Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Das übergeordnete Ziel dieses histologischen und bildgebenden Protokolls ist es, ein robustes System zu präsentieren, das die Epitol-Antigenität und die strukturelle Integrität der Haut bewahrt und eine vollständige Ausnutzung der konfokalen Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen zu beantworten, bei denen es erforderlich ist, die Natur jeder Art von Zelle innerhalb einer komplexen dreidimensionalen Gewebearchitektur zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu histologischen Standardtechniken besteht darin, dass sie robust und einfach durchzuführen ist.

Darüber hinaus ergänzt das Protokoll die dreidimensionale Analyse in der konfokalen Mikroskopie perfekt. Beginnen Sie damit, die Haut aus dem dorsalen medialen Bereich einer Maus in rechteckige Stücke zu schneiden. Jedes Stück sollte so dimensioniert sein, dass es in den Boden einer Kryoform passt.

Hier wird eine einen Quadratzentimeter große Fläche der Rückenhaut demonstriert, die in eine 22 Millimeter mal 30 Millimeter mal 20 Millimeter große Kryoform passt. Schieben Sie nach dem Fixieren die gewaschene Haut auf den Boden der mit OCT gefüllten Form, so dass sie bündig mit dem Boden abschließt. Markieren Sie die Ausrichtung der Haarfollikel auf dem Kryomold, da dies die Ausrichtung des Kryo-Stat-Schnitts bestimmt.

Übertragen Sie die Kryoblöcke auf eine Metallplatte in einem Gefrierschrank mit minus 80 Grad, um ein Aufschwimmen und Verrutschen des Gewebes zu verhindern. Überwachen Sie den Gefrierprozess, um die Ausrichtung der Haut am Boden des Kryomolds beizubehalten, da unsichtbare Luftblasen dazu führen können, dass die Haut an die Oberfläche des Kryomolds steigt. Beginnen Sie damit, einen gefrorenen Kryoblock mit der Ausrichtung der Haarfollikel auf dem Stadium eines Kryostaten zu befestigen, wie auf dem Kryomold entlang der Schnittebene angegeben.

Die richtige Einstellung der genauen Ausrichtung der Haarfollikel auf dem Kryostaten ist von entscheidender Bedeutung, da dieser Schritt die Schnittebene bestimmt, die Hautschnitte erzeugt, bei denen die gesamte Länge der Haarfollikel intakt ist. Verwenden Sie den Kryostaten, um einen 100-Mikron-Schnitt zu schneiden. Fassen Sie das OCT mit einer Pinzette um das eingebettete Hautstück und übertragen Sie den Schnitt aus dem Kryostaten in die mit PBS gefüllte 100-Millimeter-Kultur.

Bei Raumtemperatur löst das PBS das OCT auf und hinterlässt Hautstücke, die mit einer Pinzette leicht zu handhaben sind. Nach dem Schneiden die schwimmenden Hautabschnitte mit einer Pinzette in die Vertiefung einer 12-Well-Platte mit 2,5 Millilitern PBS übertragen. Beginnen Sie mit der Immunfluoreszenzmarkierung, indem Sie zunächst 500 Mikroliter PB-Puffer in markierte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben.

Übertragen Sie die Hautscheiben vorsichtig mit einer Pinzette von der 12-Well-Platte in die Röhrchen, um sie zu verstopfen. Stellen Sie sicher, dass alle Hautscheiben vollständig untergetaucht sind. Stellen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 10 Schwingungen pro Minute oder weniger auf eine Wippe.

Markieren Sie separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Hautscheibe und fügen Sie 500 Mikroliter PB-Puffer hinzu, der die entsprechende Menge an Primärantikörper enthält. Nach einer Stunde Blockierung werden die Hautscheiben in die frisch vorbereiteten Röhrchen mit den Antikörpern überführt. Inkubieren Sie die Scheiben bei vier Grad Celsius über Nacht bei niedriger Geschwindigkeit auf einer Wippe.

Am nächsten Tag die Scheiben in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern PBS umfüllen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einer Wippe waschen. Übertragen Sie dann die Scheiben in separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern PB-Puffer mit der entsprechenden Konzentration von Sekundärantikörpern und DAPI. Eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, auf Wunsch mit Schaukeln, die Proben können bis zu vier Tage bei vier Grad Celsius bis zur weiteren Verarbeitung gelagert werden.

Vor der Bildgebung werden die Hautscheiben in separate Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern PBS übertragen, um die Sekundärantikörper und DAPI zu waschen. Legen Sie dann einen 22 Milliliter x 50 Milliliter großen Deckslip auf einen dunklen Hintergrund unter ein Präpariermikroskop. Verwenden Sie anschließend eine 1.000-Mikroliter-Pipette, bei der das Ende der Spitze abgeschnitten ist, um einen Tropfen 100%iges Glycerin auf den Deckglas zu geben.

Übertragen Sie die Hautscheibe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf das Glycerintröpfchen. Während Sie durch das Präpariermikroskop schauen, wickeln Sie dann mit einer spitzen Pinzette die zusammengerollten Hautscheiben vorsichtig ab, indem Sie sie wieder in ihre natürliche Form bringen, während sie in Glycerin schwimmen. Erzwingen Sie nicht das unnatürliche Aufrichten der Scheibe, da dies zu einer Schädigung des Gewebes führen kann.

Sobald die gesamte Länge des Abschnitts richtig ausgerichtet und auf dem Deckglas abgeflacht ist. Montieren Sie das Gewebe auf einen normalen Objektträger, dieser Schritt begradigt die Hautscheibe weiter. Stellen Sie sich die in Glycerin montierten Hautschnitte innerhalb der nächsten zwei Tage vor.

Dieses Bild zeigt einen 10 Mikrometer dicken, klassisch gewonnenen Kryoschnitt der Haut, der mit Integrin alpha sechs und Integrin alpha acht markiert ist, um das epidermale Kompartiment bzw. die direktionalen Pili-Muskeln sichtbar zu machen. Dieser 100 Mikrometer dicke 3D-Gewebequerschnitt wurde auf die gleiche Weise beschriftet. Das gezeigte Bild zeigt die maximalen Projektionen eines großen Z-Stapels.

Details aus beiden Bildern werden hier nebeneinander verglichen, in den klassischen Schnellschnitten wurden die meisten Haarfollikel, die mit Integrin alpha sechs visualisiert wurden, nicht über die gesamte Länge geschnitten, wodurch im Vergleich zu horizontalen ganzen Halterungen überwiegend unvollständige Haarfollikel pro Schnitt erzeugt wurden. Intakte Haarfollikel und intakte Musculus arrector pili wurden sowohl im klassischen als auch im horizontalen Homemount-Schnitt quantifiziert. Ein Abschnitt für das biologische Replikat wurde quantifiziert, wie hier zu sehen, der gesamte Mount-Abschnitt hat einen höheren Anteil an intakten Follikeln und Arrector Pili-Muskeln.

Einmal gemeistert, kann diese Kryosektionstechnik mit Geschwindigkeiten von mehr als 15 Schnitten pro Minute durchgeführt werden, wobei bei korrekter Montage perfekt ausgerichtete Proben erzielt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dicke Gewebequerschnitte in einer dreidimensionalen Umgebung verarbeitet und analysiert.