Name: Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung markierter und markierfreier Mutanten in Cyanobakterien. Diese Methode ermöglicht wiederholte genetische Manipulation von Synechocystis sp. PCC6803 und Synechococcus sp. PCC7002 für Grundlagenforschung.

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Wir sind dankbar, dass der Umwelt Services Association Education Trust, der Synthetischen Biologie in Cambridge SynBio Fonds und des Ministeriums für soziale Gerechtigkeit und Übertragung von Verantwortung, Regierung von Indien, für die finanzielle Unterstützung.

<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
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<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von nicht markierten Mutanten sind: 1) vorsichtig Plasmid-Design, um sicherzustellen, nur die Zielregion verändert wird; 2) sicherzustellen, dass die Proben bleiben axenic, vor allem, wenn die Kultur auf Saccharose; 3) plating Zellen für markierte Mutante Generation zunächst auf Agarplatten BG11 transformiert Antibiotika, gefolgt von der Zugabe von Agar und Antibiotika 24 Stunden später fehlen; 4) markierte Kultivierung Mutanten für 4 volle Tage vor auf BG11 und Saccharose-Agar...

Cyanobakterien sind eine evolutionär alten und unterschiedlichen Stamm der Bakterien in fast allen natürlichen Umwelt auf der Erde gefunden. In marinen Ökosystemen sind sie besonders reichlich vorhanden und spielen eine Schlüsselrolle in vielen Nährstoffkreisläufe spielen, für etwa die Hälfte der Kohlenstoff - Fixierung entfallen 1, die Mehrheit der Stickstofffixierung 2 und Hunderte von Millionen von Tonnen an Kohlenwasserstoffproduktion 3 in den Ozeanen jährlich. Chloroplasten, die Organell verantwortlich für die Photosynthese in eukaryotischen Algen und Pflanzen, sind wahrscheinlich von einem Cyanobakterium entwickelt zu haben , die vier von einem Wirtsorganismus verschlungen wurde. Cyanobakterien haben sich als nützlich erwiesen Modellorganismen für die Untersuchung der Photosynthese, Elektronentransport 5 und biochemischen Wege, von denen viele in Pflanzen konserviert sind. Darüber hinaus Cyanobakterien werden zunehmend für die Herstellung von Lebensmitteln verwendet werden, Biokraftstoffe 6, Strom 7 und Industrieverbindungen 8, die aufgrund ihrer halloghly effiziente Umwandlung von Wasser und CO 2 in Biomasse Solarenergie 9 verwenden. Viele Arten können auf Nicht-Ackerland mit minimalen Nährstoffe und Meerwasser gezüchtet werden, dass Cyanobakterien was darauf hindeutet, möglicherweise in großem Umfang angebaut werden könnten, ohne die landwirtschaftliche Produktion zu beeinträchtigen. Bestimmte Arten sind auch Quellen von natürlichen Produkten, einschließlich Antimykotika, antibakterielle und Anti-Krebs - Verbindungen 10,11. Die Fähigkeit, Mutanten zu erzeugen, ist der Schlüssel zum Verständnis cyanobakteriellen Photosynthese, der Biochemie und Physiologie und essentiell für die Entwicklung von Stämmen für industrielle Zwecke. durch Einfügen eines Antibiotikaresistenzkassette in den Ort von Interesse, die Mehrheit der veröffentlichten Studien erzeugen genetisch Stämme modifiziert. Dies begrenzt die Anzahl von Mutationen, die in einen Stamm eingeführt werden kann, da nur wenige Antibiotikaresistenz Kassetten zur Verwendung in Cyanobakterien verfügbar sind. Die Stämme Gene, Antibiotika re enthält,Beständigkeit kann nicht für die industrielle Produktion in offenen Teichen verwendet werden, die die einzigen kosteneffektiven Mittel , um wahrscheinlich 12 Biokraftstoffe und andere geringwertige Produkte zu erzeugen. Die Erzeugung von nicht markierten Mutanten überwindet diese Einschränkungen. Nicht markierte Mutanten enthalten keine Fremd-DNA, sofern nicht absichtlich enthalten und kann mehrfach manipuliert werden. Daher ist es möglich, so viele Veränderungen in einem Stamm zu erzeugen, wie gewünscht. Zusätzlich nachgeschalteten polaren Effekte auf Gene der Modifikationsstelle minimiert werden, präziser Modifikation des Organismus 13 ermöglicht. In den Mutantenstämmen, suicide Plasmiden, die zwei DNA-Fragmente identisch zu Regionen im cyanobakteriellen Chromosom flankieren das Gen deletiert werden (bezeichnet als die 5&#39;- und 3&#39;-flankierende Bereiche) zuerst konstruiert erzeugen. Zwei Gene werden dann zwischen diesen flankierenden Regionen eingeführt. Eines davon codiert eine antibiotische Resistenz-Protein; der zweite kodiert SacB, die produces Levansucrase, verleihen eine Verbindung Empfindlichkeit gegenüber Saccharose. In der ersten Stufe des Verfahrens, markierte Mutanten, enthält also Stämme einige fremde DNA, erzeugt. Das Plasmid-Konstrukt wird mit den Cyanobakterien-Zellen gemischt, und die DNA wird auf natürliche Weise durch den Organismus aufgenommen. Transformanten werden durch Wachstum auf Agar-Platten, die das entsprechende Antibiotikum und das mutierte Genotyp durch PCR verifiziert ausgewählt. Suicide Plasmide können nicht innerhalb der Stamm von Interesse replizieren. Daher irgendwelche Antibiotika-resistente Kolonien werden aus einem Rekombinationsereignis führen, wobei das interessierende Gen in das Chromosom eingefügt in. Zur Erzeugung nicht markierten Mutanten wird die markierte Mutante dann mit einem zweiten Selbstmord Plasmid gemischt, die nur die 5 &#39;und 3&#39; flankierenden Regionen. wenn Insertion von Fremd-DNA jedoch erforderlich ist, ein Plasmid, bestehend aus den 5&#39;- und 3&#39;-flankierenden Regionen mit einer Kassette, die die Gene von Interesse zwischen diesen DNA-Fragmente eingefügt enthalten, können verwendet werden. Selection ist über Wachstum auf Agar-Platten, die Saccharose. Wie Saccharose auf Zellen letal ist , wenn das sacB Gen - Produkt exprimiert wird, daß die nur Zellen überleben , sind jene , in denen ein zweites Rekombinationsereignis stattgefunden hat, wobei die Saccharose Empfindlichkeitsgens, zusätzlich zu dem Antibiotika - Resistenzgen, aus dem rekombinierten wurde Chromosom und auf dem Plasmid. Als Folge der rekombinatorischen Austausch, die flankierenden Regionen und jede DNA zwischen ihnen werden in das Chromosom inseriert. Wir haben erfolgreich diese Methoden zu generieren mehrere chromosomale Mutationen in dem gleichen Stamm von Synechocystis sp. PCC6803 (nachfolgend als Synechocystis) 13,14, einzelne Punktmutationen in einem Gen von Interesse 13 und für die Expression von Genkassetten einzuführen. Während Generation von unmarkierten Vorprägungen hat vor unserer Arbeit in Synechocystis 15,16, eine detaillierte Methode nachgewiesen wurde, unterstützt durcheine visuelle Darstellung der kritischen Schritte, ist nicht öffentlich verfügbar. Wir haben galt auch die gleiche Methode zur Erzeugung von markierten Vorprägungen in einem anderen Modell Cyanobakterium, sp Synechococcus. PCC7002 (nachstehend als Synechococcus). Dieses Protokoll stellt eine klare, einfache Methode für Mutanten und ein schnelles Protokoll zur Validierung und Speicherung dieser Stämme zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Eisenammoniumcitrat</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamin</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 90 mm dreifach belüftet</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filters</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Konuskolben</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity-DNA-Polymerase&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Restriktionsendonukleasen</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>sulfat Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Plasmid Miniprep Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Rundbodenröhrchen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m Glasperlen</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Leuchtstofflampen</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT Multitron Photobioreaktor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von marked und markerless mutants in modell cyanobakterienarten

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobakterien sind ökologisch wichtige Organismen und potentielle Plattformen für die Herstellung von Biokraftstoffen und nützlichen Industrieprodukten. Die genetische Manipulation von Cyanobakterien, insbesondere von Modellorganismen wie Synechocystis sp. PCC6803 und Synechococcus sp. PCC7002, ist ein wichtiges Instrument sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die angewandte Forschung. Die Erzeugung von unmarkierten Mutanten, bei denen chromosomale Veränderungen durch Einfügen einer Antibiotikaresistenzkassette (ein manipulierbares DNA-Fragment, das ein oder mehrere Gene enthält) in einen Stamm eingebracht werden, gefolgt von der anschließenden Entfernung dieser Kassette unter Verwendung eines negativen selektierbaren Markers, ist eine besonders leistungsfähige Technik. Unmarkierte Mutanten können wiederholt genetisch manipuliert werden, so dass beliebig viele Veränderungen in einen Stamm eingebracht werden können. Darüber hinaus ist das Fehlen von Genen, die für Antibiotikaresistenzproteine kodieren, in dem mutierten Stamm wünschenswert, da dadurch die Möglichkeit eines "Entweichens" von antibiotikaresistenten Organismen in die Umwelt vermieden wird. Detaillierte Methoden für wiederholte Runden der genetischen Manipulation von Cyanobakterien sind jedoch in der wissenschaftlichen Literatur nicht gut beschrieben. Hier geben wir eine umfassende Beschreibung dieser Technik, die wir erfolgreich zur Generierung von Mutanten mit multiplen Deletionen, Einzelpunktmutationen innerhalb eines interessierenden Gens und der Insertion neuartiger Genkassetten eingesetzt haben.

Plasmid - Design ist entscheidend für die erfolgreiche Erzeugung der beiden markierten und nicht markierten Mutanten. Figur 1 gibt ein Beispiel von Plasmid A und B verwendet , um eine Deletionsmutante in den Synechocystis Gene 13 cpcC1 und cpcC2 zu erzeugen. In jedem Fall sind die 5 &#39;und 3&#39; flankierenden Regionen sind etwa 900-1.000 bp. Reduzierte flankierenden Regionen können verwendet werden, obwohl das kleinste wir erfolgr...

Das Einbringen mehrerer genomischer Veränderungen in Cyanobakterien ist ein wesentliches Werkzeug bei der Entwicklung von Stämmen für industrielle und Grundlagenforschungszwecke. Wir beschreiben ein System zur Generierung unmarkierter Mutanten in der Modell-Cyanobakterienspezies Synechocystis sp. PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus sp. PCC7002.

Erzeugung von Marked und Markerless Mutants in Modell Cyanobakterienarten

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein System zur Erzeugung unmarkierter Mutanten in den cyanobakteriellen Synechocystis-Spezies PCC6803 und markierten Mutanten in Synechococcus-Spezies PCC7002 zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Cyanobakteriengenetik zu beantworten. Zum Beispiel, wie man chromosomale Veränderungen in einen Stamm einführt.Durch Insertion eines Antibiotikaresistenzgens, gefolgt von einer anschließenden Entfernung dieser Kassette, unter Verwendung eines negativ selektierbaren Markers. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Stämme wiederholt genetisch manipuliert werden können. So können so viele Wechsel in eine Dehnung eingeführt werden, wie gewünscht.Nach der Vorbereitung des Mediums, Cyanobakterienstämme und Plasmide, gemäß dem Textprotokoll. Richten Sie eine Frischkultur ein, indem Sie eine Schlinge voller Cyanobakterienzellen in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Wachsen Sie die Kultur zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius im Licht auf einen OD7500, der 0,2 bis 0,6 entspricht.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie ein bis zwei Milliliter der Kultur bei 2.300 g für fünf Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie BG11 Medium, um die Pellets einmal zu waschen, und pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren. Da das Vortexen zum Verlust von Pili führen kann, die für die DNA-Aufnahme unerlässlich sind.Nachdem Sie die Zellen erneut pelletiert und den Überstand entfernt haben, fügen Sie BG11-Medium zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern hinzu und geben Sie die Zellen in ein 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen. Geben Sie anschließend 1 Mikrogramm des zuvor vorbereiteten Plasmids A zu den Zellen. Und zum Mischen sanft klopfen.Legen Sie dann die Röhrchen waagerecht bei 30 Grad Celsius in den Inkubator und inkubieren Sie sie vier bis sechs Stunden lang. Nach der Inkubation aliquot des Zellkulturplasmid-DNA-Gemisches ohne Antibiotika auf BG11-Agarplatten verteilen. Und bei 30 Grad Celsius inkubieren.Bereiten Sie etwa 24 Stunden später eine 0,6%ige Agarlösung in kanamycinhaltigem Wasser vor. Und lassen Sie es auf 42 Grad Celsius abkühlen. Geben Sie dann 2,5 bis drei Milliliter an die Ränder der Kulturplatten und kippen Sie die Platte, so dass die Lösung eine gleichmäßige obere Agarschicht auf der Oberfläche bildet.Inkubieren Sie die Platten etwa sieben Tage, damit die Bienenvölker sichtbar sind. Teilen Sie dann eine frische BG11-Agar-plus-Kanamycin-Platte in sechs Sektoren auf. Und verwenden Sie einen Zahnstocher mit stumpfem Ende, um einzelne Kolonien auszustechen.Um die PCR durchzuführen und den markierten Knockout zu bestätigen, wird eine kleine Menge Zellen in ein Röhrchen mit 50 Mikrolitern Wasser und etwa 20 425 bis 600 Mikrometer großen Glasperlen überführt. Schütteln Sie die Zellen und Kügelchen fünf Minuten lang bei etwa 2.000 U/min, bevor Sie sie fünf Minuten lang bei 15.700 g drehen. Verwenden Sie dann fünf Mikroliter des Überstands, um 50-Mikroliter-PCR-Reaktionen mit Heft-DNA-Vorübungen vorzubereiten.Um die Mutanten zu validieren, wird nach dem Entwerfen von Primern gemäß dem Textprotokoll das Produkt mit dem folgenden Programm amplifiziert und eine Wildtyp-Kontrolle eingeschlossen. Durch Gelelektroforesen wird der Genotyp von Knockout-Transformanten überprüft. Es zeigt eine Bande von etwa vier Kilobasenpaaren, in der die Wildtyp-Bande fehlt.Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. Wenn noch eine Wildtyp-Bande vorhanden ist, streichen Sie den Stamm erneut auf die frische Platte und wiederholen Sie die PCR. Wiederholen Sie den Validierungsprozess, bis die Mutante segregiert ist und keine Wildtyp-Bande in der PCR-Reaktion beobachtet wird.Bei einer Sorte, die ein ausgeprägtes mutiertes Profil aufweist, sollten Sie auf einer frischen Platte erneut streifen, um einen unmarkierten Knockout zu erzeugen. Um unmarkierte Synechocystis-Mutanten zu erzeugen, richten Sie eine frische Kultur des markierten Knockouts ein, indem Sie die mit Zellen gefüllte Schlinge in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Vergrößern Sie die Kultur zwei bis drei Tage lang auf OD750, was 0,2 bis 0,6 entspricht.10 Milliliter der Kultur bei 2.300 g fünf Minuten lang zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Anschließend verwenden Sie BG11 Medium, um die Zellen schonend zu waschen. Nachdem Sie BG11 zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern hinzugefügt und die Zellen in ein 14-Milliliter-Rundbodenröhrchen übertragen haben, fügen Sie den Zellen 1 Mikrogramm Plasmid-B-DNA hinzu und klopfen Sie vorsichtig ab, um sich zu mischen.Legen Sie dann die Röhrchen horizontal in den Inkubator und inkubieren Sie sie vier bis sechs Stunden lang. Nach der Inkubation werden 1,8 Milliliter BG11-Medium zugegeben und die Proben insgesamt vier Tage lang unter Schütteln inkubiert. Dies ist eine ausreichende Zeit, um die Rekombination in den multiplen Chromosomenkopien zu ermöglichen.50, 10 und 1 Mikroliter Aliquots der transformierten Kultur auf BG11 plus 5%ige Saccharose-Agarplatten auffüllen und etwa sieben Tage lang inkubieren, um einzelne Kolonien zu erzeugen. Als nächstes brütet man mit einem Zahnstocher mit stumpfem Ende 30 bis 50 einzelne Kolonien auf BG11 plus Kanamycin-Platten aus. Dann auf BG11 plus 5 % Saccharose auffrischen.Völker, die auf BG11 plus Saccharose, aber nicht auf Platten mit Kanamycin wachsen, sind potentiell unmarkierte Knockouts. Kolonien, die auf beiden Platten wachsen, sind wahrscheinlich aufgrund einer Mutation im sacB-Gen saccharoseresistent. Verifizieren Sie nach der PCR-Methode, die weiter oben in diesem Video demonstriert wurde, unmarkierte Knockouts, wodurch eine Gelbande erzeugt wird, die der Wildtyp-Größe abzüglich der deletierten Region entspricht.Wenn der Stamm ein unmarkiertes Mutantenprofil zeigt, dann erneut auf frischen BG11-Agar ohne Antibiotika aufstreifen. Um die Stämme langfristig zu lagern, richten Sie eine frische Kultur des Stammes ein, indem Sie eine Schlinge voller Zellen in 30 bis 50 Milliliter BG11-Medium inokulieren. Vergrößern Sie die Kultur drei bis vier Tage lang auf einen OD750-Wert von 0,4 bis 0,7.Nachdem Sie die Zellen einmal mit BG11 gewaschen haben, resuspendieren Sie das Pellet in etwa zwei Millilitern BG11. Geben Sie 0,8 Milliliter der konzentrierten Zellen in ein Röhrchen. Fügen Sie dann 0,2 Milliliter 80% filtersterilisiertes Glycerin hinzu.In ein anderes Röhrchen geben Sie 0,93 Milliliter konzentrierte Zellen und 0,07 Milliliter DMSO. Lagern Sie beide Röhrchen bei minus 80 Grad Celsius. Um die Stämme wiederzubeleben, entfernen Sie das Röhrchen und kratzen Sie mit einem Zahnstocher mit stumpfem Ende einige Zellen ohne Antibiotika auf einer Agarplatte ab.Verwenden Sie dann eine sterile Schlaufe, um sie wie gewohnt herauszuziehen. Diese Abbildung zeigt Beispiele für die Plasmide A und B, die zur Erzeugung von Deletionsmutanten verwendet wurden. In jedem Fall handelt es sich bei den fünf Prime- und drei Prime-Planking-Bereichen um etwa 900 bis 1.000 Basenpaare.Plasmid B kann auch eine Genkassette zwischen den fünf Primzahlen und drei Primzahlen enthalten, die etwa ein Kilobasenpaar flankieren. Oder eine modifizierte Version der nativen Gensequenz. Bei der Transformation mit Plasmid A erscheinen nach sieben bis 10 Tagen mehrere hundert Völker auf einer Platte.Wenn Gene nicht essentiell sind und Mutanten ähnlich wie der Wildtyp-Stamm Wachstum zeigen, sollten alle Chromosomen eine kopierte npt1/sacB-eingefügte Sequenz enthalten, die mittels PCR bestimmt wurde. Wenn Gene nicht essentiell sind und Mutanten langsam wachsen, dann sind mehrere Runden des erneuten Streifens mit steigenden Konzentrationen von Kanamycin notwendig, um eine segregierte markierte Mutante zu erhalten. Wenn beim erneuten Streifen keine markierte Mutante erhalten wird, ist das Gen wahrscheinlich überlebenswichtig.Die Mehrzahl der einzelnen Kolonien, die durch Transformation mit Plasmid B gewonnen werden, sind Kanamycin-sensitiv und Saccharose-resistent. Wie hier gezeigt, zeigt die PCR-Amplifikation der Zielregion in diesen Kolonien, dass fast 100% der unmarkierten Mutanten ein Profil aufweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in Stunden über einen Zeitraum von sechs Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine sterile Technik zu verwenden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Messung der Sauerstoffproduktion oder die Gaschromatographie-Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, wie z.B. die Messung der Photosyntheseraten oder der Metabolitenproduktion. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Cyanobakteriengenetik.Erforschung wichtiger biochemischer und physiologischer Prozesse in diesem Stamm und Entwicklungsstämme für industrielle Zwecke. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unmarkierte Knockouts bei Synechococcus-Spezies PCC6803 erzeugt.

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Biology

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