden, wie gewünscht.

Nach der Vorbereitung des Mediums, Cyanobakterienstämme und Plasmide, gemäß dem Textprotokoll. Richten Sie eine Frischkultur ein, indem Sie eine Schlinge voller Cyanobakterienzellen in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Wachsen Sie die Kultur zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius im Licht auf einen OD7500, der 0,2 bis 0,6 entspricht.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie ein bis zwei Milliliter der Kultur bei 2.300 g für fünf Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie BG11 Medium, um die Pellets einmal zu waschen, und pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren. Da das Vortexen zum Verlust von Pili führen kann, die für die DNA-Aufnahme unerlässlich sind.

Nachdem Sie die Zellen erneut pelletiert und den Überstand entfernt haben, fügen Sie BG11-Medium zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern hinzu und geben Sie die Zellen in ein 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen. Geben Sie anschließend 1 Mikrogramm des zuvor vorbereiteten Plasmids A zu den Zellen. Und zum Mischen sanft klopfen.

Legen Sie dann die Röhrchen waagerecht bei 30 Grad Celsius in den Inkubator und inkubieren Sie sie vier bis sechs Stunden lang. Nach der Inkubation aliquot des Zellkulturplasmid-DNA-Gemisches ohne Antibiotika auf BG11-Agarplatten verteilen. Und bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Bereiten Sie etwa 24 Stunden später eine 0,6%ige Agarlösung in kanamycinhaltigem Wasser vor. Und lassen Sie es auf 42 Grad Celsius abkühlen. Geben Sie dann 2,5 bis drei Milliliter an die Ränder der Kulturplatten und kippen Sie die Platte, so dass die Lösung eine gleichmäßige obere Agarschicht auf der Oberfläche bildet.

Inkubieren Sie die Platten etwa sieben Tage, damit die Bienenvölker sichtbar sind. Teilen Sie dann eine frische BG11-Agar-plus-Kanamycin-Platte in sechs Sektoren auf. Und verwenden Sie einen Zahnstocher mit stumpfem Ende, um einzelne Kolonien auszustechen.

Um die PCR durchzuführen und den markierten Knockout zu bestätigen, wird eine kleine Menge Zellen in ein Röhrchen mit 50 Mikrolitern Wasser und etwa 20 425 bis 600 Mikrometer großen Glasperlen überführt. Schütteln Sie die Zellen und Kügelchen fünf Minuten lang bei etwa 2.000 U/min, bevor Sie sie fünf Minuten lang bei 15.700 g drehen. Verwenden Sie dann fünf Mikroliter des Überstands, um 50-Mikroliter-PCR-Reaktionen mit Heft-DNA-Vorübungen vorzubereiten.

Um die Mutanten zu validieren, wird nach dem Entwerfen von Primern gemäß dem Textprotokoll das Produkt mit dem folgenden Programm amplifiziert und eine Wildtyp-Kontrolle eingeschlossen. Durch Gelelektroforesen wird der Genotyp von Knockout-Transformanten überprüft. Es zeigt eine Bande von etwa vier Kilobasenpaaren, in der die Wildtyp-Bande fehlt.

Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. Wenn noch eine Wildtyp-Bande vorhanden ist, streichen Sie den Stamm erneut auf die frische Platte und wiederholen Sie die PCR. Wiederholen Sie den Validierungsprozess, bis die Mutante segregiert ist und keine Wildtyp-Bande in der PCR-Reaktion beobachtet wird.

Bei einer Sorte, die ein ausgeprägtes mutiertes Profil aufweist, sollten Sie auf einer frischen Platte erneut streifen, um einen unmarkierten Knockout zu erzeugen. Um unmarkierte Synechocystis-Mutanten zu erzeugen, richten Sie eine frische Kultur des markierten Knockouts ein, indem Sie die mit Zellen gefüllte Schlinge in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Vergrößern Sie die Kultur zwei bis drei Tage lang auf OD750, was 0,2 bis 0,6 entspricht.

10 Milliliter der Kultur bei 2.300 g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Anschließend verwenden Sie BG11 Medium, um die Zellen schonend zu waschen. Nachdem Sie BG11 zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern hinzugefügt und die Zellen in ein 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen übertragen haben, fügen Sie den Zellen 1 Mikrogramm Plasmid-B-DNA hinzu und klopfen Sie vorsichtig ab, um sich zu mischen.

Legen Sie dann die Röhrchen horizontal in den Inkubator und inkubieren Sie sie vier bis sechs Stunden lang. Nach der Inkubation werden 1,8 Milliliter BG11-Medium zugegeben und die Proben insgesamt vier Tage lang unter Schütteln inkubiert. Dies ist eine ausreichende Zeit, um die Rekombination in den multiplen Chromosomenkopien zu ermöglichen.

50, 10 und 1 Mikroliter Aliquots der transformierten Kultur auf BG11 plus 5%ige Saccharose-Agarplatten auffüllen und etwa sieben Tage lang inkubieren, um einzelne Kolonien zu erzeugen. Als nächstes brütet man mit einem Zahnstocher mit stumpfem Ende 30 bis 50 einzelne Kolonien auf BG11 plus Kanamycin-Platten aus. Dann auf BG11 plus 5 % Saccharose auffrischen.

Völker, die auf BG11 plus Saccharose, aber nicht auf Platten mit Kanamycin wachsen, sind potentiell unmarkierte Knockouts. Kolonien, die auf beiden Platten wachsen, sind wahrscheinlich aufgrund einer Mutation im sacB-Gen saccharoseresistent. Verifizieren Sie nach der PCR-Methode, die weiter oben in diesem Video demonstriert wurde, unmarkierte Knockouts, wodurch eine Gelbande erzeugt wird, die der Wildtyp-Größe abzüglich der deletierten Region entspricht.

Wenn der Stamm ein unmarkiertes Mutantenprofil zeigt, dann erneut auf frischen BG11-Agar ohne Antibiotika aufstreifen. Um die Stämme langfristig zu lagern, richten Sie eine frische Kultur des Stammes ein, indem Sie eine Schlinge voller Zellen in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Vergrößern Sie die Kultur drei bis vier Tage lang auf einen OD750-Wert von 0,4 bis 0,7.

Nachdem Sie die Zellen einmal mit BG11 gewaschen haben, resuspendieren Sie das Pellet in etwa zwei Millilitern BG11. Geben Sie 0,8 Milliliter der konzentrierten Zellen in ein Röhrchen. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter 80% filtersterilisiertes Glycerin hinzu.

In ein anderes Röhrchen geben Sie 0,93 Milliliter konzentrierte Zellen und 0,07 Milliliter DMSO. Lagern Sie beide Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Um die Stämme wiederzubeleben, entfernen Sie das Röhrchen und kratzen Sie mit einem Zahnstocher mit stumpfem Ende einige Zellen ohne Antibiotika auf einer Agarplatte ab.

Verwenden Sie dann eine sterile Schlaufe, um sie wie gewohnt herauszuziehen. Diese Abbildung zeigt Beispiele für die Plasmide A und B, die zur Erzeugung von Deletionsmutanten verwendet wurden. In jedem Fall handelt es sich bei den fünf Prime- und drei Prime-Planking-Bereichen um etwa 900 bis 1.000 Basenpaare.

Plasmid B kann auch eine Genkassette zwischen den fünf Primzahlen und drei Primzahlen enthalten, die etwa ein Kilobasenpaar flankieren. Oder eine modifizierte Version der nativen Gensequenz. Bei der Transformation mit Plasmid A erscheinen nach sieben bis 10 Tagen mehrere hundert Völker auf einer Platte.

Wenn Gene nicht essentiell sind und Mutanten ähnlich wie der Wildtyp-Stamm Wachstum zeigen, sollten alle Chromosomen eine kopierte npt1/sacB-eingefügte Sequenz enthalten, die mittels PCR bestimmt wurde. Wenn Gene nicht essentiell sind und Mutanten langsam wachsen, dann sind mehrere Runden des erneuten Streifens mit steigenden Konzentrationen von Kanamycin notwendig, um eine segregierte markierte Mutante zu erhalten. Wenn beim erneuten Streifen keine markierte Mutante erhalten wird, ist das Gen wahrscheinlich überlebenswichtig.

Die Mehrzahl der einzelnen Kolonien, die durch Transformation mit Plasmid B gewonnen werden, sind Kanamycin-sensitiv und Saccharose-resistent. Wie hier gezeigt, zeigt die PCR-Amplifikation der Zielregion in diesen Kolonien, dass fast 100% der unmarkierten Mutanten ein Profil aufweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in Stunden über einen Zeitraum von sechs Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine sterile Technik zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Messung der Sauerstoffproduktion oder die Gaschromatographie-Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie z.B. die Messung der Photosyntheseraten oder der Metabolitenproduktion. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Cyanobakteriengenetik.

Erforschung wichtiger biochemischer und physiologischer Prozesse in diesem Stamm und Entwicklungsstämme für industrielle Zwecke. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unmarkierte Knockouts bei Synechococcus-Spezies PCC6803 erzeugt.