Dünnschichtchromatographie-basierter Enzymaktivitätsassay: Eine Technik zur Bestimmung der In-vitro-Pyrophosphokinase-Aktivität mittels Dünnschichtchromatographie

Pyrophosphokinase katalysiert den Diphosphat- oder Pyrophosphattransfer von Nukleotidvorläufern wie Adenosintriphosphat (ATP) zu Substraten wie Guanosindiphosphat (GDP). Dabei entsteht Guanosintetraphosphat – ein wichtiges Signalmolekül.

Zur Bestimmung der Pyrophosphokinase-Aktivität wird ein Reaktionsgemisch aus GDPs und radioaktiv markierten ATPs in einem geeigneten Puffer hergestellt, der mit Magnesiumchlorid ergänzt wird. Geben Sie die gewünschte Menge Pyrophosphokinase in das Reaktionsgemisch und inkubieren Sie.

Im Laufe der Zeit beginnt die Pyrophosphokinase in Gegenwart von Magnesiumionen, den radioaktiv markierten Pyrophosphatanteil von ATP auf GDP zu übertragen, wodurch radioaktives Guanosintetraphosphat entsteht.

Nehmen Sie nun eine Dünnschichtchromatographie oder DC, eine Platte, die mit Polyethylenimin-Cellulose vorbeschichtet ist - einer stationären Phase auf Basis eines kationischen Polymers. Lokalisieren Sie Aliquots der Analyten des Reaktionsgemisches in der Nähe der DC-Plattenbasis zu verschiedenen Zeitpunkten, um die Reaktion zu stoppen und den Fortschritt zu bewerten.

Tauchen Sie die Platte in eine Glaskammer, die monobasisches Kaliumphosphat enthält - ein Lösungsmittel in der mobilen Phase. Wenn sich die Lösungsmittelfront nach oben bewegt, beginnen negativ geladene Analyten aufgrund ihrer Affinität zur positiv geladenen stationären Phase zu migrieren.

Die Unterschiede in den negativen Ladungen und dem Gewicht unterschiedlich phosphorylierter Analyten bestimmen ihre relative Migration auf der DC-Platte, so dass sie als unterschiedliche Banden immobilisiert werden können.

Wenn die Lösungsmittelfront den gewünschten Abstand erreicht hat, entfernen Sie die Platte und trocknen Sie sie an der Luft. Messung der Intensität des radioaktiven Signals, die dem radioaktiv markierten ATP-Abbau und der Guanosintetraphosphat-Akkumulation entspricht, um die Pyrophosphokinase-Aktivität zu analysieren.

Bereiten Sie vor der Durchführung der Reaktion PEI-Zellulose-Dünnschichtchromatographieplatten vor, indem Sie sie in deionisiertem Wasser waschen. Legen Sie die Platten in eine Glaskammer mit doppelt destilliertem Wasser bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 Zentimetern. Nachdem Sie das Wasser zur Oberseite der Platte wandern lassen, nehmen Sie die Platten aus der Glaskammer und lassen Sie sie über Nacht auf einem Rost trocknen.

Markieren Sie die trockenen Platten 2 Zentimeter von einer Kante entfernt mit einem weichen Bleistift, um anzugeben, wo die Proben für die TLC aufgetragen werden. Bei 2-Mikroliter-Proben Proben im Abstand von mindestens 1 Zentimeter auftragen. Lassen Sie bei der Planung von Experimenten immer einen Punkt auf jeder Platte ungenutzt, um als leere Spur für die Probenquantifizierung zu dienen.

Um den Enzymaktivitätsassay durchzuführen, bereiten Sie einzelne Reaktionen mit ^γ-32P-ATP vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie das RSH hinzu, nachdem die anderen Komponenten gemischt wurden, da die Zugabe von RSH zu der nukleotidhaltigen Mischung den enzymatischen Aktivitätsassay einleitet.

Um zu verhindern, dass die ATP-Hydrolyse die Nukleaseaktivität kontaminiert, bauen Sie eine 10-Mikroliter-Reaktion zusammen, die kein Protein enthält, und inkubieren Sie sie parallel. 2 Mikroliterproben bei t = 0 und am Ende des Experiments prüfen, um sicherzustellen, dass ATP in Abwesenheit von Protein nicht hydrolysiert wurde.

Unmittelbar nach der Zugabe von RSH werden 2 Mikroliter entnommen und als t = 0-Minuten-Probe auf die markierte PEI-Zelluloseplatte aufgetragen.

Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius und entfernen Sie 2 Mikroliter Aliquots zu den gewünschten Zeitpunkten. Nachdem alle Aliquote gesammelt wurden, führen Sie eine Dünnschichtchromatographie durch, indem Sie die Chromatographiekammer mit 1,5 molaren monobasischen Kaliumphosphat bis zu einer Tiefe von 0,5 Zentimetern füllen. Tauchen Sie den unteren Rand der Platte in Lösungsmittel und lassen Sie das Lösungsmittel etwa 90 Minuten lang an die Oberseite der Platte wandern.

Nehmen Sie die Platte aus dem Chromatographie-Tank und legen Sie sie auf ein Tischtrockengestell, um sie über Nacht an der Luft zu trocknen. Nachdem die Platte getrocknet ist, wickeln Sie die Platte in eine Plastikfolie ein, um eine Übertragung von radioaktivem Material auf die Bildkassette zu vermeiden, und analysieren Sie sie durch Autoradiographie.

Die PEI-Zelluloseplatte, die die getrennten Reaktionen enthält, wird vier Stunden lang bei Raumtemperatur einer Phosphorimager-Kassette ausgesetzt. Nach der Belichtung die Kassette auf einem Phosphorimager abbilden.

Zeichnen Sie mithilfe von Imaging-Software mit einer grafischen Benutzeroberfläche interessante Bereiche oder ROIs, indem Sie zuerst "Rechteck zeichnen" auswählen. Zeichnen Sie dann mit der Maus rechteckige ROIs um eine gesamte Lane und die ATP- und Guanosintetraphosphat-Spots, die in dieser Lane enthalten sind.

Verwenden Sie die Befehle "Auswählen, Kopieren und Einfügen", um identische ROIs innerhalb der anderen Lanes zu zeichnen, um sicherzustellen, dass die ROIs Signale in identischen Bereichen in jeder Lane messen. Beziehen Sie ROIs aus einer ungenutzten Bahn ein, die als Rohlinge verwendet werden sollen.

Über die Schaltfläche "Analysieren | Werkzeuge | ROI-Manager | Add" der Imaging-Software und wählen Sie alle ROIs aus, die auf der PEI-Zelluloseplatte gezeichnet wurden. Verwenden Sie nun die Schaltfläche "Analysieren | Maße einstellen | Messen", um die Signalintensität innerhalb jedes ROI zu quantifizieren, und exportieren Sie die Messungen als Tabelle. Subtrahieren Sie in der Tabelle leere ROI-Werte von experimentellen Signalen.