Visuelle und Mikroskopische Auswertung von Streptomyces Entwicklungsstörungen Mutanten

Das übergeordnete Ziel der folgenden Techniken ist es, angehende Forscher für die Arbeit mit Streptomyces und anderen verwandten Spezies im universitären Lehrlabor und im Klassenzimmer der High School zu schulen. Die phänotypische Beobachtung ist wichtig für die vielen Forscher, die in das Gebiet der Streptomyces-Forschung einsteigen. Dieses Video beschreibt Methoden zur bakteriellen Vermehrung, Lagerung und visuellen und mikroskopischen Untersuchung.

Die hier beschriebenen Phänotpierungsmethoden verwenden Streptomyces coelicolor als Modell. Die Methoden sind jedoch sowohl auf alle Mitglieder der großen Gattung als auch auf eng verwandte Actinomyces anwendbar. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie sowohl für unerfahrene Forscher in einem Klassenzimmer an einer High School oder einem Lehrlabor für Studenten als auch für erfahrenes Laborpersonal zugänglich sind.

Nach dem Anschauen dieses Videos und dem Lesen des begleitenden Protokolls sollten neue Forscher in der Lage sein, ihre Streptomyces-Stämme zu manipulieren, sie richtig zu lagern und mit visuellen Charakterisierungsexperimenten zu beginnen. Garret Kandell und Sean Kirk, Forschungsstudenten aus meinem Labor an der Otterbein University, werden die Verfahren vorführen. Verwenden Sie zunächst eine Standardmethode, wie z. B. die in Saunders 2012 gezeigte Quadranten-Streak-Methode, um Streptomyces-Stämme auf MS-Agarplatten zu streifen und in einzelne Kolonien zu kultivieren.

Pflücken Sie alle vier bis sechs Tage eine einzelne Kolonie und streichen Sie sie erneut auf einen frischen Teller. Mit zunehmendem Alter werden Kolonien anfällig für zufällige Mutationen. Nach der Mutagenese gemäß dem Textprotokoll ist die Morphologie der Kolonie für jede Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Elternstamm zu beachten.

Bei der Charakterisierung neuer Streptomyces-Arten ist das neue Isolat mit dem einer gut untersuchten Art zu vergleichen, wobei die Grundform, die Oberfläche der Kolonie, die Opazität, die Erhebung und die Pigmentierung zu beachten sind. Markieren Sie eine MS-Agarplatte und streifen Sie Wildtyp- und Mutantenstämme in Keilmustern. Achten Sie darauf, dass kein Stamm mit einem anderen Stamm in Berührung kommt, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.

Notieren Sie sich das Datum und die Uhrzeit, zu der die Stämme auf die Platte gestreift werden. Anschließend werden die Platten bei 30 Grad Celsius inkubiert. Denken Sie daran, dass es äußerst wichtig ist, Ihre Streptomyces-Probe immer vor Kontamination zu schützen.

Verwenden Sie Ihre beste sterile Technik für alle Schritte und öffnen Sie Platten und Röhrchen so lange wie möglich. Legen Sie gewachsene Petrischalen auf farbiges oder weißes Papier, um den Hintergrund zu homogenisieren. Schreiben Sie auf das Papier den Namen des Stammes, das Datum, die Inkubationstemperatur und die Zeit ab dem Streifen der ersten Platte.

Machen Sie digitale Bilder von der Platte, auf denen die Dehnungsinformationen auf dem Papierhintergrund stehen, damit die Verwirrung minimal ist. Sterilisieren Sie die Pinzette, indem Sie sie in 70%igem Ethanol waschen und dann durch eine Bunsenbrennerflamme führen, um das Ethanol zu verdampfen. Sterilisieren Sie Deckgläser, indem Sie sie in 70% Ethanol waschen und dann in einer sterilen Petrischale trocknen lassen.

Um als nächstes ein Deckglaslifting des Bakterienwachstums vorzubereiten, verwenden Sie eine sterile Pinzette, um ein steriles Deckglas aufzunehmen, und legen Sie das Deckglas auf eine MS-Agarplatte, wo das Bakterienwachstum dicht ist. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf die Rückseite des Deckglases, um eine ausreichende Übertragung von Bakteriensporen und Hautmyzel zu gewährleisten. Nehmen Sie das Deckglas von der Platte und legen Sie es in einem 45-Grad-Winkel mit dem Zellmaterial auf die Oberfläche eines Objektträgers, der einen 15-Mikroliter-Tropfen 50 % Glycerin enthält.

Lassen Sie das Deckglas auf das Glycerin fallen, wodurch die Luftblasen reduziert werden. Um die Phasenkontrastmikroskopie in verschiedenen Zeitintervallen durchzuführen, legen Sie den vorbereiteten Objektträger auf den Mikroskoptisch und geben Sie einen Tropfen Immersionsöl in die Mitte des Deckglases. Drehen Sie das 100-fach-Phasenobjektiv an Ort und Stelle, und stellen Sie den Kondensatorrevolver auf die richtige Phaseneinstellung ein.

Sobald die Objektivlinse mit dem Öl in Kontakt gekommen ist, verwenden Sie nur den Feineinstellknopf, um das Bild zu fokussieren. Untersuchen Sie mehrere Sichtfelder, um auffällige und konsistente Unterschiede zwischen mutierten Stämmen und dem Wildtyp zu erkennen. Wie die Fähigkeit, Sporen zu bilden, die Größe und Form der Sporen und die Gesamtzahl der Sporen.

Bereiten Sie mit einer sterilen Pinzette wie zuvor ein Deckglaslifting von einer MS-Agarplatte vor, bei dem das Bakterienwachstum sichtbar ist, und berühren Sie vorsichtig die Rückseite des Deckglases mit der Pinzette, um eine ausreichende Übertragung von Bakteriensporen und Luftfilamenten zu gewährleisten. Nehmen Sie das Deckglas von der Platte und legen Sie es so auf den Karton, dass die Seite mit dem Zellmaterial nach oben zeigt, um das Deckglas leichter handhaben zu können. Mit eiskaltem Methanol fluten Sie das Deckglas und lassen es fünf Minuten einwirken.

Waschen Sie das Deckglas mit PBS zweimal, indem Sie die Lösung vorsichtig auftragen und entfernen. Geben Sie 15 Mikroliter einer Propidiumiodidlösung von 10 Mikrogramm pro Milliliter und/oder 10 Mikrogramm pro Milliliter WGA-FITC zu einem Objektträger. Legen Sie das Deckglas mit der bedruckten Seite nach unten auf einen Tropfen fluoreszierenden Fleck.

Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang in einem abgedunkelten oder schwach beleuchteten Raum. Bestände der fluoreszierenden Flecken und Fleckenproben sollten vor Licht geschützt werden. Es wird empfohlen, dass Forscher bei der Vorbereitung der Proben Bedingungen mit schwachem Licht verwenden und eine dunkle Box verwenden, um die Proben aufzubewahren, sobald sie vorbereitet sind.

Betrachten Sie die Objektträger unter einer 100-fachen Objektivlinse mit einem Phasenkontrast- oder DIC-Mikroskop, das mit Epifluoreszenz-Anregungswürfeln für Propidiumiodid und FITC ausgestattet ist. Analysieren Sie die Bilder gemäß dem Textprotokoll. Hier sind Beispiele von Streptomyces-Mutanten zu sehen, die aus der Transposon-Mutagenese hervorgegangen sind.

Ein helleres Hautmyzel kann auf einen niedrigeren Gehalt an grauem Pigment hinweisen, der durch einen Defekt in der Sporulation verursacht wird. Oder das Fehlen eines verschwommenen Aussehens ist ein Hinweis auf eine Blockade der Myzelbildung in der Luft. Wie mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie zu sehen ist, produzieren Wildtyp-Kolonien von S.coelicolor in der Regel nach etwa zwei Tagen Wachstum ein oberirdisches Myzel.

Und lange Sporenketten nach drei Tagen Wachstum. Weiße Mutanten können entweder verzögert in der Sporenbildung sein, eine Verringerung der Häufigkeit der produzierten Sporen zeigen, Sporen mit Form- und/oder Größendefekten produzieren oder einfach geringere Mengen des reifen, grauen Sporenpigments produzieren. Die hier gezeigte Färbung mit Hilfe von DIC und Fluoreszenzmikroskopie mit PI-Färbung wird mit regelmäßigen Abständen für eine Kette von Sporen in einer Wildtyp-Probe mit dem intermittierenden Färbemuster für zwei Transposon-Insertionsmutanten verglichen, die einen Chromosomensegregationsdefekt aufweisen.

Mit WGA-FITC zur Färbung der Zellwand liegt der Wildtyp-Stamm S.venezuelae als glatte Luftfilamente zwischen Sporenketten vor. Und zeigt die laterale Anordnung von Teilungssepten, die typischerweise während der Sporulation zu sehen sind. Die Arbeit mit einem filamentösen Organismus unterscheidet sich stark von der Arbeit mit einem bekannten, stäbchenförmigen Bakterium.

Die Videoprotokolle hier sollen als wichtige Ressource für brandneue Forscher dienen, die in das Gebiet der Streptomyces-Forschung einsteigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit der Untersuchung von Streptomyces-Arten und anderen verwandten Bakterien beginnen können. Nach diesen ersten Experimenten kann eine Vielzahl von Techniken in einem Forschungslabor angewendet werden, um mehr über Ihre Streptomyces-Stämme zu erfahren.

Einige der fortschrittlichen Techniken könnten beispielsweise Proteinmarkierung oder Genexpressionsanalysen wie Echtzeit-PCR und RNA-Seq sein. Erste Phänotypisierungsexperimente werden verwendet, um neue Stämme zu identifizieren und zu charakterisieren und die typische Rolle eines bestimmten Gens zu bestimmen. Diese Methoden wurden bereits in universitären Lehrlaboratorien eingesetzt, um eine Vielzahl von Streptomyces-Stämmen zu identifizieren und zu charakterisieren.