Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Bindungsproteine kleiner Moleküle mit Hilfe einer Photoaffinitätssonde zu identifizieren, die an ihr Ziel in lebenden Zellen binden kann, was die anschließende Isolierung und Identifizierung des Ziels ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um den molekularen Wirkmechanismus von Medikamenten oder anderen kleinen Molekülen aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der nativen zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie sterile sechs Zentimeter große Zellkulturschalen für die gewünschte Anzahl von Proben vorbereiten. In der Regel wird pro Behandlungsbedingung eine Zellschale verwendet. Für diese Demonstration werden drei Schalen mit Zellen vorbereitet, und die Negativkontrolle nur mit DMSO, gekennzeichnet mit D, nur die Sondenbehandlung, gekennzeichnet mit P, und die Sonde plus Mitbewerber, die C.To jeder Kulturschale markiert ist, fügen 3,5 Millionen HEK 293 T-Zellen in vier Millilitern Kulturmedium hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen über Nacht. Vor der Behandlung der Zellen werden die benötigten Medikamente in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen voraliquotiert. Für die Vorbehandlung mit Mitbewerbern geben Sie jeweils vier Mikroliter DMSO in zwei Röhrchen und vier Mikroliter 10 Millimolar Mitbewerber in ein Röhrchen.

Für die Sondenbehandlung geben Sie 16 Mikroliter DMSO in ein Röhrchen und 16 Mikroliter 15 Mikromolare Photoaffinitätssonde in jedes der beiden Röhrchen. Bringen Sie die Zellkulturschalen in die Zellkulturhaube für die Zugabe der voraliquotierten Arzneimittel. Aspirieren Sie einen Milliliter Kulturmedium aus der Wettkampfbehandlungsschale, überführen Sie es in das Mikrozentrifugenröhrchen, das den präaliquotierten Konkurrenten enthält, und resuspendieren Sie das Arzneimittel in dem Medium.

Geben Sie das Medium und die Mischung aus Medium und Medikament vorsichtig tropfenweise zurück in die Schüssel. Geben Sie auf die gleiche Weise DMSO sowohl in die Negativkontrollschale als auch in die Sondenschüssel. Stellen Sie die Schalen für 30 Minuten wieder in den Inkubator.

Bringen Sie das Geschirr nach 30 Minuten zurück in die Kulturhaube und dimmen Sie das Licht. Geben Sie das voraliquotierte DMSO in die Negativkontrollschale und die Sonde in die Sonden- und Wettkampfschalen. Stellen Sie die Schalen für eine Stunde wieder in den Inkubator.

Nach einer Stunde die Gerichte auf Eis legen. Waschen Sie die Zellen in jeder Schale vorsichtig mit fünf Millilitern eiskaltem PBS, um überschüssige Sonde zu entfernen. Bedecken Sie die Zellen erneut mit vier Millilitern eiskaltem PBS.

Stellen Sie eine Schale mit Zellen, die drei Zentimeter zentriert ist, unter der UV-Lampe auf einen Eisbeutel, um die Erwärmung durch die Lampe zu minimieren, und bestrahlen Sie drei Minuten lang. Die Schüssel herausnehmen und auf Eis legen. Bestrahlen Sie auf diese Weise alle Proben.

Nach der Bestrahlung aller Proben aspirieren Sie das PBS aus den Zellen und fügen Sie jeder Schale 200 Mikroliter eiskaltes PBS mit Proteaseinhibitoren hinzu. Nehmen Sie die Zellen mit einem Gummischaber von der Schale und geben Sie sie auf Eis in vormarkierte Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie jeder Probe SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,4 % hinzu. Lysieren Sie die Zellen, indem Sie die Suspension 10 Pulse lang beschallen, eine Minute lang auf Eis inkubieren und dann weitere 10 Pulse beschallen.

Kochen Sie die Proben fünf Minuten lang auf einem auf 95 Grad Celsius eingestellten Wärmeblock, um die Zelllyse abzuschließen und alle Proteine zu denaturieren. Nach der Messung der Proteinkonzentration in jeder Probe, wie im Textprotokoll beschrieben, normalisieren Sie die Proteinkonzentration auf 2,5 Milligramm pro Milliliter, indem Sie bei Bedarf PBS PH 8,5 plus 0,4 % SDS hinzufügen. Um dieses Verfahren zu beginnen, werden 40 Mikroliter jedes Zelllysats, das im vorherigen Segment vorbereitet wurde, in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Fügen Sie die folgenden Reagenzien in dieser Reihenfolge hinzu: 0,2 Mikroliter Mehlazid, 0,58 Mikroliter TCEP und 3,38 Mikroliter TBTA. Vortex zum Mischen. Fügen Sie 1,14 Mikroliter Kupfersulfat-Pentahydrat hinzu, um die Reaktion zu starten.

Kurz vortexen und bei Raumtemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren. Fügen Sie 50 Mikroliter 2X SDS-Probenpuffer hinzu, um die Reaktion zu löschen. Lassen Sie die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel laufen, und wenn die Farbstofffront das Ende des Gels erreicht hat, lassen Sie das Gel weitere fünf Minuten lang laufen, um sicherzustellen, dass das gesamte überschüssige, nicht umgesetzte Mehl-Azid vollständig aus dem Gel ausgetreten ist.

Nachdem Sie alles überschüssige Mehl-Azid weggewaschen haben, geben Sie das Gel auf eine Glasplatte und scannen Sie das Gel mit einem fluoreszierenden Gelscanner gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für das Anbringen eines Biotin-Tags wird die maximale Menge an Zelllysaten nach der Proteinnormalisierung verwendet, so dass alle Proben das gleiche Volumen haben. Reinigen Sie die Lysate vor, indem Sie jede Probe in ein neues Röhrchen geben, das 50 Mikroliter vorgewaschene Streptavidin-Agarose-Kügelchen mit hoher Kapazität enthält.

Eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit Rotation inkubieren. Pelletieren Sie die Kügelchen durch Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand zu einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und entsorgen Sie die Kügelchen.

Pro 500 Mikroliter Lysat werden die folgenden Reagenzien hinzugefügt: 1,38 Mikroliter Biotin-Azid, 5,5 Mikroliter TCEP und 32,5 Mikroliter TBTA. Vortex zum Mischen. 11 Mikroliter Kupfersulfat-Pentahydrat pro 500 Mikroliter Lysat zugeben und kurz vortexen.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie vier Probenvolumina Aceton hinzu, kühlen Sie es auf 20 Grad Celsius, wirbeln Sie die Proben und inkubieren Sie es über Nacht bei 80 Grad Celsius, um die Proteine vollständig auszufällen und nicht umgesetztes Biotin-Azid zu entfernen. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Proben bei 17.000 x g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die gefällten Proteine zu pelletieren.

Aspirieren Sie den Überstand vollständig, fügen Sie jeder Probe 150 Mikroliter PBS PH 7,4 und 1 % SDS hinzu und lösen Sie die Proteine durch Beschallung auf. Geben Sie 600 Mikroliter PBS zu jeder Probe, um die Konzentration von SDS auf 0,2 % zu verdünnen, und geben Sie dann die Probe in ein neues Röhrchen mit 30 Mikrolitern vorgewaschener Streptavidin-Agarose-Kügelchen mit hoher Kapazität. Eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit Rotation inkubieren.

Nach einer Stunde werden die Kügelchen durch Zentrifugation bei 1000 x g drei Minuten lang pelletiert. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand, der ungebundene Proteine enthält. Geben Sie einen Milliliter Waschpuffer zu den Kügelchen und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit Rotation.

Zentrifugieren, den Überstand entsorgen und erneut mit Waschpuffer waschen. Nach dem letzten Waschen aspirieren Sie den Waschpuffer vollständig aus den Kügelchen und fügen Sie 30 Mikroliter 2X SDS-Probenpuffer hinzu. Inkubieren Sie fünf Minuten lang in einem 95 Grad Celsius heißen Block, um die Proteine aus den Kügelchen freizusetzen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 13000 x g bei Raumtemperatur für eine Minute. Pipettieren Sie den Probenpuffer, der Proteine von den Kügelchen enthält, vorsichtig für SDS-PAGE. Die Visualisierung von Proteinen nach der Markierung mit dem Fluoreszenz-Tag wird durch dieses fluoreszierende gescannte Gel veranschaulicht.

Die Hauptbande des spezifischen Bindungsproteins mit einem Gewicht von etwa 35 Kilodalton ist nur in der Sondenspur vorhanden und wird von überschüssiger Ausgangssubstanz verdrängt. Dieselbe 35-Kilodalton-Bande wurde durch Silberfärbung nach Biotin-Pulldown sichtbar gemacht und anschließend mittels Massenspektrometrie als Membranprotein VDAC1 identifiziert. Die Identität des Proteins wurde unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gegen VDAC1 weiter validiert.

Das Signal ist auf der Sondenspur vorhanden und auf der Wettkampfspur verringert. Die Einbeziehung der Eingangsfraktion stellt sicher, dass der Antikörper funktioniert und das Protein von Interesse im Lysat nachgewiesen werden kann. Die leichte Erhöhung des Molekulargewichts der Pulldown-Proben ist auf die kovelant befestigte Sonde zurückzuführen.

Die Folgen, wenn bestimmte Schritte im Protokoll nicht korrekt ausgeführt werden, werden veranschaulicht. Eine unvollständige Entfernung von überschüssigem Mehl-Azid führt zu großen schwarzen Abstrichen am Boden des fluoreszierenden gescannten Gels, während eine unzureichende Vorreinigung der Lysate und/oder das Waschen der Kügelchen zu einem silbergefärbten Gel mit sehr hoher Hintergrundfärbung führt. Von Anfang bis Ende dauert das Pulldown-Experiment zwei bis drei Tage.

Nachdem das Zielprotein isoliert und durch Massenspektrometrie oder Western Blotting identifiziert wurde, sollten weitere zielspezifische Validierungsexperimente durchgeführt werden, um die Relevanz des Zielproteins für den arzneimittelinduzierten Phänotyp zu bewerten.