Messung In Vitro ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die in vitro ATPase-Aktivität von gereinigten Proteinen für die funktionelle Charakterisierung zu quantifizieren. Diese Methode kann verwendet werden, um neue putative ATPasen zu charakterisieren, die wirksamen potentiellen Aktivatoren oder Inhibitoren zu bewerten und den Beitrag bestimmter Domänen oder Reste zur ATPase-Aktivität zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine einfache, empfindliche Methode zur Messung der In-vitro-ATPase-Aktivität handelt und leicht optimiert werden kann.

Bereiten Sie Vorräte aller notwendigen Reagenzien für die Inkubation mit gereinigtem Protein vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie 100 millimolares Magnesiumchlorid und 100 millimolares ATP im Verhältnis eins zu eins, kurz bevor Sie die ATP-Hydrolysereaktion starten. Bereiten Sie 1,5-Milliliter-Röhrchen vor und etikettieren Sie sie, um während der gesamten Reaktion in regelmäßigen Abständen Proben zu entnehmen.

Bereiten Sie Röhrchen für die Probenentnahme zu Zeiten von null sowie zu Zeiten von 15, 30, 45 und 60 Minuten vor. Geben Sie 245 Mikroliter 1x HNG-Puffer in jedes Röhrchen, um die aus den ATP-Hydrolysereaktionen entnommenen Proben in einer Verdünnung von eins auf 50 zu verdünnen. Bereiten Sie als Nächstes ein Bad aus Trockeneis und Ethanol vor, um die Proben schnell einzufrieren und die Reaktion zu stoppen.

Geben Sie in einen Gummieiskübel oder einen anderen sicheren Behälter mehrere Stücke Trockeneis und gießen Sie vorsichtig genug 70 % bis 100 % Ethanol ein, um das Trockeneis zu bedecken. Verdünnen Sie das gereinigte Protein in 1X HNG-Puffer und bewahren Sie es auf Eis auf. Richten Sie die ATP-Hydrolysereaktionen in den vorbereiteten 0,5-Milliliter-Röhrchen ein, indem Sie ein vorher berechnetes Volumen Wasser hinzufügen, um ein endgültiges Reaktionsvolumen von 30 Mikrolitern zu erreichen.

Gefolgt von sechs Mikrolitern 5X HNG oder einem anderen Puffer, drei Mikrolitern 100 Millimolar Magnesiumchlorid ATP-Gemisch und 0,25 bis fünf mikromolare Proteine. Inkubieren Sie eine Negativkontrollbedingung nur mit Puffer, in der kein Protein hinzugefügt wird. Als nächstes entfernen Sie fünf Mikroliter aus der Reaktion zu Zeiten Null.

Dann verdünnen Sie das Aliquot eins bis 50 in dem vorbereiteten 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 245 Mikrolitern HNG-Puffer. Frieren Sie die Probe sofort im Trockeneis-Ethanolbad ein. Inkubieren Sie Reaktionen bei 37 Grad Celsius, damit die ATP-Hydrolyse eine Stunde lang stattfinden kann.

In jedem Intervall werden fünf Mikroliter-Aliquots aus der Reaktion entnommen und wie zuvor in markierte Probenröhrchen mit HNG-Puffer gegeben. Am Ende der ATP-Hydrolysereaktion werden die verdünnten Proben zur Lagerung in einen Gefrierschrank mit 80 Grad Celsius gebracht. Um sicherzustellen, dass alle Proben vollständig eingefroren sind, warten Sie mindestens 10 Minuten, bevor Sie fortfahren.

Die verdünnten Proben, die die Aliquote der ATP-Hydrolysereaktion von jedem Zeitpunkt enthalten, werden bei Raumtemperatur aufgetaut. Bereiten Sie als Nächstes eine 96-Well-Platte mit Proben und Phosphatstandards vor. In einem 0,5-Milliliter-Röhrchen verdünnen Sie den Phosphatstandard von 800 Mikromolar auf 40 Mikromol, indem Sie 5,5 Mikroliter des Standards zu 104,5 Mikrolitern HNG-Puffer hinzufügen.

Gut mischen und 100 Mikroliter dieses 40-mikromolaren Phosphatstandards in die Vertiefung A1 der 96-Well-Platte geben. Geben Sie 50 Mikroliter HNG-Puffer in die Vertiefungen B1 bis H1, um den Phosphatstandard in einer Reihe von eins zu eins zu verdünnen. Entnehmen Sie 50 Mikroliter 40 mikromolares Phosphat aus Vertiefung A1, geben Sie es zu den 50 Mikrolitern Assay-Puffer in Vertiefung B1 und mischen Sie.

Entfernen Sie dann 50 Mikroliter aus Vertiefung B1 und fügen Sie sie zu Vertiefung C1 hinzu, wobei die Verdünnung durch Vertiefung G1 fortgesetzt wird. Entsorgen Sie nach dem Mischen 50 Mikroliter aus der Vertiefung G1, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung das gleiche Volumen hat. Nun, H1 sollte nur Puffer enthalten, um einen Phosphatstandard von 40 bis null Mikromolar zu schaffen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter jeder Probe in doppelter Ausführung auf die Platte.

Fügen Sie Stichproben vom gleichen Zeitpunkt in Spalten vertikal und von verschiedenen Zeitpunkten horizontal hinzu. Dies ermöglicht bis zu acht Proben und fünf Zeitpunkte pro Platte. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um genügend Malachitgrünes Meliptatphosphat-Nachweisreagenz zu entfernen, um 100 Mikroliter in jede der Vertiefungen mit Proben und Standards zu geben.

Geben Sie das Detektionsreagenz in eine Schale, um das Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette zu erleichtern. Gießen Sie das Nachweisreagenz nicht direkt in die Schale, da es wahrscheinlich zu einer Phosphatkontamination kommt. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter des Phosphatnachweisreagenzes in jede Vertiefung und mischen Sie vorsichtig, indem Sie eine gleichbleibende Anzahl von Malen auf und ab pipettieren, ohne Blasen zu bilden, und zwar in der Reihenfolge vom letzten Zeitpunkt bis zum ersten Zeitpunkt.

Lassen Sie die Platte 25 Minuten bei Raumtemperatur oder gemäß den Anweisungen des Herstellers stehen. Um die Ergebnisse zu quantifizieren, lesen Sie die Absorption der Proben bei 650 Nanometern mit einem Absorptions-Mikroplatten-Reader ab. Es werden repräsentative Ergebnisse von kinetischen und Endpunkt-ATPasen gezeigt, in denen die Aktivität von Wildtyp- und Mutantenformen der Typ-2-Sekretion ATPase/EPSE in Gegenwart und Abwesenheit eines Stimulans Cardiolipin bestimmt wird.

Hier sind die Ergebnisse einer kinetischen Cardiolipin-stimulierten ATPase dargestellt, die die lineare Phosphatfreisetzung über die Zeit für Wildtyp-EPSE und eine Doppellysinmutante zeigt, wobei Rinderserumalbumin als Negativkontrolle diente. Diese Daten können als die pro Minute freigesetzte Phosphatmenge dividiert durch die Proteinkonzentration dargestellt werden, um die ATPase-Aktivität jedes Proteins zu quantifizieren und zu vergleichen. Die Daten deuten darauf hin, dass zwei Lysinreste, K417 und K419, zur Cardiolipin-stimulierten ATPase-Aktivität von EPSE beitragen.

Der Vergleich der ATPase-Aktivität der gleichen Proteine ohne Cardiolipin-Stimulation zeigt, dass diese beiden Lysinreste nicht zur geringen Basalaktivität von EPSE beitragen, sondern vielmehr zur Fähigkeit des Proteins, durch Cardiolipin stimuliert zu werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die ATPase-Aktivität von gereinigten Proteinen schnell und genau quantifizieren können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Empfindlichkeit des Phosphatnachweisreagenzes zu berücksichtigen.

Um eine Phosphatkontamination zu vermeiden, empfehlen wir die Verwendung von Einweg-Plastikgeschirr und Reinstwasser und die Durchführung einer Größenausschluss- oder Ionenaustauschchromatographie nach der Proteinreinigung.