Name: Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Erfahren Sie die gerichtete Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in insulinproduzierende Betazell-ähnliche Zellen. Dieses Protokoll demonstriert eine zuverlässige Methode zur Erzeugung funktioneller Betazellen für Diabetesforschung.

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Ines Cherkaoui wurde durch ein Diabetes UK-Stipendium (BDA 18/0005934) an GAR unterstützt, das sich auch beim Wellcome Trust für einen Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC für einen Programmzuschuss (MR/R022259/1), Diabetes UK für einen Projektzuschuss (BDA16/0005485), CRCHUM für Start-up-Fonds, Innovation Canada für einen John R. Evans Leader Award (CFI 42649) bedankt. NIH-NIDDK (R01DK135268) für einen Projektzuschuss und CIHR, JDRF für einen Teamzuschuss (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion und Dr. Harry Leitch für ihre Hilfe bei der Erzeugung und Kultur menschlicher hiPSCs, der NIHR Imperial BRC (Biomedical Research Centre) Organoid Facility, London.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in Pankreas-β-Zellen

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Die erfolgreiche Differenzierung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen hängt von der Optimierung aller Aspekte der routinemäßigen Kultivierung und Passage der ausgewählten hPSCs ab. Dazu gehört die Sicherstellung, dass die Zelllinie einen normalen Karyotyp aufweist, negativ für eine Mykoplasmeninfektion ist und frei von Plasmid- oder viralen Vektorgenomen ist. Darüber hinaus ist es bei der Verwendung von hiPS-Zellen wichtig, die frühesten Passagen, die sich noch in der Umprogrammierung befinden, nicht für Pilotversuche zu verwenden. Diese Experimente sollten in kleinem Maßstab durchgeführt werden, um die hPSC-Linie mit dem besten Differenzierungspotenzial und der optimalen Anzahl von Durchgängen zu identifizieren.
Weitere Parameter, die die Differenzierungseffizienz beeinflussen können, sind die Qualität des verwendeten Stammzellmediums, die Beschichtungsdichte und die Anzahl der Durchgänge10,12. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Effizienz der Differenzierung zu maximieren, indem sichergestellt wird, dass alle relevanten Parameter optimiert sind10.
In jeder Phase werden Differenzierungsmedien mit spezifischen Formulierungen verwendet, um die Differenzierung von hPSCs in β-Zellen zu unterstützen. Activin A und ein Wnt-Agonist werden im Differenzierungsmedium verwendet, um den Übergang zu definitiven Endodermzellen zu initiieren. Während des primitiven Darmröhrchenstadiums wird KGF dem Medium zugesetzt, um die weitere Differenzierung in β-Zellenzu fördern 15, und dieser Einschluss von KGF wird von Tag 6 bis 8 beibehalten, abweichend vom ursprünglichen Protokoll von Sui, Egli et al.10. Während des Pankreas-Vorläuferstadiums wird die spezifische Medienzusammensetzung optimiert, um die Expression des Pdx1-Transkriptionsfaktors zu verbessern. Dies wird durch die Verwendung einer hohen Konzentration an Retinsäure (RA), KGF und LDN193189 erreicht, die den knochenmorphogenetischen Proteinweg (BMP) hemmt8. Wenn die Differenzierung in das endokrine Stadium übergeht, wird das Kulturmedium modifiziert, um die Notch-Signalgebung herunterzuregulieren. Dies wird durch den Einbau von XXI, einem γ-Sekretase-Inhibitor, zusammen mit T3 (Schilddrüsenhormon), RA und RepSox, einem Inhibitor des Activin/BMP/TGF-β-Signalwegs8, erreicht. Diese spezifische Kombination von Verbindungen wird verwendet, um die Differenzierung von Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse in endokrine Vorläuferzellen zu fördern. Um den direkten Differenzierungsprozess zu optimieren, wird schließlich Aphidicolin (APH) während der Differenzierung von Pankreasvorläuferzellen in endokrine Vorläuferzellen eingeführt. Diese Hinzufügung von APH zielt darauf ab, die β-Zell-Differenzierung weiter zu verbessern, und stellt eine deutliche Modifikation gegenüber dem ursprünglichen Protokoll dar, das von Sui, Egli et al.10,11 vorgeschlagen wurde.
Während des Differenzierungsprozesses ist es entscheidend, die Zelldichte zu überwachen und eine Überkonfluenz zu verhindern, da dies die richtige Differenzierung behindern kann. Kulturen mit hoher Dichte können eine hohe Oct4-Expression aufrechterhalten und die Differenzierung zum endgültigen Endoderm hemmen. Das Entfernen des ROCK-Inhibitors während des ersten Waschschritts ist unerlässlich, um die Differenzierung einzuleiten und den pluripotenten Zustand der hPSCs zu verändern. Die Verwendung eines Fluoreszenzmarkers wie Mel1 INS-GFP mit einem am Insulinlocus integrierten GFP erleichtert die Beurteilung des Differenzierungsfortschritts in den Vorläufer- und β-Zell-Stadien der Bauchspeicheldrüse und unterstützt nachgelagerte Experimente14.
Das aktuelle Protokoll zur Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in β-ähnliche Zellen der Bauchspeicheldrüse hat eine Variabilität in der Effizienz zwischen verschiedenen hPSC-Linien gezeigt10. Darüber hinaus weisen die resultierenden β-ähnlichen Zellen im Vergleich zu menschlichen Pankreasinseln eine funktionelle Unreife auf und zeigen eine geringere Insulinsekretion pro Zelle. Um diese Einschränkung weiter zu beheben, kann die In-vivo-Reifung von β-ähnlichen Zellen durch Transplantation von Inselorganoiden in Tiermodelle während der letzten Stadien der Differenzierung erreicht werden 6,7.
Trotz dieser Einschränkungen hat die Differenzierung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen ein erhebliches Potenzial im Vergleich zu bestehenden Methoden 8,9,10. Diese Technik ermöglicht es, eine große Anzahl von β-Zell-ähnlichen Zellen zu erzeugen, die auf Glukose ansprechen und β-Zell-Marker exprimieren (Pdx1 und Nkx6.1, siehe Abbildung 2). Dies geschieht ohne die ethischen, technischen und Quellenbeschränkungen, die mit der Verwendung menschlicher Pankreasinseln verbunden sind. Darüber hinaus hat diese Technik das Potenzial, in der personalisierten Medizin angewendet zu werden, da patientenspezifische β-Zellen für Arzneimitteltests und Krankheitsmodellierung erzeugt werden können 4,6,7. Die Technik könnte auch zukünftige Anwendungen bei der Behandlung von Diabetes haben, die den Verlust oder die Funktionsstörung von Pankreas-β-Zellen beinhalten 4,6,7.

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) haben die einzigartige Fähigkeit, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, was sie zu einer praktikablen Alternative zu menschlichen β-Zellen der Bauchspeicheldrüsemacht 1. Diese hPSCs werden in zwei Typen eingeteilt: embryonale Stammzellen (hESCs), die von der Blastozyste2 abgeleitet sind, und induzierte pluripotente Zellen (hiPSCs), die durch direkte Reprogrammierung somatischer Zellen erzeugtwerden 3. Die Entwicklung von Techniken zur Differenzierung von hPSCs in β-Zellen hat wichtige Auswirkungen sowohl auf die Grundlagenforschung als auch auf die klinische Praxis 1,4. Diabetes mellitus ist eine chronische Krankheit, von der weltweit >400 Millionen Menschen betroffen sind und die auf die Unfähigkeit des Körpers zurückzuführen ist, die Glykämie aufgrund von Fehlfunktionen oder Verlust von β-Zellen der Bauchspeicheldrüse zu regulieren5. Die begrenzte Verfügbarkeit von Pankreas-Inselzellen für die Transplantation hat die Entwicklung von Zellersatztherapien für Diabetesbehindert 2,4,6,7. Die Fähigkeit, glukosereaktive insulinsekretierende Zellen mit hPSCs zu erzeugen, dient als nützliches zelluläres Modell für die Untersuchung der Entwicklung und Funktion menschlicher Inselzellen. Es kann auch verwendet werden, um potenzielle therapeutische Kandidaten für die Diabetesbehandlung in einer kontrollierten Umgebung zu testen. Darüber hinaus haben hPSCs das Potenzial, Pankreas-Inselzellen zu produzieren, die genetisch mit dem Patienten identisch sind, wodurch das Risiko einer Immunabstoßung nach der Transplantation verringertwird 2,4,7.
In den letzten Jahren gab es erhebliche Fortschritte bei der Verfeinerung von hPSC-Kultur- und Differenzierungsprotokollen, was zu einer erhöhten Effizienz und Reproduzierbarkeit des Differenzierungsprozesses zur Erzeugung von Pankreas-β-Zellen führte 8,9.
Das folgende Protokoll beschreibt die wesentlichen Stadien der gerichteten Differenzierung von Pankreas-β-Zellen. Es beinhaltet die Regulation spezifischer zellulärer Signalwege zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Es basiert auf dem von Sui L. et al.10 (2018) entwickelten Protokoll zur Erzeugung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen. Das Protokoll wurde an die jüngsten Aktualisierungen von Sui L. et al.11 (2021) angepasst, da die neuesten Forschungsergebnisse die Bedeutung der Verwendung von Aphidicolin (APH)-Behandlung zur Verbesserung der Differenzierung von β-Zellen betonen. Das aktuelle Protokoll beinhaltet die Zugabe von APH zum Medium in den späteren Phasen des Prozesses. Darüber hinaus wurden in den frühen Stadien der Differenzierung Änderungen an der Zusammensetzung des Mediums im Vergleich zum ursprünglichen Protokoll vorgenommen. Eine bemerkenswerte Änderung ist die Hinzufügung des Keratinozyten-Wachstumsfaktors (KGF) an Tag 6 und bis Tag 8. Der Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) wird von Tag 6 bis Tag 8 eingeführt, was sich geringfügig vom ursprünglichen Protokoll10 unterscheidet, bei dem KGF nicht im Medium der Stufe 4 enthalten war.
Der erste und wesentliche Schritt bei der Erzeugung β-zellähnlicher Zellen ist die gerichtete Differenzierung von hPSCs in das definitive Endoderm (DE), eine primitive Keimschicht, aus der die Epithelauskleidung verschiedener Organe, einschließlich der Bauchspeicheldrüse, hervorgeht. Nach der Bildung von DE differenzieren sich die Zellen in die primitive Darmröhre, gefolgt von der Spezifizierung des hinteren Vorderdarmschicksals. Der hintere Vorderdarm entwickelt sich dann zu Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, die das Potenzial haben, sich in alle Zelltypen der Bauchspeicheldrüse zu differenzieren, einschließlich der endokrinen und exokrinen Zellen. Der nächste Schritt des Prozesses umfasst endokrine Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, aus denen die hormonsezernierenden Zellen hervorgehen, die in den Langerhans-Inseln vorkommen. Am Ende erreicht der Differenzierungsprozess sein Endstadium durch die Herstellung voll funktionsfähiger pankreatischer β-zelliger Zellen 9,10. Es ist wichtig zu beachten, dass dieser Prozess komplex ist und oft eine Optimierung der Kulturbedingungen erfordert, wie z. B. spezifischer Wachstumsfaktoren und extrazellulärer Matrixkomponenten, um die Effizienz und Spezifität der Differenzierung zu verbessern 9,10. Darüber hinaus ist die Erzeugung funktioneller β-Zell-ähnlicher Zellen aus hPSCs in vitro immer noch eine große Herausforderung. Die laufende Forschung konzentriert sich auf die Verbesserung der Differenzierungsprotokolle und die Verbesserung der Reifung und Funktion der resultierenden β-Zellen9.
In diesem Protokoll ist die Verwendung einer sanften Zelldissoziation während der Kultur und Passage von hPSCs unerlässlich, um die Lebensfähigkeit und Pluripotenz der Zellen aufrechtzuerhalten und die Effizienz der Differenzierung in Pankreas-β-Zellen erheblich zu verbessern. Darüber hinaus wurde jedes stadienspezifische Medium akribisch nach dem von Sui L. et al.10 entwickelten Protokoll optimiert, um eine hohe Ausbeute an insulinsekretierenden Zellen in Clustern zu fördern, die der menschlichen Insel sehr ähnlich sind.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL TubeOne Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Starlabs</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 400 6-Well-Platte&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Glucagon&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G2654-100UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Insulin&nbsp;</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NKX6.1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-49672SS</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PDX1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab84987</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4487</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serumfrei&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin, fettsäurefrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloriddihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Calcium/Magnesium frei D-PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamin-KAAD</td><td>Calbiochem</td><td>239804</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose, BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94046-100ML-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>plus GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10566016</td><td>Für Waschmedium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nährstoffgemisch F-12)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Epredi SuperFrost Plus Adhäsionsfolien</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-Sekretase-Hemmer XX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J64904</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>Geltrex 1:1 in kaltes DMEM/F-12-Medium, um eine endgültige Verdünnung von 1:100 zu erzielen.</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Meerschweinchen, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Meerschweinchen, Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150187</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Sekundärantikörper, Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific A-11011</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-7 (KGF) Rekombinantes Protein</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0094</td><td></td></tr><tr><td>Chlorwasserstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP Pen</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG4582 LDN193189</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0559-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>OCT Verbindung 118 mL</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten, Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, Fisher BioReagents</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (PS)</td><td>Thermo Fisher Scientific,15070-063</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes EGF-Protein</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige Deckgläser, 22-fach; 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>RepSox (Hydrochlorid)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung&nbsp; &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>für Waschmedium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.</td></tr><tr><td>Shandon Immu-Mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Endoderm&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td> Tauen <td>Sie das StemFlex Supplement über Nacht bei 4° auf; C, übertragen Sie die Restflüssigkeit der Ergänzungsflasche in StemFlex Basal Medium.</td></tr><tr><td>Stemolecule All-Trans Retinsäure</td><td>Reprocell</td><td>04-0021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Schilddrüsen-Tormone 3 (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 15250061</td> TrypL-Express-Enzym <td></td></tr><tr><td>(1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 12604013</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Platte mit extrem niedrigem Adhärentgehalt für Suspensionskulturen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>38071</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochlorid)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfat</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>Z4750</td><td></td></tr></tbody></table>

optimiertes protokoll zur erzeugung funktioneller insulin-sezernierender zellen der bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten stammzellen

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) können sich in jede Art von Zelle differenzieren, was sie zu einer hervorragenden alternativen Quelle für menschliche β-Zellen der Bauchspeicheldrüse macht. hPS-Zellen können entweder embryonale Stammzellen (hES-Zellen) sein, die aus der Blastozyste stammen, oder induzierte pluripotente Zellen (hiPS-Zellen), die direkt aus somatischen Zellen durch einen Reprogrammierungsprozess erzeugt werden. Hier wird ein videobasiertes Protokoll vorgestellt, um die optimalen Kultur- und Passagebedingungen für hPSCs vor ihrer Differenzierung und anschließenden Erzeugung von insulinproduzierenden Pankreaszellen zu skizzieren. Diese Methodik folgt dem sechsstufigen Prozess der β-Zell-gerichteten Differenzierung, bei dem sich hPSCs in definitives Endoderm (DE), primitive Darmröhre, posteriores Vorderdarmschicksal, Pankreasvorläuferzellen, endokrine Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse und schließlich pankreatische β-Zellen differenzieren. Es ist bemerkenswert, dass diese Differenzierungsmethode einen Zeitraum von 27 Tagen benötigt, um menschliche β-Zellen der Bauchspeicheldrüse zu erzeugen. Das Potenzial der Insulinsekretion wurde durch zwei Experimente bewertet, die Immunfärbung und glukosestimulierte Insulinsekretion umfassten.

Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll bietet einen hocheffizienten Ansatz zur Unterscheidung β-ähnlicher Zellen von hPSCs10. Bei diesem Verfahren wird ein leicht skalierbares 2D-Kultursystem verwendet, das den Einsatz in verschiedenen experimentellen Umgebungen ermöglicht, z. B. bei der Lerndifferenzierung, kleineren Projekten und Labors sowie bei Pilotversuchen, um das Potenzial einer iPSC-Linie für die Differenzierung zu bewerten.
Es ist wichtig, die funktionellen Eigenschaften differenzierter β-Zellen in Inselzellen zu charakterisieren, um einen Einblick in die Glukosehomöostase zu erhalten. Dies wird in der Regel durch verschiedene Experimente erreicht, wie z. B. Immunfärbung für β-Zell-Marker und Insulinexpression sowie Assays zur glukosestimulierten Insulinsekretion (GSIS), die die Inselfunktion als Reaktion auf niedrige und hohe Glukosekonzentrationen testen 12,13. β-Zellen besitzen Signaturgene, darunter Nkx2-2, Pdx1, Nkx6-1 und Neurod1, die für die Etablierung und Aufrechterhaltung der β-Zell-Identität entscheidend sind9. Immunfärbetechniken sind wertvoll für die Untersuchung der Proteinexpression und -lokalisierung in Gewebeschnitten. Die Immunfärbung für β-Zell-Marker kann die Expressionsniveaus wichtiger Marker für die Pankreaslinie beurteilen und Einblicke in die Genauigkeit des Differenzierungsprozesses und die Optimierung für bestimmte Anwendungen geben 9,12.
In dieser Studie wurde die Mel1 InsGFP/w (Mel1 INS-GFP)14 hESC-Reporterlinie verwendet, um Cluster aus verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden, einschließlich β-Zellen, die denen in menschlichen nativen Inselzellen ähneln. Abbildung 2 in diesem Artikel bietet wichtige Erkenntnisse zur Effizienz und Genauigkeit des Differenzierungsprozesses. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Anreicherung von insulinexprimierenden Zellen innerhalb der Pankreaslinie, und diese Zellen zeigen eine glukosestimulierte Insulinsekretion. Dies deutet auf die erfolgreiche Erzeugung funktioneller β-ähnlicher Zellen durch den Differenzierungsprozess hin.
Die differenzierten Zellen wurden mit niedrigen und hohen Glukosekonzentrationen stimuliert, und die GSIS-Ergebnisse zeigten, dass die von Mel1-Zellen abgeleiteten Cluster in ihrer Insulinsekretionsreaktion auf Glukose ähnlich wie Inselzellen funktionierten. Es wurde festgestellt, dass die von Mel1 abgeleiteten Cluster als Reaktion auf hohe Glukosekonzentrationen 100-mal mehr Insulin als Reaktion auf niedrige Glukosekonzentrationen absondern. Insbesondere betrug der Insulingehalt 0,003 ± 0,002 % bei 3,3 mM niedriger Glukose und 0,236 ± 0,197 % bei 16,7 mM hoher Glukose.
Die aus Mel1 INS-GFP hES-Zellen gewonnenen Cluster wurden zusätzlich zum GSIS-Assay weiteren Analysen unterzogen, um ihre Zusammensetzung und Funktionalität zu bestimmen. Insbesondere wurden die Expression von β-Zell-Signaturgenen und das Vorhandensein verschiedener Zelltypen innerhalb der Cluster untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die aus diesem Prozess gewonnene Pankreaslinie in insulinpositiven Zellen stark angereichert ist, was auf einen hohen Erfolg im Differenzierungsprozess von hES-Zellen in β-zellähnliche Zellen hinweist. Darüber hinaus wurde die Expression von Signaturgenen wie Nkx6.1 und Pdx1 untersucht, die für die Etablierung und Aufrechterhaltung von β-Zell-Identitäten wichtig sind. Die Analyse ergab, dass etwa 25 % bzw. 40 % der Zellen Nkx6,1 bzw. Pdx1 exprimierten, was zusätzliche Beweise dafür lieferte, dass die Cluster differenzierte β-ähnliche Zellen enthielten (mittlere Nkx6,1+-Zellen pro Cluster 24,9 % ± 6,2 %, n=9 Cluster, Pdx1+-Zellen 40,2 % ± 6,2 %, n=9, SEM, Abbildung 2). Darüber hinaus enthielten die Cluster andere Zelltypen, wie z. B. Glucagon-positive Zellen, die etwa 15 % der gesamten Zellpopulation ausmachten. Diese Zellen sind typischerweise in Alphazellen von nativen Langerhans-Inseln zu finden, was darauf hindeutet, dass die Cluster in Bezug auf die Zellzusammensetzung menschlichen Inseln sehr ähnlich sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig01.jpg"> Abbildung 1: Differenzierung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen. (A) Schematische Darstellung der in vitro gerichteten Differenzierung von hPSCs in Pankreas-β-Zellen, die sechs aufeinanderfolgende Stufen umfasst: definitive Endoderm-Induktion, primitive Darmschlauchbildung, posteriore Vordarm-Schicksalsspezifikation, Pankreas-Vorläufergeneration, endokrine Vorläuferbildung der Bauchspeicheldrüse und schließlich Pankreas-β-Zell-Differenzierung. Die β-Zell-Differenzierung der Bauchspeicheldrüse nutzt Schlüsselstadien der Entwicklung menschlicher Inselzellen mit der Regulation spezifischer Zellsignalwege zu bestimmten Zeiten. B27: B-27-Ergänzung; Ri: rho-assoziierter Proteinkinase-Inhibitor oder ROCK-Inhibitor; T3: Schilddrüsenhormon; KGF: humanes KGF / FGF-7-Protein; RepSox: Inhibitor des Activin/Nodal/TGF-β Signalwegs; Hemmt ALK5; RA: Retinsäure; ZS: Zinksulfat; UFH: unfraktioniertes Heparin; XX: Gamma-Sekretase-Inhibitor XX; APH: Aphidicolin; EGF: epidermaler Wachstumsfaktor; LDN: BMP-Inhibitor III, LDN-212854; Cyclo: Cyclopamin-KAAD. (B) Bilder der zellulären Morphologie, die in verschiedenen Stadien der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu β-Zellen der Bauchspeicheldrüse aufgenommen wurden. Das erste Bild zeigt humane pluripotente Stammzellen am ersten Tag der Differenzierung (Monoschicht von HPSCs). (C) Am Tag 11 befinden sich die Zellen im Vorläuferstadium der Bauchspeicheldrüse. Maßstabsbalken von 100 μm. (D) Am Tag 12 werden Cluster in den Mikrovertiefungen der 6-Well-Platte nach der Dissoziation der Zellen im Vorläuferstadium der Bauchspeicheldrüse gebildet. (E) An Tag 13 befinden sich die Cluster in einer 6-Well-Platte mit geringer Anhaftung. Maßstabsbalken von 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig02.jpg"> Abbildung 2: Cluster, die aus differenzierten Mel1 InsGFP/w hESC-Reporterlinie14 gewonnen wurden, wurden auf das Vorhandensein von insulinproduzierenden Zellen untersucht, die β-Zell-Reifemarker exprimieren. (A) Immunfluoreszenzbilder der Cluster wurden aus Kryomoldschnitten (5 μm) mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie aufgenommen, die die Dominanz von insulinproduzierenden Zellen (ca. 60%) im Vergleich zu Glucagon-produzierenden Zellen (ca. 15%) (n=9 Cluster, ca. 18.000 Zellen, REM). (B) Immunfluoreszenzbilder der Cluster wurden aus Kryomoldschnitten (5 μm) mittels konfokaler Spinning-Disk-Mikroskopie erhalten, die die Dominanz von insulinproduzierenden Zellen zeigten, die die Pankreas-β-Zell-Marker Nkx6.1 koexprimieren (n = 9 Cluster, ca. 18.000 Zellen). (C) ImageJ-Zellzähler-Makro, das speziell für die Immunfärbung von Markern entwickelt wurde, wurde verwendet, um den Prozentsatz von insulinpositiven, Glucagon-positiven und β-Zellmarkern Nkx6.1-positiven Zellen und β-Zellmarkern Pdx1-positiven Zellen zu bestimmen. (D) Die glukosestimulierte Insulinsekretion von Mel1 InsGFP/w hESC-abgeleiteten Clustern wurde untersucht, die einen 100-fachen Anstieg als Reaktion auf eine hohe Glukosestimulation (16,7 mM Glukose) in den differenzierten Clustern (n=9, SEM) zeigte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1: Zusammenfassung der Medienzusammensetzung für die gerichtete Differenzierung. Diese Tabelle enthält eine Zusammenfassung der Medienzusammensetzung, die für jeden Tag/jedes Stadium der gerichteten Differenzierung auf Stammzellmatrix und -medium zusammen mit dem glukosestimulierten Insulinsekretionspuffer verwendet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/Table%201.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die gerichtete Differenzierung und funktionelle Analyse von β-zellähnlichen Zellen vor. Wir beschreiben optimale Kulturbedingungen und Passagen für humane pluripotente Stammzellen, bevor insulinproduzierende Pankreaszellen erzeugt werden. Die sechsstufige Differenzierung schreitet von der endgültigen Endodermbildung bis hin zu funktionellen β-Zell-ähnlichen Zellen fort, die Insulin als Reaktion auf Glukose absondern.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

Eine hohe und konsistente Effizienz im Differenzierungsprozess für die Umwandlung pluripotenter Stammzellen in menschliche Betazellen zu erreichen, ist eine bemerkenswerte Herausforderung. Diese Herausforderung wird durch die Präzision und die Konsistenz beeinflusst, mit der der Experimentator das Protokoll befolgt. Darüber hinaus ist die Menge der in jedem Experiment erhaltenen Betazellen sehr unterschiedlich, was zu einer verringerten Funktion der Betazellen über mehrere Experimente hinweg führen kann.Im Zusammenhang mit der Forschung an Betazellen mit hohem Leptingehalt bei Diabetes ist die Verfügbarkeit von Leichenösenspendern recht begrenzt. Folglich bietet die Verwendung von stammzelldifferenzierten Betazellen ein unbegrenztes und reichliches Angebot an insulinsekretierenden Zellen. Die Differenzierung von Betazellen ist ein entscheidender Fortschritt in unserem Bereich und bietet zahlreiche Vorteile.Es ermöglicht uns, die Entwicklung und Funktion von Betazellen zu erforschen, was zu einem tieferen Verständnis der Ursachen von Diabetes und Betazellfunktionsstörungen führt. Wir wollen diese Technik für unsere Forschung nutzen, die sich auf die Genetik von Diabetes konzentriert. Unser primäres Ziel ist es, uns auf die Mutation bestimmter Gene zu konzentrieren, die Betazellen und die Funktion der Ösen beeinflussen können.Dieses Protokoll wird also den Zugang zu menschlichen Ösen erleichtern, die aus präpotenten Stammzellen mit Mutationen von Interesse stammen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die aktuelle Studie beschreibt eine gerichtete Differenzierung Ansatz bei der Induktion von Pankreas-Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen. Von großer Bedeutung ist der Befund, dass Endothelzellen Co-Kultur vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen in Insulin exprimierenden Zellen.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Reinigung von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen, die in Richtung der endgültigen Endoderm zur Verbesserung der Downstream-Anwendungen und weitere Differenzierungen begangen werden.

Eine schnelle und effiziente Methode zur Reinigung von Entodermzellen generiert aus humanen embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir eine 4-Stufen - Protokoll an humanen embryonalen Stammzellen zu NKX6-1 + Pankreas - Vorläufern in vitro zu differenzieren. Dieses Protokoll kann auf einer Vielzahl von menschlichen pluripotenten Stammzelllinien angewendet werden.

Effiziente Differenzierung von pluripotenten Stammzellen zu NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Vorläufern

Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Generation der Fußabdruck-freie induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse in den Feeder-freien Bedingungen, gefolgt von Bearbeitung mit CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins und Charakterisierung der geänderten einzellige Klone.

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um Insulin mit dem Ausdruck 3D murinen Pancreatoids von Pankreas Stammväter frei schwebenden e10.5 getrennt und die damit verbundenen Mesenchym zu generieren.

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.

Effiziente Generation der Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Bauchspeicheldrüsen-Vorfahren aus hPSCs in Haftung Kulturen

Dieses Protokoll stellt einen Vergleich zwischen zwei verschiedenen Induktionsprotokollen zur Differenzierung menschlicher Zellpulpa-Stammzellen (hDPSCs) gegenüber Pankreaslinien in vitrodar: dem integrativen Protokoll und dem nicht-integrativen Protokoll. Das integrative Protokoll erzeugt mehr insulinproduzierende Zellen (IPCs).

In vitro Induktion von menschlichen Zellpulpa-Stammzellen in Pankreaslinien

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

Die Differenzierung von Stammzellen in Inselzellen bietet eine alternative Lösung zur herkömmlichen Diabetesbehandlung und Krankheitsmodellierung. Wir beschreiben ein detailliertes Stammzellkulturprotokoll, das ein kommerzielles Differenzierungskit mit einer zuvor validierten Methode kombiniert, um die Herstellung von Insulin sezernierenden, aus Stammzellen gewonnenen Inseln in einer Schale zu unterstützen.

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu insulinproduzierenden Inselclustern

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Erfahren Sie die gerichtete Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen in insulinproduzierende Betazell-ähnliche Zellen. Dieses Protokoll demonstriert eine zuverlässige Methode zur Erzeugung funktioneller Betazellen für Diabetesforschung.

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen (Video) | JoVE Journal

Optimiertes Protokoll zur Erzeugung funktioneller Insulin-sezernierender Zellen der Bauchspeicheldrüse aus humanen pluripotenten Stammzellen

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