Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Dieses Protokoll verwendet eine statische Suspensionskulturstrategie zur Differenzierung von Pankreasvorläuferzellen in Inselcluster, reduziert die Belastungen, denen Zellen während der Schüttelkultur ausgesetzt sind, und verbessert den Differenzierungserfolg erheblich. Das Hardware-Protokoll ist anfängerfreundlich und spart Zeit für die Optimierung der ersten vier Stufen. Personal mit grundlegenden Stammzellkulturtechniken kann dieses Protokoll reproduzieren und hat eine gute Chance, funktionelle inselartige Cluster zu erzeugen.

Zu Beginn werden die Kulturvertiefungen mit hESC-qualifiziertem Matrigel vorgeschwemmt, das in eiskaltem DMEM/F12 verdünnt wurde, und die Platte 30 Minuten lang in einen befeuchteten 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid gelegt. Das verbrauchte Medium aus der hPSC-Kultur absaugen und einmal mit DPBS spülen. Die hPSC-Kultur wird mit einem Zelldissoziationsenzym bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten in einzelne Zellen dissoziiert.

Nach der Dissoziation werden die Zellen durch Zugabe von warmem DMEM/F12-Medium gespült und in ein konisches 15- oder 50-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 G und resuspendieren Sie das Pellet in einem Stammzell-Komplettmedium, das 10-Mikromolar Y-27632 enthält. Führen Sie dann die Zählung lebender Zellen mit einem Hämozytometer durch.

Nach der Zählung aspirieren Sie verdünntes Matrigel und säen Sie lebende Zellen sofort mit 1,6 bis 1,8 mal 10 bis fünf Quadratzentimetern Dichte auf matrigelbeschichtete Vertiefungen. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator. Als Nächstes, auf Stufe eins, am ersten Tag, bereitest du Stufe 1A medium vor.

Ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch ein Medium der Stufe 1A und inkubieren Sie es 24 Stunden lang. Ersetzen Sie am nächsten Tag das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen durch frisch zubereitetes Medium der Stufe 1B. In der zweiten Phase, dem ersten Tag, bereiten Sie das Medium der Stufe 2A vor und ersetzen Sie das Medium aus den Bohrlöchern durch das Medium der Stufe 2A.

24 Stunden lang inkubieren, bevor Medium der Stufe 2B in die Vertiefungen gegeben wird; In der dritten Phase, am ersten Tag, wird das verbrauchte Medium aus den Vertiefungen abgesaugt, dann frisch zubereitetes Medium der Stufe 3 hinzugefügt und in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. In der vierten Phase, dem ersten Tag, ersetzen Sie das verbrauchte Medium durch frisch zubereitetes Medium der Stufe 4 und inkubieren Sie es in einem befeuchteten Inkubator. In der vierten Phase, am fünften Tag, werden die Mikrowells mit 500 Mikrolitern Anti-Adhärenz-Spüllösung pro Vertiefung vorbehandelt.

Zentrifugieren Sie die Mikrotiterplatte fünf Minuten lang bei 1.300 G und beobachten Sie sie unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in den Mikrowellen eingeschlossen werden. Als nächstes saugen Sie die Spüllösung aus den Vertiefungen an und spülen Sie einmal mit einem Milliliter DPBS. Geben Sie dann einen Milliliter Aggregationsmedium in jede Vertiefung.

Nach dem Entfernen des verbrauchten Mediums aus den Pankreas-Vorläuferkulturen wird die Kultur einmal mit DPBS gewaschen, bevor sie mit dem Dissoziationsreagenz bei 37 Grad Celsius für 10 bis 12 Minuten in einzelne Zellen dissoziiert wird. Die Zellen werden mit warmem DMEM/F12 gespült und fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Resuspendieren Sie das Pellet im Aggregationsmedium und führen Sie eine Lebendzellzählung durch.

Säen Sie 2,4 bis 3,6 Millionen Zellen pro Vertiefung aus und fügen Sie jeder Vertiefung ein Aggregationsmedium hinzu, um ein Endvolumen von zwei Millilitern pro Vertiefung zu erreichen. Mit einer P-1000-Pipettenspitze die Zellen vorsichtig nach oben und unten pipettieren, um eine gleichmäßige Verteilung zu erreichen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 g, um die Zellen in den Mikrotiterwells zu erfassen, und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator, um die Aggregation zu initiieren.

Nach der Aggregation pipettieren Sie die Aggregate vorsichtig mehrmals auf und ab, um alle nicht aggregierten Zellen zum Schwimmen zu bringen. Sobald sich die Aggregate gesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig das verbrauchte Medium, das schwimmende, nicht aggregierte Zellen enthält, ohne Aggregate anzusaugen. Geben Sie frisches Medium der Stufe 5 auf die Oberfläche der Mikrotiterplatte, um Aggregate aus den Mikrotiterplatten zu entfernen, und übertragen Sie sie in die Sechs-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz.

Nachdem Sie alle Aggregate in den sechs Vertiefungen mit extrem geringer Bindung gesammelt haben, resuspendieren Sie sie im Medium der Stufe 5, um die Dichte auf 20 Cluster pro 100 Mikroliter einzustellen. Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter Medium der Stufe 5 in jede Vertiefung einer ULA-Platte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen mit extrem niedrigem Aufsatz. Füllen Sie die Eck- und Randmulden mit 200 Mikrolitern DPBS.

Mischen Sie die Cluster-Resuspension jedes Mal vorsichtig vor der Dosierung. Geben Sie dann 100 Mikroliter der Cluster-Resuspension in jede Vertiefung der ULA-Flachbodenplatte mit 96 Vertiefungen. Legen Sie die Kulturplatten für 24 Stunden auf eine ebene Fläche in einen befeuchteten Inkubator.

Am nächsten Tag oder in der fünften Phase, am zweiten Tag, werden mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig 90 Mikroliter des verbrauchten Mediums aus jeder Vertiefung entnommen und mit 100 Mikrolitern Medium der Stufe 5 aufgefrischt. Ersetzen Sie in der sechsten Phase, dem ersten Tag, die 90 Mikroliter verbrauchtes Medium durch 100 Mikroliter Medium der Stufe 6 pro Well. In der siebten Phase, dem ersten Tag, entfernen Sie das verbrauchte Medium und fügen Sie 100 Mikroliter Medium der Stufe 7 pro Vertiefung hinzu.

In dieser Studie wurden unter Verwendung von Mikrotiterplatten Tausende von Pankreas-Vorläuferclustern mit einheitlicher Größe und Morphologie gleichzeitig erzeugt, und die durchschnittliche Aggregationseffizienz lag bei etwa 74 %Wichtig ist, dass die Expression von PDX1 und NKX6.1 in diesen Clustern nach der Aggregation auf einem hohen Niveau gehalten wurde. Insulinexprimierende Zellen wurden allmählich innerhalb endokriner Cluster induziert, was durch erhöhte Insulin-GFP-Signale in lebenden Kulturen im Laufe der Zeit angezeigt wird. Die Clustergröße nimmt zwischen den Stufen fünf und sieben von einem durchschnittlichen Durchmesser von 150 Mikrometern auf 220 Mikrometer zu.

Die Charakterisierung der Zellzusammensetzung zeigt, dass die durch das Hybridprotokoll erzeugten hPSC-Inseln im siebten Stadium in erster Linie endokrin waren und aus vier Hauptzelltypen der Inselzellen bestanden. Dieses hybride Protokoll erzeugte weitgehend monohormonelle Inselzellen und eine Minderheit von bihormonellen Zellen. Differenzierende Betazellen exprimieren NKX6.1, MAFA, NEUROD1, PDX1 und GLUT1.

Darüber hinaus wurden 60 % Insulin- und PDX1-Doppel-positive Zellen sowie 50 % C-Peptid- und NKX6.1-Doppel-positive Zellen in Kulturen im siebten Stadium induziert. In vitro zeigten statische Glukose-stimulierte Insulinsekretionsassays, dass hPSC-Inseln im Stadium sieben hohe Insulinspiegel als Reaktion auf hohe Glukose und direkte Depolarisation absondern. Der Gesamtinsulingehalt von hPSC-Inseln ist etwa halb so hoch wie der von Leicheninseln.

Das Multi-Well-basierte statische Kultursystem zur Erzeugung von aus Stammzellen gewonnenen Inseln ermöglicht verschiedene In-situ-Assays und kann als geeignete Plattform für die Entwicklung von Protokollen und Screening-Studien in kleinem Maßstab dienen. Um die Clusterfusion während einer statischen Kultur in einer 96-Well-Platte zu minimieren, kippen Sie die Platte nicht, wenn Sie den Medienwechsel durchführen. Halten Sie die Platte immer waagerecht auf einer ebenen Fläche.