Name: Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Lernen Sie ein neues Protokoll zur Verarbeitung und Bildgebung dicker Hautgewebequerschnitte mit konfokaler Mikroskopie. Diese Methode erhält Antigenität und strukturelle Integrität für die 3D-Analyse.

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Die Autoren bestätigen das Sponsoring von Thermo-Fisher Scientific und danken dem Nikon Imaging Center am Kings College London für die Unterstützung bei der konfokalen Bildaufnahme.

Alle Tierversuche unterlagen einer örtlichen ethischen Zustimmung und wurden unter den Bedingungen einer britischen Regierung Home Office Lizenz durchgeführt. 1. Hauternte und Kryokonservierung <ol><li> Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 25 ml 4% PFA und zwei 100-mm-Kulturschalen mit 25 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. </li><li> Füllen Sie rechteckige abziehbare Kryomaten um zwei Drittel mit optimaler Schnitttemperatur-Verbindung (OCT). </li><li> Legen Sie eine Metallplatte, auf der die Kryoblöcke in einem späteren Schritt platziert werden können, in die -80 ° C Gefrierschrank. </li></ol></li><li> Hauternte, Fixierung und Kryokonservierung. <ol><li> Clip die dorsale Region der Tier-Leiche mit einem trockenen elektrischen Rasierer. ANMERKUNG: In diesem Beispiel wurden postnatale Tag 21 Wildtyp-Mäuse verwendet. </li><li> Ernten Sie die interessanten Bereiche auf der Haut. HINWEIS: Die dorsomediale Region der Maushaut ( <stronG class = &quot;xfig&quot;&gt; Abbildung 1a) enthält den höchsten Prozentsatz der Haarfollikel, die gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet sind, was eine optimale Ausrichtung für das Schneiden ermöglicht. Die Entfernung des zugrunde liegenden nicht-dermalen Gewebes ist nicht erforderlich, kann aber bei Bedarf durchgeführt werden. </li><li> Schneiden Sie die geerntete Haut in rechteckige Stücke von passender Größe, um in den Boden der Kryomold passen, wobei das Richtungswachstum der Haarfollikel Getreide zu berücksichtigen. HINWEIS: Kleinere Hautscheiben sind für Anfänger einfacher zu handhaben, da sie sich während der Inkubations- und Montageprozesse weniger verwickeln. Das hier gezeigte Beispiel ist ein ~ 1 cm 2 Bereich der dorsalen Haut, der in eine 22 x 30 x 20 mm Kryomold passt ( Abbildung 2a ). </li><li> Fixieren Sie die Haut bei Raumtemperatur in 25 ml 4% PFA für 10-30 min, abhängig von der Dicke der Hautproben ( Abbildung 1b ). </li><li> Die Hautproben zweimal in 25 ml PBS waschenFür mindestens 5 min ( Abbildung 1b ). </li><li> Tauchen Sie die Hautproben auf ein Papiertuch, um das Gewebe von überschüssigem PBS sorgfältig abzulassen, was zu einer Kristallisation während des Gefrierprozesses führen kann und die Ergebnisse der Kryosektion beeinflussen kann. HINWEIS: Ein Standard-Saccharose-Gradient ist nicht erforderlich. Dies kann aber auch nach eigenem Ermessen in das Protokoll aufgenommen werden. </li><li> Achten Sie auf die Orientierung der Haarfollikel für jede Hautprobe. Verwenden Sie ein Seziermikroskop für visuelle Hilfe (vor allem jemand, der das Protokoll zum ersten Mal durchführt). Setzen Sie die Hautprobe in die OCT-gefüllte Kryomille ein und entbinden Sie alle Bereiche der Haut mit OCT, indem Sie Luftblasen entfernen, die an der Oberfläche des abgeschnittenen Haares mit einer Pinzette befestigt sind ( Abb. 2a und 2b ). </li><li> Schieben Sie die Haut auf den Boden des OCT gefüllten Blocks, so dass es bündig mit dem Boden liegt. HINWEIS: Die Haut kann in jede Richtung ausgerichtet werdenS lang wie das Korn der Haarfollikel für richtige Schneidverfahren bekannt ist. Die Kryomillen werden neu ausgerichtet, wenn die Blöcke an den Kryostaten zum Kryoschweißen angeschlossen sind. Markiere die Haarfollikelorientierung auf der Kryomold, da dieser Schritt die nachfolgende Orientierung des Kryostatschnittes bestimmt. </li><li> Übertragen Sie die Kryoblöcke auf die Metallplatte in der Gefrierschrank -80 ° C, um das Schwimmen und die Verlagerung des Gewebes zu vermeiden. </li><li> Überwachen Sie den Einfrierprozess, um die Ausrichtung der Haut an der Unterseite der Kryomold aufrechtzuerhalten, da unsichtbare Luftblasen dazu führen können, dass die Haut auf die Oberfläche der Kryomille aufsteigt. HINWEIS: Kryomaten mit gefrorenem Gewebe können für mehr als ein Jahr bei -80 ° C gelagert werden und können für weitere Abschnitte wiederverwendet werden. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ernte und Fixierung der Maushaut. </stroNg&gt; ( A ) Das Hautgewebe wurde aus der dorsomedialen Region des Tierkadaveres geerntet. Haarfollikel in diesem Bereich sind gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet und erlauben somit eine optimale Orientierung während des Schnittes, wie durch die Pfeile angedeutet. ( B ) Nach dem Schneiden von Quadraten einer geeigneten Grße, die in die Kryomille passt, wurde das Hautgewebe für 15 min in 4% PFA fixiert und zweimal in PBS für jeweils 5 min gewaschen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 2. Dickes Gewebe Querschnitt <ol><li> Vorbereitung und Gewebeorientierung auf den Kryostaten aufzubauen. <ol><li> Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 15 ml PBS vor. Legen Sie es auf einen leicht zugänglichen Bereich auf dem Kryostat. Zusätzlich wird eine 12-Well-Platte mit 2,5 ml PBS pro Well hergestellt; Etikett nach den Proben für die Langzeitlagerung der SeBei 4 ° C. Verwenden Sie Pinzette, um die Abschnitte zu behandeln. </li><li> Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -20 ° C ein. HINWEIS: Die Temperatur kann den Schnitt beeinflussen, aber eine gute Anleitung ist bei -20 ° C zu starten. </li><li> Um Abschnitte zu erhalten, die etwa zwei Haarfollikel dick sind, stellen Sie den Kryostaten so ein, dass er 150 μm dick ist. HINWEIS: Die Dicke des Abschnitts kann je nach Bedarf des Benutzers und den Einschränkungen des Mikroskops variiert werden, die für die Analyse verwendet werden. HINWEIS: Die Orientierung der Probe ist entscheidend für die Erzielung von Hautabschnitten mit Haarfollikeln in der entsprechenden Orientierung. Dies wird durch eine ordnungsgemäße Montage am Kryostatblock erreicht. Vergewissern Sie sich, dass die Schnittebene parallel zur Haarfollikelausrichtung ist ( Abbildung 2c ). Wie bereits erwähnt, ist die korrekte Ausrichtung der Sektionsebene in der Hautprobe ein entscheidender Schritt zur Bestimmung der Qualität der Bilder, die in der Haut aufgenommen werdenEinen späteren Schritt </li></ol></li></ol><img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig2.jpg" /> Abbildung 2. Einbettung, Kryokonservierung und Schnitt. ( A ) Die Markierung der Haarfollikel (HF) Richtung auf der Kryomold, die durch die schwarzen Pfeile angedeutet ist, ist für die richtige Orientierung während der Kryoschaltung wichtig. ( B ) Die Schnittebene muss mit der Haarfollikelorientierung ausgerichtet werden, um Abschnitte zu erzeugen, in denen die gesamte Länge der Haarfollikel intakt bleibt. ( C ) Abschnitte wurden pro Haarfollikelorientierung geschnitten, die durch die schwarzen Pfeile auf der Kryomold ( D ) Die dicken Gewebequerschnitte wurden mit Metallzangen gesammelt und ( e ) in eine 100 mm Kulturschale mit 1x PBS überführt. ( F ) Bei Raumtemperatur löst sich der PBS den OC ab.T. Die die dicken Gewebequerschnitte umgibt, wie durch die weißen Pfeile angedeutet. Die Abschnitte schweben dann frei im PBS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol start="2"><li> Kryoschweißen <ol><li> Schneide einen Abschnitt mit dem Kryostaten. Verwenden Sie Pinzette, um den OCT zu sammeln, der das eingebettete Stück der Haut enthält ( Abbildung 2d ). HINWEIS: Verwenden Sie einen Kryostaten, der eine unabhängige Bewegung und Einstellung entlang der X-, Y- und Z-Achsen ermöglicht, um eine optimale Probenpositionierung zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Erzeugung von optimal ausgerichteten Gewebequerschnitten. </li><li> Übertragen Sie den Abschnitt aus dem Kryostat in die 100 mm Kulturschale, die mit PBS gefüllt ist, und fahren Sie mit der nächsten Scheibe fort. Sammeln Sie die Proben nicht auf einer Folie ( Abbildung 2e ). HINWEIS: Bei Raumtemperatur löst sich der PBS abDie OCT, verlassen Hautscheiben, die einfach zu handhaben mit Pinzette ( Abbildung 2f ). HINWEIS: Frische PBS kann in der 100 mm Kulturschale nach dem Auflösen vieler Gewebeabschnitte von 100 μm Dicke benötigt werden und kann entsprechend geändert werden. </li><li> Verwenden Sie Pinzette, um die schwimmenden Hautabschnitte auf die korrekt markierte Vertiefung in einer 12-Well-Platte zu übertragen, die mit 2,5 ml PBS gefüllt ist ( Abbildung 3a , links). HINWEIS: Bei 4 ° C können die Proben für mindestens zwei Tage gelagert werden. Zur Langzeitlagerung von hauthaltigen OCT-Blöcken nach dem Schneiden die Schneidfläche mit einem Tropfen frischen OCT abdichten. Nach dem Einfrieren des OCT-Tröpfchens den gebrauchten OCT-Block in Parafilm einwickeln und in den Gefrierschrank von -80 ° C zurücklegen . </li></ol></li></ol> 3. Immunfluoreszente Kennzeichnung. <ol><li> Bereiten Sie den PB-Puffer (PBS, ergänzt mit 0,5% Magermilchpulver, 0,25% Fischhautgelatine und 0,5% Triton X-100) bei leas vorT 2 h im voraus, wie zuvor beschrieben 5 . HINWEIS: Natriumazid kann dem PB-Puffer zur Antikörper-Konservierung für die wiederholte Verwendung des Färbepuffers zugesetzt werden. </li><li> Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 μl PB-Puffer pro Röhrchen hinzu. Verwenden Sie vorsichtig Pinzetten, um die Hautscheiben aus dem PBS in separate Röhrchen zu bringen, die den PB-Puffer zum Blockieren enthalten ( Abbildung 3a , rechts). Stellen Sie sicher, dass alle Hautscheiben vollständig untergetaucht sind. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 10 Oszillationen pro Minute auf eine Wippe, die die Gewebeintegrität nicht stören sollte, für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Es ist entscheidend, dass die Geschwindigkeit nicht mehr als 10 Schwingungen pro Minute auf der Wippe übersteigt, da es zu Verwicklungen führen wird. <ol><li> Während es möglich ist, mehr als eine Scheibe pro Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen, um Antikörper zu sparen, legen Sie nur eine Scheibe pro Röhrchen. Um den Antikörperverbrauch zu verringern, verwenden Sie ein VolumeVon 250 &amp; mgr; l HINWEIS: Falls erforderlich, ersetzen Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit z. B. 96-Well-Platten. Die Platzierung der dicken Gewebequerschnitte in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ermöglicht jedoch die effektivste Antikörperpenetration in das Gewebe aufgrund der erhöhten Flüssigkeitsstörung. </li></ol></li><li> Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Hautscheibe und fügen Sie 500 μl PB-Puffer und die entsprechende Menge an primärem Antikörper hinzu. Nach 1 h Blockierung die Hautscheiben in die frisch zubereiteten Röhrchen überführen, die die Antikörper enthalten. Die Scheiben bei 4 ° C über Nacht inkubieren. HINWEIS: In diesem Beispiel wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: FITC-Ratten-Anti-Human-CD49f bei einer Konzentration von 1:50 und Ziegen-anti-Maus / Rattenintegrin alpha 8 bei einer Konzentration von 1: 100. </li><li> Am nächsten Tag werden zwei getrennte 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt, die 500 μl PBS pro Probe enthalten. Die Hautscheiben zweimal für 1 h bei Raumtemperatur waschenE. </li><li> Bereiten Sie getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 500 μl PB-Puffer mit der entsprechenden Konzentration an anwendbaren sekundären Antikörpern und 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthalten. ANMERKUNG: Die in diesem Beispiel verwendeten sekundären Antikörper sind Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ratten-IgG und Alexa Fluor 555 Esel Anti-Ziegen-IgG in einer Konzentration von 1: 500. DAPI wurde in einer Konzentration von 1: 100 verwendet. </li><li> Sorgfältig die Hautproben in den PB-Puffer überführen, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält und die Hautscheiben bei Raumtemperatur für 1 h bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rotator oder Schüttler inkubieren. </li><li> Die Scheiben bei 4 ° C im PB-Puffer, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält, für bis zu vier Tage aufbewahren und eventuell länger, wenn Natriumazid dem PBS zugesetzt wird. </li></ol><img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig3.jpg" /> Abbildung 3. ImmunfluoreszenzEtikettierung und Montage. ( A ) Die schwimmenden Gewebequerschnitte können in 12-Well-Platten für mindestens zwei Tage bei 4 ° C gelagert werden. Vor der Immunfluoreszenz-Markierung (IF) können die interessierenden Gewebequerschnitte in 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen, die PB-Puffer zum Blockieren enthalten, übertragen, wie durch Pfeil 1 angedeutet. Für die IF-Markierung haften Sie an dem in Schritt 3 ausgearbeiteten mehrstufigen Verfahren Teil von Schritt 3 erfordert die sorgfältige Übertragung der Gewebequerschnitte in frisch präparierte Mikrozentrifugenröhrchen, die primäre Antikörperlösung, sekundäre Antikörperlösung oder Waschpuffer enthalten, was durch Pfeil 2 angedeutet ist. ( B ) Nach der IF-Markierung wird die Gewebe- Abschnitte werden in einem Tröpfchen von Glycerin unter Verwendung eines Sektionsmikroskops aufgehoben und abgeflacht. ( C ) Sobald der Gewebequerschnitt vollständig auf den Boden eines Deckglases abgeflacht ist, wird ein regelmäßiger Mikroskop-Objektträger zur Befestigung des Abschnitts verwendet. <aHref = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 4. Montage für mikroskopische Visualisierung <ol><li> Vor der Bildgebung werden die Hautscheiben auf getrennte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, die 500 μl PBS enthalten, um die sekundären Antikörper und DAPI zu waschen. </li><li> Verwenden Sie eine 1000 μl Pipette, aber schneiden Sie die ersten 0,5 cm der Pipettenspitze ab, um das richtige Pipettieren des hochviskosen Glycerins zu ermöglichen. Legen Sie ein 22 x 50 mm Deckglas auf einen dunklen Hintergrund unter einem Sektionsmikroskop ( Abbildung 3b ). </li><li> Füge ein Tröpfchen von 100% Glycerin auf den Deckzettel hinzu ( Abbildung 3b ). Übertragen Sie die Hautscheibe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf das Glycerintröpfchen. Verwenden Sie das Seziermikroskop und spitzen Pinzette, um sorgfältig die Haut Scheiben, die zusammengerollt sind, abwickeln. HINWEIS: Als die Scheibe im Gly schwimmtCerol Tröpfchen, kann es entwirrt werden, indem die natürliche Neigung des Gewebes, um seine normale Form zurückzukehren. Die unnatürliche Begradigung der Scheibe nicht zwingen, da dies das Gewebe beschädigen könnte. </li><li> Montieren Sie das Gewebe, sobald die gesamte Länge des Hautabschnitts richtig ausgerichtet und auf dem Deckel abgeflacht ist; Verwenden Sie eine regelmäßige Mikroskop-Folie. Dieser Schritt wird die Hautscheibe weiter begradigen. HINWEIS: Vermeiden Sie Lufteinschlüsse ( Abbildung 3c ). </li><li> Bild die in Glycerin-montierten Hautabschnitte innerhalb der nächsten zwei Tage. HINWEIS: Eine längere Lagerung wird die Gewebe- und Abbildungsqualität negativ beeinflussen. In diesem Beispiel wurden alle Bilder mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines 20x Objektivs erworben. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren möchten zeigen, dass die Veröffentlichung dieses Manuskripts von Thermo-Fisher Scientific Inc. finanziert wurde

Hier stellen wir Ihnen die Technik der "horizontalen Ganzmontage" vor, die gegenüber klassischen Fixierschnitten mehrere Vorteile hat. Ein Vorteil unserer Technik ist, dass sie problemlos mit Standard-Histologiegeräten und einem konfokalen Mikroskop durchgeführt werden kann. Zweitens bleibt die Integrität des Gewebes im Vergleich zu Standard-Kryosektionen besser erhalten. Zum Beispiel werden Adipozyten innerhalb der hypodermalen Schicht (d. h. die dermalen weißen Adipozyten (DWAT))9 in Standard-Kryosektionen stark gestört, was die Untersuchung von Geweben, die fettbeladen sind, unmöglich macht. Unsere Technik ermöglicht die vollständige Analyse der Adipozyten in dieser Schicht und kann an andere Gewebe mit hohem Adipozytengehalt angepasst werden. Darüber hinaus ermöglicht dies einen verbesserten Nachweis von mesenchymalen Zellen in Studien zur Rückverfolgung der Abstammung 2,10.
Standard-Kryosektionen können von Natur aus niemals die wahren 3D-Aspekte eines Gewebes durch konfokale Mikroskopie aufdecken. Das bedeutet, dass dickere Schnitte bei der Analyse der Haut von Vorteil sind, da die Haarfollikel sowie ihre Unterstrukturen eine Tiefe durchqueren können, die über die bei klassischen Krysosektionen verwendete Standarddicke von 10 μm hinausgeht. Wir sind fasziniert davon, dass andere Gewebe, wie zum Beispiel der Darm und das Gehirn, ähnliche Herausforderungen haben, wenn es darum geht, das Gewebe als 3D-Struktur zu betrachten 2,7,11,12,13. Interessanterweise hat sich unsere Technik bereits als vorteilhaft für bestimmte Anwendungen im Darm erwiesen14. Wir glauben, dass unser horizontales Whole-Mount-Protokoll das Potenzial hat, auf jedes andere Gewebe angewendet zu werden, das eine 3D-Analyse erfordert.

Die revolution von mikroskopischen Bildgebungsgeräten sorgt für anspruchsvolle, hochauflösende Bildgebungsinstrumente. Bei der Erfassung eines mikroskopischen Bildes eines kompletten dreidimensionalen (3D) Gewebequerschnitts stellt das Probenpräparat jedoch erhebliche Herausforderungen dar und kann der begrenzende Faktor bei der Definition der Bildqualität sein. Jeder einzelne Schritt verdient eine sorgfältige Betrachtung, um die Gewebemorphologie und die Antigenität von Zielproteinen zu bewahren, um verarbeitungsbedingte Artefakte zu minimieren und die endgültige Bildqualität zu maximieren. Zum Beispiel erfordert die traditionelle Hautanalyse ein Bild mit Blick auf die Epidermis und Dermis, mit Haarfollikeln, die richtig orientiert sind und die anatomische Analyse der Stammzellkompartimentbeiträge zur Hauthomöostase 1 , 2 ermöglichen . Dies erfordert eine gründliche Konzentration, wie die Haut eingebettet und geschnitten ist. Wichtig, Haarfollikel können dicker seinAls 100 μm, was die Standard-Paraffin- oder gefrorene Schnittdicke stark übersteigt, was zu einem niedrigeren Analysengrad im Vergleich zu ganzen Montierungen oder dicken Querschnitten 3 , 4 , 5 führt . Zusammengenommen ist jeder Schritt der Probenvorbereitung für die mikroskopische Analyse eine kritische Determinante, die die Bildanalyse beeinflussen wird. Hier wird ein neuartiges Verarbeitungsprotokoll für eine dicke 3D-Gewebequerschnittsanalyse vorgestellt, die wir als &quot;horizontale Vollmontage&quot; bezeichnen. Das Protokoll bewahrt die Antigenität hoch und ermöglicht die volle Ausnutzung von dicken Abschnitten der Haut durch die Verwendung von konfokalen bildgebenden Geräten. Dies ist ein vollständiger Leitfaden zur Verwendung von Haut für die Verarbeitung und Bildgebung von Gewebequerschnitten, einschließlich Gewebeernte und Paraformaldehyd (PFA) -assistierte Kryokonservierung (Schritt 1), die Erzeugung von 100 μm dicken Gewebequerschnitten mit einem Kryostat (Schritt 2) Und immunfluoreszierende Markierung und Montage (Schritte 3 und 4). Die repräsentativen Ergebnisse vergleichen konfokale Bilder von zwei verschiedenen histologischen Präparationstechniken - klassische Kryosektionierung und dickes 3D-Gewebequerschnitt - Hervorhebung der Vorteile von &quot;horizontalen Gesamtbefestigungen&quot; für den potentiellen Benutzer dieses Protokolls.

<table><tbody><tr>PBS <td>hausgemachte</td> <td>Gelatine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, aus Kaltwasser-Fischhaut</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td>250ML</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>BDH Laborbedarf</td><td>444482V</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Verbindung</td><td>VWR Chemikalien</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Einbettungsformen</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td>Quadrat S-22</td></tr><tr><td>Fettfreies Milchpulver</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>NB0669</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>500ML</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindol, dilactat (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>FITC Ratte Anti-Human CD49f</td><td>BD Pharmingen</td><td>555735</td><td></td></tr><tr><td>Maus/Ratte Integrin alpha 8 Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>AF4076</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ratte IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Esel Anti-Ziegen IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21432</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mm Kulturschalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpelle</td><td>Swann-Morton</td><td>Ref 0501</td><td></td></tr><tr><td>spitze Metallzange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>12 Well Platten</td><td>Sigma</td><td>CLS3513</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ul und 1000 ul Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000&micro; l XL Graduated TipOne Filterspitze (steril)</td><td>Star Lab</td><td>S1122-1830</td><td></td></tr><tr><td>20&micro; l Abgeschrägte SpitzeEine Filterspitze (steril)</td><td>Star Lab</td><td>S1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelplatte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Objektträger, menzel Glaeser</td><td>Thermoskanne Scientific</td><td>631-9483</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>Deckbrille, Menzel Glaeser</td><td>Thermoskanne Scientific</td><td>MENZBB024060AB</td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

horizontale ganze mount: ein neuartiges verarbeitungs- und imaging-protokoll für dickes, dreidimensionales gewebequerschnitt der haut

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Die Verarbeitung eines Gewebes von Interesse, um ein mikroskopisches Bild zu erzeugen, das ein wissenschaftliches Argument unterstützt, kann eine Herausforderung sein. Der Erwerb qualitativ hochwertiger mikroskopischer Bilder hängt nicht ganz von der Qualität des Mikroskops ab, sondern auch von den Methoden der Gewebeverarbeitung, die oftmals mehrere kritische Handlungen oder Schritte beinhalten. Darüber hinaus stellen mesenchymale Zelltypen in der Haut und anderen Geweben eine neue Herausforderung für die Gewebepräparation und die Bildgebung dar. Hier präsentieren wir einen kompletten Prozess von der Gewebeernte bis zur Mikroskopie. Unsere Technik, die so genannte &quot;horizontale Vollmontage&quot;, ist eine, die Anfänger schnell beherrschen können und die Antigenkonservierung und -detektion in 60-300 μm-dicken Abschnitten mit einem Kryostaten abschneiden lassen. Abschnitte dieser Dicke bieten eine verbesserte Visualisierung der Gewebe-Mikroarchitektur in einer dreidimensionalen Umgebung. Darüber hinaus bewahrt das Protokoll mesenchymale Zellen in einer Weise, die die Bildqualität erhöht, wennVerglichen mit Standard-Kryostaten oder Paraffin-Abschnitten, wodurch die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit der Immunfärbung erhöht wird. Wir glauben, dass dieses Protokoll allen Laboratorien zugute kommen wird, die die Haut und möglicherweise andere Gewebe und Organe visualisieren.

Um die Vorteile unserer Technik zu unterstreichen, verglichen wir unsere dicke 3D-Gewebe-Querschnittstechnik, &quot;horizontale Ganzmontage&quot;, zu klassischen gefrorenen Abschnitten. Klassische gefrorene Schnitte wurden geschnitten , wie zuvor 5 beschrieben. Um eine visuelle Struktur für die Epidermis in mikroskopischen Bildern zu schaffen, immunostained für Integrin alpha-6 (Itga6), die eine Komponente ist, die epidermale Zellen an die darunterliegende Basalmembran 6 verankert. Wir haben auch den arrector pili muscle (APM) bezeichnet, der für die Piloerektion verantwortlich ist (auch bekannt als &quot;goosebumps&quot;), mit integrin alpha-8 7 . In den klassischen, gefrorenen Abschnitten wurden die meisten Haarfollikel, die mit Itga6 visualisiert wurden, nicht über die gesamte Länge geschnitten und erzeugten überwiegend unvollständige Haarfollikel pro Sektion, verglichen mit horizontalen ganzen Montierungen ( Abbildung 4a -4d </strong&gt;). Durch dicke Gewebequerschnitte können im Vergleich zu herkömmlichen 10-μm-Abschnitten mehr Z-Stack-Schichten gewonnen werden, was ein vollständigeres 3D-Bild ermöglicht. Dies wird noch deutlicher, wenn man die Integrität von APMs studiert, die mit den Haarfollikeln und der darüber liegenden Basalmembran assoziiert sind. In klassischen Kryosierungen wurde der große Teil der APMs fraktioniert ( Abbildung 4a -4d ). Zusätzlich wird die Gewebeintegrität des hypodermalen Kompartiments in horizontalen Gesamtbehältern bewahrt, verglichen mit der Zerstörung von Adipozyten, wenn Kryoschen an warme Glasscheiben angebracht sind, was ein wohlbekanntes Gefrier-Auftauen-Artefakt ist ( Abbildung 4a -b , vergleiche hypodermale Regionen) 8 . <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56106/56106fig4.jpg" /> Abbildung 4. Horizontale ganze mouIm Vergleich zu einer klassischen Kryosektion. ( A ) Klassisch erhaltene Hautkryosäuren 10 μm dick und ( b ) 100 μm dicke 3D-Gewebequerschnitte wurden mit Integrin alpha-6 (Itga6) und Integrin alpha-8 (Itga8) markiert, um die epidermalen Kompartiment- und Arrektor-Pili-Muskeln zu visualisieren , beziehungsweise. Die Bilder der dicken Gewebequerschnitte sind als maximale Projektionen eines großen Z-Stapels dargestellt. Die weißen Rahmen zeigen die vergrößerten Bereiche an, die in ( c ) den klassischen und ( d ) horizontalen Vollmontageabschnitten angezeigt werden. ( E ) Intakte Haarfollikel und ( f ) intakte Arrektor-Pili-Muskeln wurden sowohl im klassischen als auch im horizontalen Ganzteil-Abschnitt quantifiziert. Maßstäbe zeigen 100 μm an. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt. Ein Abschnitt pro biologischer Replikat ( n = 3) wurde quantifiziert. Ungepaartes t-Test * P &lt;0,05, P &amp; lt; 0,0005. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56106/56106fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Das übergeordnete Ziel dieses histologischen und bildgebenden Protokolls besteht darin, ein zuverlässiges System vorzustellen, das die Epitop-Antigenität und strukturelle Integrität der Haut erhält und so eine vollständige Nutzung konfokaler Bildgebungsmethoden ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu beantworten, bei denen es erforderlich ist, die Beschaffenheit beliebiger Zelltypen innerhalb einer komplexen dreidimensionalen Geweearchitektur zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen histologischen Verfahren liegt in ihrer Robustheit und einfachen Durchführbarkeit.Zusätzlich ergänzt das Protokoll die dreidimensionale Analyse in der konfokalen Mikroskopie perfekt. Beginnen Sie damit, die Haut, die aus dem dorsomedialen Bereich einer Maus gewonnen wurde, in rechteckige Stücke zu schneiden. Jedes Stück sollte so dimensioniert sein, dass es in den Boden einer Kryokassette passt.Hier wird ein Hautareal von einem Quadratzentimeter an der Rückenseite gezeigt, das in eine Kryoschachtel mit den Maßen 22 Millimeter mal 30 Millimeter mal 20 Millimeter passt. Nach der Fixierung die gewaschene Haut in der mit OCT gefüllten Schachtel nach unten drücken, sodass sie bündig mit dem Boden abschließt. Kennzeichnen Sie die Orientierung der Haarfollikel an der Kryoschachtel, da diese die Orientierung des Schnitts am Kryostaten bestimmt.Überführen Sie die Kryoblöcke auf eine Metallplatte in einem Minus-80-Grad-Gefrierschrank, um ein Schwimmen und Verschieben des Gewebes zu verhindern. Überwachen Sie den Einfriervorgang, um die Orientierung der Haut an der Unterseite der Kryokassette beizubehalten, da unsichtbare Luftblasen bewirken können, dass die Haut an die Oberfläche der Kryokassette aufsteigt. Beginnen Sie damit, einen gefrorenen Kryoblock mit der Haarfollikel-Orientierung, wie auf der Kryokassette entlang der Schnittebene angegeben, am Stativ eines Kryostaten zu befestigen.Die korrekte Ausrichtung der Haarfollikel im Kryostaten ist entscheidend, da dieser Schritt die Schnittebene bestimmt, die Hautschnitte mit vollständig intakten Haarfollikeln erzeugt. Schneiden Sie mit dem Kryostaten einen 100-Mikrometer-Schnitt. Greifen Sie das OCT um das eingebettete Hautstück mit einer Pinzette und übertragen Sie den Schnitt aus dem Kryostaten in die 100-Millimeter-Kultur, die mit PBS gefüllt ist.Bei Raumtemperatur löst das PBS das OCT auf, wodurch Hautschnitte entstehen, die sich leicht mit einer Pinzette handhaben lassen. Nach dem Schneiden übertragen Sie die schwimmenden Hauthautschnitte mit einer Pinzette in eine Vertiefung einer 12-Loch-Platte, die 2,5 Milliliter PBS enthält. Beginnen Sie die immunfluoreszenzmarkierung, indem Sie zunächst 500 Mikroliter PB-Puffer in beschriftete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen geben.Überführen Sie die Hautschnitte vorsichtig mit einer Pinzette aus der 12-Loch-Platte in die Röhrchen für die Blockierung. Stellen Sie sicher, dass alle Hautschnitte vollständig untergetaucht sind. Stellen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einen Schaukelrührer mit 10 Oszillationen pro Minute oder weniger.Beschriften Sie separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Hautscheibe und geben Sie 500 µL PB-Puffer mit der entsprechenden Menge primärem Antikörper hinzu. Nach einer Stunde Blockierung überführen Sie die Hautscheiben in frisch vorbereitete Röhrchen mit den Antikörpern. Inkubieren Sie die Scheiben über Nacht bei vier Grad Celsius bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Wipprüttler.Am nächsten Tag die Schnitte in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die 500 Mikroliter PBS enthalten, und eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler waschen. Anschließend die Schnitte in separate 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, die jeweils 500 Mikroliter PB-Puffer mit der geeigneten Konzentration sekundärer Antikörper und DAPI enthalten. Eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren; falls gewünscht, können die Proben bis zu vier Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis sie weiterverarbeitet werden.Vor der Bildgebung überführen Sie die Hautschnitte in separate Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 500 Mikroliter PBS, um die sekundären Antikörper und DAPI auszuwaschen. Anschließend bringen Sie eine 22 Milliliter mal 50 Milliliter große Deckglasplatte auf einem dunklen Hintergrund unter einem Stereomikroskop an. Danach geben Sie mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, deren Spitze abgeschnitten wurde, einen Tropfen 100 % Glycerin auf das Deckglas.Überführen Sie die Hautscheibe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf den Glycerintröpfchen. Verwenden Sie dann unter Betrachtung durch das Stereomikroskop spitze Pinzette, um die aufgerollten Hautscheiben vorsichtig in Glycerin schwimmend wieder in ihre natürliche Form zurückzubringen. Erzwingen Sie keine unnatürliche Begradigung der Scheibe, da dies zu Gewebeschäden führen könnte.Sobald die gesamte Länge des Schnitts korrekt ausgerichtet und auf dem Deckglas abgeflacht ist, montieren Sie das Gewebe auf einen normalen Objektträger; dieser Schritt richtet den Hautschnitt weiter auf. Bilden Sie die in Glycerin montierten Hautschnitte innerhalb der nächsten zwei Tage ab.Dieses Bild zeigt einen 10 Mikrometer dicken, klassisch gewonnenen Haut-Cryoschnitt, der mit Integrin alpha sechs und Integrin alpha acht markiert wurde, um den epidermalen Kompartiment bzw. die Haarbalgmuskeln sichtbar zu machen. Der 100 Mikrometer dicke 3D-Gewebeschnitt wurde auf die gleiche Weise markiert. Das dargestellte Bild ist die maximale Projektion eines großen z-Stacks.Die Details beider Bilder werden hier nebeneinander verglichen: Bei den klassischen Gefrierschnitten wurden die meisten Haarfollikel, die mit Integrin alpha sechs sichtbar gemacht wurden, nicht über ihre gesamte Länge geschnitten, wodurch pro Schnitt überwiegend unvollständige Haarfollikel entstanden, im Vergleich zu horizontalen Ganzpräparaten. Intakte Haarfollikel und intakte Musculi arrectores pili wurden sowohl in den klassischen als auch in den horizontalen Ganzpräparaten gezählt. Pro biologischem Replikat wurde ein Schnitt ausgewertet. Wie hier zu sehen, weist der Ganzpräparat-Schnitt einen höheren Anteil an intakten Follikeln und Musculi arrectores pili auf.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann diese Kryoschnitttechnik mit einer Geschwindigkeit von mehr als 15 Schnitten pro Minute durchgeführt werden und liefert perfekt ausgerichtete Proben, sofern die Einbettung korrekt durchgeführt wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dicke Gewebeschnitte in einem dreidimensionalen Umfeld verarbeiten und analysieren kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.

Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben

Wir präsentieren einen Bildregistrierungsansatz für die 3-dimensionale (3D) histologische Volumenrekonstruktion, der die Untersuchung der Veränderungen eines Organs auf der Ebene von Makrostrukturen ermöglicht, die aus Zellen bestehen. Mit diesem Ansatz untersuchten wir die 3D-Veränderungen zwischen Wildtyp- und Igfbp7-null-Brustdrüsen.

Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Säugetier-Haut enthält eine Vielfalt von Strukturen - wie Haarfollikel und Nervenenden - das charakteristische Muster der räumlichen Organisation zu zeigen. Die Analyse der Haut als flache Halterung nutzt die Vorteile der 2-dimensionalen Geometrie dieses Gewebe voller Dicke hochauflösende Bilder der Strukturen der Haut zu produzieren.

Wohnung Berg-Imaging von Mäusehaut und ihre Anwendung auf die Analyse von Mustern und die Haarfollikel Sinnes Axon Morphologie

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

In diesem Manuskript stellen wir eine halbautomatische Kryohistologie-Plattform mit hohem Durchsatz vor, um ausgerichtete Kompositbilder von Mehrfachreaktionsmessungen aus mehreren Runden der Fluoreszenzbildgebung an gefrorenen Schnitten mineralisierter Gewebe zu erstellen.

Hochdurchsatz, Multi-Bild Cryohistology von mineralisiertem Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren für den 3D-Vergleich von ganzem Herzen Herzmuskelgewebe mit MRI. Dies ist für die genaue Beurteilung der intramyokardialer Injektionen in der Infarktrandzone eines chronischen Schweinemodell eines Myokardinfarkts entworfen.

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Hier beschreiben wir ein hohe Auflösung vollständig-hängen bildgebende Verfahren in der gesamten erwachsenen Maus Ohr Haut, die was uns ermöglicht, verzweigte Morphogenese und Strukturierung der peripheren Nerven und Blutgefäße sowie Immunzelle Verteilung zu visualisieren.

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie soll die gesamte-Mount Immunostaining und Visualisierung Technik als eine ideale Methode für die 3D Darstellung von Fettgewebe Architektur und zellulären Komponente zeigen.

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Hier beschreiben wir ein Verfahren, das den organweiten Nachweis pathogener Bakterien während der Infektion und die Quantifizierung der fluoreszierenden Reporteraktivitäten ermöglicht.

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Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz, das optimiert wurde, um die dreidimensionale Architektur von Peritonealmetastasen zu charakterisieren.

Dreidimensionale Bildgebung von tumortragendem Gewebe mit dem iterativen Bleaching erweitert den Multiplexitätsansatz

Lernen Sie ein neues Protokoll zur Verarbeitung und Bildgebung dicker Hautgewebequerschnitte mit konfokaler Mikroskopie. Diese Methode erhält Antigenität und strukturelle Integrität für die 3D-Analyse.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut (Video) | JoVE Journal

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

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