Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Die Ösentransplantation wurde als mögliche Behandlung für Typ-1-Diabetes vorgeschlagen. Zwei große Einschränkungen verhindern jedoch, dass es zu einer weit verbreiteten klinischen Realität wird. Zunächst wird eine große Anzahl an Ösen pro Empfänger benötigt.

Da die Ösen von Organspendern gewonnen werden, ist die Zahl der potentiellen Empfänger stark begrenzt. Die zweite Transplantation erfordert eine lebenslange Behandlung mit starken Immunsuppressiva, was den Patienten, insbesondere die pädiatrische Bevölkerung, einem Risiko für Malignität, Infektionen und Nierenversagen aussetzt. Eine Ösentransplantation unter der Nierenkapsel der Maus wird durchgeführt, um Strategien zur Verbesserung der klinischen Transplantationsergebnisse zu untersuchen.

Ösen, die von gesunden Spendermäusen isoliert wurden, in Gruppen eingeteilt und für die Transplantation vorbereitet wurden. Die Ösen werden dann in den subkapsulären Raum der Niere transplantiert. Bei diabetischen Empfängermäusen wird die Funktion des Ösentransplantats durch Überwachung des Blutzuckerspiegels beurteilt, die zeigt, dass etwa 250 bis 350 Ösen bei einer 20-Gramm-Empfängermaus innerhalb von 24 Stunden nach der Transplantation die Glykämie wiederherstellen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend für die Schritte zur Kanülierung. Der gemeinsame Gallengang und die Verlegung der Ösen in den subkapsulären Raum der Niere sind schwer zu erlernen. Diese Schritte erfordern die Identifizierung von Gewebestrukturen, ruhige Hände und den Einsatz von Techniken, die Gewebeschäden minimieren.

Legen Sie eine euthanasierte Maus in Rückenlage auf ein Papiertuch am Präparierfernrohr und besprühen Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol. Öffne den Bauch mit einer Schere mit einem V-Schnitt von der Schamregion zu beiden Vorderbeinen. Die Maus befindet sich unterhalb des Präparierbereichs.

Positionieren Sie es mit dem Kopf in Richtung des Betrachters. Lokalisieren Sie den Zwölffingerdarmeingang des Gallengangs communis mit einer Hämostatklemme, die Zwölffingerdarmöffnung des Gallengangs communis. Das Blutstillbad sollte so positioniert werden, dass es im komprimierten Zustand genau entlang der Bauchspeicheldrüsendarmgrenze verläuft.

Hier werden zwei Methoden zur Kanülierung des Gallengangs vorgestellt. Die Freihandmethode und die Pinzettenunterstützungsmethode zur Kanülierung des Gallengangs. Ziehen Sie den am Zwölffingerdarm festgeklemmten Blutstiller mit der Freihandmethode vom Kopf der Maus weg in Richtung Schwanz, so dass sich der Gallengang communis anspannt.

Es gibt einen Zusammenfluss im Gallengang in der Nähe der Leber, wo die aus der Gallenblase abfließende Galle und die Enzyme aus der Leber zusammenkommen. Bevor Sie in den Darm gelangen, ziehen Sie den Gallengang fest, um das Innere der V-Position freizulegen. Eine gebogene 27-Gauge-Nadel, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, so dass die Nadel direkt durch das V gleitet und den unteren Teil des Kanals direkt kanüliert. Schieben Sie die Nadel einige Millimeter über das Ende der Fase hinaus, um einen Rückfluss in Leber und Gallenblase zu verhindern.

Sobald die Kanülierung erfolgreich ist, perfundieren Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie zwei Milliliter Liase aus der Spritze abgeben. Achten Sie auf die Ausdehnung der Bauchspeicheldrüse über den Magen als Hinweis auf eine optimale Kanülierung. Alternativ kann der Gallengang auch kanüliert werden.

Mit der Zangenzystenmethode. Ziehen Sie den am Zwölffingerdarm festgeklemmten Hämostaten C vom Kopf der Maus weg in Richtung Schwanz, so dass der gemeinsame Gallengang zu einem Tort wird. Punktieren Sie dann mit einer gebogenen 27-Gauge-Nadel, die an einer Fünf-Milliliter-Spritze befestigt ist, die Faszie unterhalb des gemeinsamen Gallengangs in der Nähe der Leber

Verwenden Sie die Nadel, um die Faszie aus dem Kanal zu entfernen, während die Nadel noch an Ort und Stelle ist. Legen Sie das Blutstillzeichen ab und nehmen Sie eine Pinzette. Verwenden Sie einen Arm der offenen Pinzette, um den Gallengang zu stützen, wo die Nadel die Faszie freigelegt hat, während Sie den Kanal und die Pinzette nach vorne ziehen.

Schieben Sie die Nadel mit der Pinzette als Rückhalt in den Kanal. Eine erfolgreiche Kanülierung wird durch eine gleichmäßige Ausdehnung der Bauchspeicheldrüseregion auf dem Magen angezeigt. Sobald die Bauchspeicheldrüse durchblutet ist, entfernen Sie das Blutstillbad aus dem Zwölffingerdarm.

Verwenden Sie dann die Pinzette, um den Zwölffingerdarm anzuheben, und verwenden Sie eine zweite Pinzette, um die Bauchspeicheldrüse vom Darm zu trennen. Ziehen Sie dann die Bauchspeicheldrüse von der Oberseite des Magens und der Milz frei. Zum Schluss hebst du die Bauchspeicheldrüse aus dem Bauch und schneidest sie von den verbliebenen Faszienverbindungen zu Darm, Magen und Milz frei.

Legen Sie die Bauchspeicheldrüse in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und legen Sie es auf Eis. Inkubieren Sie die Bauchspeicheldrüse bei 37 Grad Celsius gemäß den Anweisungen im beigefügten schriftlichen Protokoll. Geben Sie nach der Inkubation 20 Milliliter Medium in die Röhrchen und dissoziieren Sie das Gewebe, indem Sie die Röhrchen innerhalb von 10 Sekunden 40 Mal kräftig schütteln.

Dieser Schritt ist entscheidend für eine optimale Erholung der Veilchen. Spin-Zellen haben 800 Umdrehungen pro Minute. Die Resus in 15 Millilitern Medium ausgeben und die Proben kondensieren.

Gießen Sie die resuspendierte Gülle durch ein 0,419 Millimeter großes Drahtgeflecht und füllen Sie sie in ein frisches konisches 50-Milliliter-Rohr. Spülen Sie das erste Röhrchen mit weiteren 10 Millilitern Medium, das 10% fötales Rinderserum enthält, und gießen Sie es durch das Drahtgeflechtpellet, gießen Sie die Zellen durch Zentrifugation Reus, biegen Sie das Pellet bei fünf Millilitern Raumtemperatur seine undurchsichtige 10 77. Wirbeln Sie dann einige Sekunden lang sanft vortexen, fügen Sie weitere fünf Milliliter seines undurchsichtigen Materials um die Innenseite des Röhrchens hinzu, um die Ösen von der Wand des Röhrchens zu waschen, pipettieren Sie langsam, um 10 Milliliter serumfreies RPMI mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter alle 10 Sekunden an der Seite des Röhrchens aufzutragen.

Eine scharfe Schnittstelle sollte erkennbar sein. Dann drehen Sie die Proben in einer schwingenden Eimerzentrifuge bei 20 Grad Celsius und 900-facher Schwerkraft für 20 Minuten mit sehr langsamer Beschleunigung und ohne Bremsen nach der Zentrifugation, die Inselzellen werden mit einer serologischen Einwegpipette von den exokrinen Zellen getrennt. Übertragen Sie die Ösen von der histo Paque-Medienschnittstelle auf ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

An dieser Stelle können mehrere Röhrchen gepoolt werden, um die Ösenreste zu entfernen, die undurchsichtigen Röhrchen mit serumhaltigem Medium zu füllen und die Röhrchen zu pelletieren, indem die Röhrchen zwei Minuten lang mit 800 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert werden. Dann reus suspendieren Sie die Inselchen in frischen Medien. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens zweimal. Reus.

Hängen Sie die Palette in fünf Milliliter Medium. Legen Sie ein 0,1 Millimeter dickes Nylon-Zellsieb kopfüber auf ein konisches 15-Milliliter-Rohr. Pipettieren Sie die resuspendierte Zellaufschlämmung hindurch, um die Ösen aufzufangen.

Spülen Sie dann die 50-Milliliter-Tube mit weiteren sechs Millilitern Medium aus und passieren Sie es durch das Sieb. Geben Sie einen drei Milliliter großen Tropfen Medium in eine 10 Zentimeter große Petrischale. Drehen Sie das Zellsieb um und tauchen Sie es in den Medientropfen, um die Ösen aufzufangen. Piptieren Sie weitere fünf bis sieben Milliliter Kulturmedium durch das Sieb in die Petrischale.

Um eventuell verbleibende Ösen aus dem Sieb unter einem vierfachen Objektiv zu sammeln, entnehmen Sie die Ösen einzeln mit einer Pipette P 200 und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozünderröhrchen. Diese Bilder zeigen Ösen, die von 12 Wochen alten C 57 schwarzen sechs Mäusen isoliert wurden. Die Reinheit und Qualität der Ösen kann nach Abschluss des Isolationsverfahrens mikroskopisch abgeschätzt werden.

Die beiden hier gezeigten Bilder zeigen beispielsweise ein repräsentatives Feld, in dem Trümmer und exokrine Zellkontaminationen vorhanden sind. Vermeiden Sie bei der Auswahl von Ösen für ein Experiment die Auswahl kontaminierender exokriner Zellen oder Ösen, die ungesund erscheinen. Ösen mit nekrotischen Zentren sind ungesund, wie in dieser Abbildung gezeigt, die 24 Stunden nach der Isolierung aufgenommen wurde, nekrotische Zentren sind unmittelbar nach der Isolierung nicht sichtbar.

Ösen, bei denen sich Zellen ablösen, sind unvermeidlich und können in diesem 24-Stunden-Zeitraffervideo von Ösen bei der Ösentransplantation verwendet werden. Unmittelbar nach der Isolierung entwickeln sich in vielen der Ösen nekrotische Zentren. Diese nekrotischen Zentren scheinen gegen Ende der Aufnahme aus der Öse ausgestoßen zu werden, während die Ösen gezupft werden.

Gruppieren Sie sie so, dass jedes Rohr eine gleichmäßige Verteilung der Ösenqualität und -größe aufweist. Jede Gruppe von 15 Ösen kann z. B. vier große, sechs mittlere und fünf kleine Ösen enthalten. Ort. Die Röhre auf Eisösen kann sofort für die Transplantation verwendet oder manipuliert werden.

Vor dem Gebrauch. Setzen Sie eine sterile Gelladespitze in die Öffnung eines 1,5-Milliliter-Mikroschmelzröhrchens ein, so dass eine sanfte Biegung entsteht, die am schmalen Ende der Spitze eine U-Form bildet. Beide Öffnungen der Spitze sollten direkt nach oben aus dem Mikromüllrohr zeigen.

Entferne vorsichtig eine Tube mit Ösen aus dem Eis. Stellen Sie sicher, dass sich alle Ösen am Boden des Rohres abgesetzt haben. Entnehmen Sie mit einer Pipette P 200 vorsichtig die Ösen in einem minimalen Volumen vom Boden des Röhrchens und übertragen Sie sie auf die vorbereitete gebogene Spitze.

Nachdem die Ösen sedimentiert sind, entfernen Sie so viel wie möglich von dem Medium aus der Spitze, indem Sie das Medium durch die große Öffnung des Ösenlagers Ansaugen Sie das Medium durch die große Öffnung der Gelladespitze mit einer frischen Gelladespitze, die an einer Pipette P 200 befestigt ist. Befestigen Sie das nicht abgeschrägte Ende des Schlauchs an der schmalen Öffnung der Gelladespitze des Insellagers. Befestigen Sie dann die Spitze an einer P 200 Pipette und schieben Sie die Inselchen vorsichtig in den Schlauch.

Verbinden Sie anschließend den nicht abgeschrägten Rand des PE 50-Schlauchs mit der Nadel einer 25-Mikroliter-Hamilton-Spritze. Drücken Sie den Kolben zurück, um den Kolben der Spritze zu drücken, bis die Ösen etwa 0,5 Zentimeter von der abgeschrägten Öffnung entfernt sind. Legen Sie die Spritze beiseite, so dass sich die Ösen in der Nähe der abgeschrägten Öffnung des Schlauchs zu einer einzigen Masse absetzen können, während die Niere für die Aufnahme der Ösen vorbereitet wird.

Bereiten Sie die Operationsstelle vor, indem Sie die Haare abschneiden und die Haut dreimal abwechselnd mit Betadin und 70%igem Isopropylalkohol schrubben. Beginnen Sie die Ösentransplantation, indem Sie eine Zehenkneifung durchführen, um die Anästhesie bei der Empfängermaus zu bestätigen. Platzieren Sie den Schaft eines Glasstabes direkt unter der Maus und unterhalb der Niere senkrecht zum Rückenmark.

Lokalisieren Sie dann die Niere durch die Haut und legen Sie ein steriles OP-Tuch an. Sobald die Niere lokalisiert ist, verwenden Sie eine McFerson Banis-Schere, um einen zwei Zentimeter langen Schnitt durch die Dermis direkt darüber senkrecht zum Rückenmark zu machen. Bei diesem Schnitt wird die Bauchfellwand mit der Schere freigelegt.

Machen Sie einen einen Zentimeter langen Schnitt durch die Peritonealwand in die gleiche Richtung wie der Schnitt durch die Hautschicht, indem Sie den Schaft des Glasstabes als Rückhalt verwenden, drücken Sie die Niere durch die Peritonealöffnung, indem Sie auf die angrenzende Oberfläche drücken. Befeuchten Sie die Oberfläche der freiliegenden Niere mit eiskaltem, sterilem PBS mit einem getränkten Applikator mit Wattespitze. Wiederholen Sie den Schritt bei Bedarf alle paar Minuten, um ein Austrocknen der Nierenkapsel zu verhindern.

Machen Sie mit einer 27-Gauge-Nadel einen 0,2 Zentimeter großen Schnitt durch die Nierenkapsel über die vordere Oberfläche der Niere. Bewegen Sie sich von der linken Seitenseite zur rechten Seitenseite und führen Sie ein flammengezogenes Glaskapillarrohr ein. Sonden Sie durch den zuvor gemachten Schnitt und bewegen Sie ihn in hinterer Richtung entlang der dorsalen Seitenfläche der Niere.

Um einen Beutel zwischen der Nierenkapsel und dem Nierenparenchym zu schaffen, bewegen Sie die Ösen in der vorbereiteten 25-Milliliter-Hamilton-Spritze bis zum äußersten Rand der abgeschrägten Öffnung des flexiblen Schlauchs. Führen Sie dann die abgeschrägte Kante mit der Vorderseite nach oben in den subkapsulären Beutel ein. Die lange Kante steht in Kontakt mit dem Nierenparenchym.

Bewegen Sie den Schlauch an das hinterste Ende der Kapsel. Übertragen Sie dann langsam die Ösen aus dem PE 50 Schlauch in den subkapsulären Beutel, indem Sie den Kolben der Spritze drücken. Während die Ösen den Beutel füllen, ziehen Sie den flexiblen Schlauch langsam zurück, um mehr Platz zu schaffen.

Nachdem Sie den Schlauch aus dem Beutel genommen haben, schieben Sie die Glassonde entlang der Außenfläche der Niere von vorne nach hinten, um die Ösen vorsichtig in das proximale Ende des Beutels zu packen. Heben Sie mit einer gebeugten Armzange die Bauchfellschleimhaut an, die an die Öffnung für die Niere angrenzt. Verwenden Sie dann einen PBS-getränkten Applikator mit Wattespitze, um die Niere vorsichtig zurück in die Bauchhöhle zu schieben.

Schließen Sie die Maus, indem Sie Nähte an der Peritonealwand anbringen und Wundenclips an der Hautschicht anbringen. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig und den Monitor ein. Zur Genesung sollte dem Mäusedarm aceto meine Wasser zur Verfügung gestellt werden.

C Mausösen isoliert. Mit den in diesem Video beschriebenen Methoden wurde eine kurative Dosis in allogene C 57 schwarze sechs Mäuse transplantiert. Der Blutzuckerspiegel ohne Nüchternblutzucker wurde ab dem ersten postoperativen Tag überwacht.

Die Abstoßung ist um den 17. Tag herum bei 20-Gramm-Empfängermäusen zu beobachten, die hier 300 Ösen von einem allogenen Spender erhielten. Die Genesung wurde an Mäusen überwacht, die entweder 150 Ösen oder 300 Ösen von syngenen Spendern erhielten. Bei diesen Transplantaten ist keine Abstoßung zu beobachten, da die Ösen von syngenen Spendern stammen.

Die verabreichte Ösendosis misst die primäre Funktion der Ösen unmittelbar nach der Transplantation. Während bei 150 Ösen eine marginale Genesung zu verzeichnen war, war bei der Transplantation von 300 Ösen eine vollständige Genesung zu beobachten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die kritischen Schritte durchführen, die erforderlich sind, um Mausösen zu isolieren und diese Ösen unter den subkapsulären Raum der Niere zu transplantieren.

Mit etwas Übung entwickeln Sie die Fähigkeit, den Gallengang schnell zu kanülieren, was der schwierigste Schritt dieses Protokolls ist.