Name: Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung markierter und markierfreier Mutanten in Cyanobakterien. Diese Methode ermöglicht wiederholte genetische Manipulation von Synechocystis sp. PCC6803 und Synechococcus sp. PCC7002 für Grundlagenforschung.

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Wir sind dankbar, dass der Umwelt Services Association Education Trust, der Synthetischen Biologie in Cambridge SynBio Fonds und des Ministeriums für soziale Gerechtigkeit und Übertragung von Verantwortung, Regierung von Indien, für die finanzielle Unterstützung.

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<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
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<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von nicht markierten Mutanten sind: 1) vorsichtig Plasmid-Design, um sicherzustellen, nur die Zielregion verändert wird; 2) sicherzustellen, dass die Proben bleiben axenic, vor allem, wenn die Kultur auf Saccharose; 3) plating Zellen für markierte Mutante Generation zunächst auf Agarplatten BG11 transformiert Antibiotika, gefolgt von der Zugabe von Agar und Antibiotika 24 Stunden später fehlen; 4) markierte Kultivierung Mutanten für 4 volle Tage vor auf BG11 und Saccharose-Agar...

Cyanobakterien sind eine evolutionär alten und unterschiedlichen Stamm der Bakterien in fast allen natürlichen Umwelt auf der Erde gefunden. In marinen Ökosystemen sind sie besonders reichlich vorhanden und spielen eine Schlüsselrolle in vielen Nährstoffkreisläufe spielen, für etwa die Hälfte der Kohlenstoff - Fixierung entfallen 1, die Mehrheit der Stickstofffixierung 2 und Hunderte von Millionen von Tonnen an Kohlenwasserstoffproduktion 3 in den Ozeanen jährlich. Chloroplasten, die Organell verantwortlich für die Photosynthese in eukaryotischen Algen und Pflanzen, sind wahrscheinlich von einem Cyanobakterium entwickelt zu haben , die vier von einem Wirtsorganismus verschlungen wurde. Cyanobakterien haben sich als nützlich erwiesen Modellorganismen für die Untersuchung der Photosynthese, Elektronentransport 5 und biochemischen Wege, von denen viele in Pflanzen konserviert sind. Darüber hinaus Cyanobakterien werden zunehmend für die Herstellung von Lebensmitteln verwendet werden, Biokraftstoffe 6, Strom 7 und Industrieverbindungen 8, die aufgrund ihrer halloghly effiziente Umwandlung von Wasser und CO 2 in Biomasse Solarenergie 9 verwenden. Viele Arten können auf Nicht-Ackerland mit minimalen Nährstoffe und Meerwasser gezüchtet werden, dass Cyanobakterien was darauf hindeutet, möglicherweise in großem Umfang angebaut werden könnten, ohne die landwirtschaftliche Produktion zu beeinträchtigen. Bestimmte Arten sind auch Quellen von natürlichen Produkten, einschließlich Antimykotika, antibakterielle und Anti-Krebs - Verbindungen 10,11. Die Fähigkeit, Mutanten zu erzeugen, ist der Schlüssel zum Verständnis cyanobakteriellen Photosynthese, der Biochemie und Physiologie und essentiell für die Entwicklung von Stämmen für industrielle Zwecke. durch Einfügen eines Antibiotikaresistenzkassette in den Ort von Interesse, die Mehrheit der veröffentlichten Studien erzeugen genetisch Stämme modifiziert. Dies begrenzt die Anzahl von Mutationen, die in einen Stamm eingeführt werden kann, da nur wenige Antibiotikaresistenz Kassetten zur Verwendung in Cyanobakterien verfügbar sind. Die Stämme Gene, Antibiotika re enthält,Beständigkeit kann nicht für die industrielle Produktion in offenen Teichen verwendet werden, die die einzigen kosteneffektiven Mittel , um wahrscheinlich 12 Biokraftstoffe und andere geringwertige Produkte zu erzeugen. Die Erzeugung von nicht markierten Mutanten überwindet diese Einschränkungen. Nicht markierte Mutanten enthalten keine Fremd-DNA, sofern nicht absichtlich enthalten und kann mehrfach manipuliert werden. Daher ist es möglich, so viele Veränderungen in einem Stamm zu erzeugen, wie gewünscht. Zusätzlich nachgeschalteten polaren Effekte auf Gene der Modifikationsstelle minimiert werden, präziser Modifikation des Organismus 13 ermöglicht. In den Mutantenstämmen, suicide Plasmiden, die zwei DNA-Fragmente identisch zu Regionen im cyanobakteriellen Chromosom flankieren das Gen deletiert werden (bezeichnet als die 5&#39;- und 3&#39;-flankierende Bereiche) zuerst konstruiert erzeugen. Zwei Gene werden dann zwischen diesen flankierenden Regionen eingeführt. Eines davon codiert eine antibiotische Resistenz-Protein; der zweite kodiert SacB, die produces Levansucrase, verleihen eine Verbindung Empfindlichkeit gegenüber Saccharose. In der ersten Stufe des Verfahrens, markierte Mutanten, enthält also Stämme einige fremde DNA, erzeugt. Das Plasmid-Konstrukt wird mit den Cyanobakterien-Zellen gemischt, und die DNA wird auf natürliche Weise durch den Organismus aufgenommen. Transformanten werden durch Wachstum auf Agar-Platten, die das entsprechende Antibiotikum und das mutierte Genotyp durch PCR verifiziert ausgewählt. Suicide Plasmide können nicht innerhalb der Stamm von Interesse replizieren. Daher irgendwelche Antibiotika-resistente Kolonien werden aus einem Rekombinationsereignis führen, wobei das interessierende Gen in das Chromosom eingefügt in. Zur Erzeugung nicht markierten Mutanten wird die markierte Mutante dann mit einem zweiten Selbstmord Plasmid gemischt, die nur die 5 &#39;und 3&#39; flankierenden Regionen. wenn Insertion von Fremd-DNA jedoch erforderlich ist, ein Plasmid, bestehend aus den 5&#39;- und 3&#39;-flankierenden Regionen mit einer Kassette, die die Gene von Interesse zwischen diesen DNA-Fragmente eingefügt enthalten, können verwendet werden. Selection ist über Wachstum auf Agar-Platten, die Saccharose. Wie Saccharose auf Zellen letal ist , wenn das sacB Gen - Produkt exprimiert wird, daß die nur Zellen überleben , sind jene , in denen ein zweites Rekombinationsereignis stattgefunden hat, wobei die Saccharose Empfindlichkeitsgens, zusätzlich zu dem Antibiotika - Resistenzgen, aus dem rekombinierten wurde Chromosom und auf dem Plasmid. Als Folge der rekombinatorischen Austausch, die flankierenden Regionen und jede DNA zwischen ihnen werden in das Chromosom inseriert. Wir haben erfolgreich diese Methoden zu generieren mehrere chromosomale Mutationen in dem gleichen Stamm von Synechocystis sp. PCC6803 (nachfolgend als Synechocystis) 13,14, einzelne Punktmutationen in einem Gen von Interesse 13 und für die Expression von Genkassetten einzuführen. Während Generation von unmarkierten Vorprägungen hat vor unserer Arbeit in Synechocystis 15,16, eine detaillierte Methode nachgewiesen wurde, unterstützt durcheine visuelle Darstellung der kritischen Schritte, ist nicht öffentlich verfügbar. Wir haben galt auch die gleiche Methode zur Erzeugung von markierten Vorprägungen in einem anderen Modell Cyanobakterium, sp Synechococcus. PCC7002 (nachstehend als Synechococcus). Dieses Protokoll stellt eine klare, einfache Methode für Mutanten und ein schnelles Protokoll zur Validierung und Speicherung dieser Stämme zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Eisenammoniumcitrat</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamin</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 90 mm dreifach belüftet</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filters</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Konuskolben</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>sulfat Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m Glasperlen</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstofflampen</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT Multitron Photobioreaktor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von marked und markerless mutants in modell cyanobakterienarten

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobakterien sind ökologisch wichtige Organismen und potentielle Plattformen für die Herstellung von Biokraftstoffen und nützlichen Industrieprodukten. Die genetische Manipulation von Cyanobakterien, insbesondere von Modellorganismen wie Synechocystis sp. PCC6803 und Synechococcus sp. PCC7002, ist ein wichtiges Instrument sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die angewandte Forschung. Die Erzeugung von unmarkierten Mutanten, bei denen chromosomale Veränderungen durch Einfügen einer Antibiotikaresistenzkassette (ein manipulierbares DNA-Fragment, das ein oder mehrere Gene enthält) in einen Stamm eingebracht werden, gefolgt von der anschließenden Entfernung dieser Kassette unter Verwendung eines negativen selektierbaren Markers, ist eine besonders leistungsfähige Technik. Unmarkierte Mutanten können wiederholt genetisch manipuliert werden, so dass beliebig viele Veränderungen in einen Stamm eingebracht werden können. Darüber hinaus ist das Fehlen von Genen, die für Antibiotikaresistenzproteine kodieren, in dem mutierten Stamm wünschenswert, da dadurch die Möglichkeit eines "Entweichens" von antibiotikaresistenten Organismen in die Umwelt vermieden wird. Detaillierte Methoden für wiederholte Runden der genetischen Manipulation von Cyanobakterien sind jedoch in der wissenschaftlichen Literatur nicht gut beschrieben. Hier geben wir eine umfassende Beschreibung dieser Technik, die wir erfolgreich zur Generierung von Mutanten mit multiplen Deletionen, Einzelpunktmutationen innerhalb eines interessierenden Gens und der Insertion neuartiger Genkassetten eingesetzt haben.

Plasmid - Design ist entscheidend für die erfolgreiche Erzeugung der beiden markierten und nicht markierten Mutanten. Figur 1 gibt ein Beispiel von Plasmid A und B verwendet , um eine Deletionsmutante in den Synechocystis Gene 13 cpcC1 und cpcC2 zu erzeugen. In jedem Fall sind die 5 &#39;und 3&#39; flankierenden Regionen sind etwa 900-1.000 bp. Reduzierte flankierenden Regionen können verwendet werden, obwohl das kleinste wir erfolgr...

Das Einbringen mehrerer genomischer Veränderungen in Cyanobakterien ist ein wesentliches Werkzeug bei der Entwicklung von Stämmen für industrielle und Grundlagenforschungszwecke. Wir beschreiben ein System zur Generierung unmarkierter Mutanten in der Modell-Cyanobakterienspezies Synechocystis sp. PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein System zur Erzeugung unmarkierter Mutanten in den cyanobakteriellen Synechocystis-Spezies PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus-Spezies PCC7002 zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Cyanobakteriengenetik zu beantworten. Zum Beispiel, wie man chromosomale Veränderungen in einen Stamm einführt.Durch Insertion eines Antibiotikaresistenzgens, gefolgt von einer anschließenden Entfernung dieser Kassette, unter Verwendung eines negativ selektierbaren Markers. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stämme wiederholt genetisch manipuliert werden können. So können so viele Wechsel in eine Dehnung eingeführt werden, wie gewünscht.Nach der Vorbereitung des Mediums, Cyanobakterienstämme und Plasmide, gemäß dem Textprotokoll. Richten Sie eine Frischkultur ein, indem Sie eine Schlinge voller Cyanobakterienzellen in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Wachsen Sie die Kultur zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius im Licht auf einen OD7500, der 0,2 bis 0,6 entspricht.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie ein bis zwei Milliliter der Kultur bei 2.300 g für fünf Minuten. Na

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Weber, N., et al., Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer natürlichen Transformation in filamentösen Cyanobakterien unter Verwendung von Plasmid-DNA, um eine stabile GFP-Expression und Antibiotikaresistenz durch homologe Rekombination zu erreichen.

Natürliche Transformation und GFP-Expression in der filamentösen Cyanobakterium Phormidium lacuna

Quelle: Lea-Smith, D. J., et al. Generierung von markierten und markerlosen Mutanten in Modell-Cyanobakterienarten. J. Vis. Exp. (2016)Das Video zeigt eine Methode zur Erzeugung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien. Das Protokoll beginnt mit der Kultivierung von Cyanobakterien, gefolgt von Zentrifugations- und Waschschritten, bei denen die Oberflächen-Pili erhalten bleiben. Anschließend wird ein Plasmid eingeführt, das ein Antibiotikaresistenzgen trägt, das von homologen...

Generierung von Antibiotika-markierten Mutanten in Cyanobakterien durch homologe Rekombination

Temperaturempfindliche (ts) letale Mutanten sind wertvolle Werkzeuge, um wesentliche Funktionen zu identifizieren und zu analysieren. Hier beschreiben wir Methoden zur Generierung und Klassifizierung von ts letalen Mutanten im Hochdurchsatz.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Hier stellen wir Protokolle für Anfänger Forscher um Phänotypisierung für die pharmakologisch wichtigen bakteriellen Gattung Streptomyceszu initiieren.

Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.

Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Dieses Protokoll verwendet fluoreszierende Promotor-Reporter, Live-Zell-Mikroskopie und individuelle Inklusionsextraktion in einem gerichteten vorwärts genetischen Ansatz, um Entwicklungsmutanten von Chlamydia trachomatiszu identifizieren und zu isolieren.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

Phormidium lacuna ist ein fadenförmiges Cyanobakterium, das aus marinen Felsbecken isoliert wurde. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Filamenten aus natürlichen Quellen, DNA-Extraktion, Genomsequenzierung, natürliche Transformation, Expression von sfGFP, Kryokonservierung und Motilitätsmethoden.

Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Richtlinie für den Aufbau und die quantitative Überwachung von Co-Kulturen, einschließlich photoautotropher zuckersezernierender Cyanobakterien und heterotropher Hefen.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Mit hochfrequenten elektrischen Stimulation, Beschlagnahme-ähnliche Aktivität kann in induziert...

Neurocircuit Assays für Anfällen bei Epilepsie Mutanten Drosophila</em

Lernen Sie die Erzeugung markierter und markierfreier Mutanten in Cyanobakterien. Diese Methode ermöglicht wiederholte genetische Manipulation von Synechocystis sp. PCC6803 und Synechococcus sp. PCC7002 für Grundlagenforschung.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

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