Name: Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Lernen Sie die Photoaffinitätsmarkierung zur Identifizierung kleiner Molekül-bindender Proteine in lebenden HEK 293 T Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse nativer Proteinstrukturen für die Wirkstoffforschung.

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Wir danken Dr. Ben Nacev für die Beratung bei der Gestaltung des Photoaffinitätsmarkierungsprotokolls, Dr. Wei Shi für die Synthese der Itraconazol-Photoaffinitätssonde, Dr. Yongjun Dang für die Beratung zu Affinitäts-Pulldown-Experimenten und anderen Mitgliedern des J.O.L.-Labors für hilfreiche Kommentare und Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein PhRMA Foundation Fellowship in Pharmakologie/Toxikologie (an S.A.H.); Zuschuss des National Cancer Institute R01CA184103; das Flight Attendant Medical Research Institute; Stiftung für Prostatakrebs (J.O.L.); und das Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, das teilweise durch Grant UL1 TR 001079 des National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) finanziert wird.

Hinweis: Dieses Protokoll von MacKinnon und Taunton 10 für den Einsatz in lebenden Zellen angepasst wurde. 1. Herstellung von kultivierten Zellen <ol><li> Bereiten sterile 6-cm Zellkulturschalen für die Anzahl der Proben gewünscht (siehe unten). HINWEIS: Eine Schüssel Zellen pro Behandlungsbedingung verwendet wird, aber wenn mehr Protein erforderlich ist, 2 oder 3 Gerichte pro Zustand und kombiniert nach UV-Bestrahlung hergestellt werden. <ol><li> Bereiten Sie mindestens drei Gerichte von Zellen; Negative Kontrolle mit DMSO nur (D), Sondenbehandlung nur (P) und Sonde + Wettbewerber (C). </li><li> Optional vorbereiten, ein 4. Gericht als ohne UV - Kontrolle mit Sonde behandelt werden , aber nicht mit UV - Licht ausgesetzt wird . HINWEIS: Wenn mehrere Wettbewerber Moleküle getestet werden, wie verschiedene Analoga des kleinen Moleküls von Interesse, bereiten zusätzlichen Konkurrenzplatten als notwendig. </li></ol></li><li> In HEK293T Zellen zu Kulturschalen in 4 ml Kulturmedien. Verwenden von 3,5 Mio. cells pro Platte. HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte für jeden Zelltyp bestimmt werden, so dass die Zellen fast 100% konfluent sind, zu Beginn des Experiments, um die maximale Proteinausbeute zu erzielen. Für HUVEC, 0,3 Millionen Zellen pro Platte verwenden. Eine gute Näherung ist 1/10 der Zellen in einer konfluenten 15 cm-Schale. Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin HEK293T Zellen sollten in Dulbeccos Modified Eagles kultiviert werden. </li><li> Zurückkehren , um die Zellen auf den Kulturbrutschrank (37 ° C, 5% CO 2) über Nacht. </li></ol> 2. Behandlung von Zellen und Photovernetzung <ol><li> Am nächsten Tag, pre-aliquoten die folgenden Medikamente in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen: <ol><li> Für die erste Behandlung, fügen 4 ul DMSO zu 2 Röhrchen und 4 ul 10 mM Kompetitor (dh die nicht - modifizierten Ausgangsverbindung) bis 1 Rohr. </li><li> Für die zweite Behandlung, fügen Sie 16 ul DMSO zu 1 Röhrchen und 16 &amp; mgr; l von 50 &amp;# 181; M Photoaffinitätssonde 2 Röhren. HINWEIS: Die optimale Konzentration kann für verschiedene Sonden unterschiedlich sein (siehe Diskussion), aber zwischen 200-500 nm ist ein guter Ausgangspunkt (hier verwenden wir 200 nM). Die Konzentration der Teilnehmer sollte die der Sonde überschreiten mindestens das 20-fache (hier verwenden wir 10 &amp; mgr; M). Die Endkonzentration von DMSO ist in allen Platten gleich sein und sollte nicht mehr als 0,5% (20 ul Volumen) nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Bringen Sie die Zellplatten in die Zellkultur Motorhaube und fügen Sie die pre-aliquotiert Drogen aus Schritt 2.1.1 wie folgt: absaugen 1 ml Kulturmedien, Resuspendieren des Pre-aliquotierten Droge in den Medien, und es sanft Zugabe zurück auf die Platte Tropfen weise. Fügen Sie das DMSO zu dem DMSO (D) Platte und der Sonde (P) Platte, und fügen Sie den Teilnehmer für den Wettbewerb (C) Platte. Rück die Platten zu dem Kulturbrutschrank für 30 min. </li><li> Mit Lichtern in der Kultur Haube gedimmt, fügen Sie den Pre-aliquotierten Sonde von Schritt 2.1.2 Sonde (P) und Wettbewerb (C) Platten und fügen Sie dieDMSO zu dem DMSO (D) Platte, wie oben. Bringen Sie die Platten an den Kultur-Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Während der Inkubation bereiten die folgenden Elemente; Ein Tablett mit Eis, das alle Platten passen können; eiskaltem Lysepuffer (PBS [pH 8,5] + 1x Protease-Inhibitor-Cocktail [vollständige EDTA-frei, verdünnt von 50x Stammlösung in Wasser hergestellt]; 200 &amp; mgr; l / Platte); Mikrozentrifugenröhrchen D, P, oder C für jeden der verschiedenen Behandlungsbedingungen, auf Eis markiert. </li><li> 15 Minuten vor dem Ende der 1-stündigen Inkubation der UV-Lampe (365 nm) in einem kalten Raum und schalten Sie es einrichten auf die Glühbirne, um sich aufzuwärmen. </li><li> Nach 1 Stunde Inkubation mit der Sonde, legen Gerichte auf dem Eis. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 5 ml eiskaltem PBS (pH 7,4) überschüssige Sonde zu entfernen. Re-decken die Zellen mit 4 ml eiskaltem PBS. </li><li> Die Schale von Zellen zentriert 3 cm unter der UV-Lampe oben auf einem Eisbeutel Heizung von der Lampe zu minimieren. Bestrahlen 3 min. Entfernen Sie die Schüssel auf das Tablett aus Eis und wiederholen Sie für alle Proben. </li><li> EINfter Bestrahlung absaugen PBS aus den Zellen und mit 200 ul der eiskaltem PBS (pH 8,5) mit Protease-Inhibitoren zu jeder Platte. Lösen Sie die Zellen von der Platte mit einem Gummischaber und Transfer zu den voretikettierten Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis verwenden. </li><li> Hinzufügen SDS bis zu einer Endkonzentration von 0,4% (10 ul 10% SDS in 250 ul Probe). ACHTUNG: SDS-Pulver ist gefährlich. Vermeiden SDS Pulver inhaliert durch eine Maske über Mund und Nase zu tragen. </li><li> Lyse der Zellen durch Beschallen der Suspension für 10 Impulse (Ausgabe 1, Einschaltdauer 30%) und Inkubation auf Eis für 1 min vor einer zweiten Runde von 10 Impulsen. </li><li> Bei Bedarf entfernen 2 ul Suspension und überprüfen unter einem Lichtmikroskop vollständige Zelllyse zu gewährleisten. </li><li> Koche die Proben auf einer heißen Platte auf 95 ° C für 5 min Zell-Lyse zu vervollständigen und alle Proteine ​​zu denaturieren. </li><li> Messung der Proteinkonzentration in jeder Probe eine spektrophotometrische Detergens-kompatiblen Protein Assay unter Verwendung von, beispielsweise the Dc - Protein - Assay 19, gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einem Spektrophotometer eingestellt Extinktion bei 750 nm zu messen. </li><li> Normalisieren der Proteinkonzentration auf 2,5 mg / ml (oder Konzentrationen sind geringer als 2,5 mg / ml, normalisiert mit der geringsten Proteinkonzentration der Probe) durch Zugabe von PBS pH 8,5 + 0,4% SDS bei Bedarf (beispielsweise bei den Proben 5 mg / ml in 250 &amp; mgr; l, fügen 250 ul PBS pH 8,5 + 0,4% SDS auf eine Endkonzentration von 2,5 mg / ml) zu erhalten. </li></ol> 3. Befestigung von Fluoreszenz-Tag durch Klick-Chemie zur Visualisierung von markierten Proteine <ol><li> Entfernen 40 &amp; mgr; l des Zelllysats und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die restlichen Lysate für die Reaktion mit Biotin-Azid (Schritt 4). </li><li> Fügen Sie die folgenden Reagenzien in der Reihenfolge: 0,2 ul fluor-Azid (1 mM Stammlösung in DMSO), 0,58 &amp; mgr; l TCEP (100 mM Lager in Wasser mit 4 Äquivalenten NaOH, frisch zubereitet) und 3,38 ul TBTA (1.7 mM Lager in einem 4: 1-Verhältnis von t-Butanol zu DMSO). Vortex mischen. </li><li> Hinzufügen , 1,14 &amp; mgr; l CuSO 4 · 5H 2 O (50 mM in Wasser) , um die Reaktion zu starten. Vortex kurz und für 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. </li><li> Je 50 ul 2x SDS-Probenpuffer die Reaktion zu quenchen. An diesem Punkt laufen die Proben direkt auf einem SDS-PAGE - Gel 20 für die besten Ergebnisse, oder bei -20 ° C über Nacht , wenn nötig. </li><li> Wenn Proben Gefrieren, bei 95 ° C für 5 min aufwärmen, bevor sie auf das Gel geladen. Hinweis: Da das Molekulargewicht des Zielproteins wird üblicherweise zu diesem Zeitpunkt nicht bekannt ist , ist es ratsam, zwei Gelen mit unterschiedlichen Acrylamidkonzentrationen zu laufen (dh, 8% und 15%) oder eine breite Molekulargewichtsbereich Gradientengel (dh 4-15%), vollständig Molekulargewicht Abdeckung zu gewährleisten. </li><li> Wenn die Farbstofffront das Ende des Gels erreicht hat, weiterhin das Gel für weitere 5 min läuft das gesamte überschüssige unreacte um sicherzustellen,d fluor-Azid hat das Gel vollständig zu verlassen. </li><li> Entfernen Sie das Gel in einen Behälter mit ddH 2 O und Inkubation für 10 min unter leichtem Schütteln, weg zu waschen alle überschüssige Fluor-Azid. </li><li> Legen Sie das Gel auf eine Glasplatte und scannen Sie das Gel mit einem Taifun Fluoreszenzgel-Scanner nach den Anweisungen des Herstellers. </li></ol> 4. Befestigung von Biotin-Umbau von der Klick-Chemie zur Affinitätsreinigung von markierten Proteinen <ol><li> Von den verbleibenden Lysaten aus Schritt 3.1, um die maximale Menge nach der Protein Normalisierung verwenden, so dass alle Proben das gleiche Volumen sind (zum Beispiel, wenn nach der Normalisierung auf 2,5 mg / ml Die resultierenden Probenvolumen 500 sind, 550, und 600 &amp; mgr; l, verwenden 500 ul jeder). </li><li> Pre-deaktivieren Sie die Lysate durch Hochleistungs-Streptavidin Agarose-Kügelchen, vorgewaschene 2x mit PBS (pH 7,4) auf 50 &amp; mgr; l hinzugefügt wird. Inkubiere 1 h bei 4 ° C unter Rotation. </li><li> Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 1000 × g für 3 min. entfernen ter Stand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und entsorgen Sie die Perlen. </li><li> Entfernen 1-2% der DMSO Probe in ein neues Röhrchen mit &quot;Eingang&quot;. Fügen Sie ein äquivalentes Volumen von 2x SDS-Probenpuffer und bei -20 ° C. </li><li> Pro 500 ul Lysat, fügen Sie die folgenden Reagenzien: 1,38 ul Biotin-Azid (10 mM Lager in DMSO), 5,5 ul TCEP und 32,5 ul TBTA. Vortex mischen. </li><li> In 11 ul CuSO 4 · 5H 2 O pro 500 ul Lysat und Wirbel kurz. für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> 4 hinzufügen Probenvolumina Aceton gekühlt auf -20 ° C. Vortex die Proben und über Nacht bei -80 ° C inkubieren, um vollständig um die Proteine ​​auszufällen und nicht umgesetzten Biotin-Azid zu entfernen. </li><li> Zentrifuge die Proben bei 17.000 xg für 15 min bei 4 ° C, um die gefällten Proteine ​​zu pelletieren. </li><li> Absaugen vollständig Überstand und resolubilisieren die Proteine ​​durch Beschallen in 150 ul PBS (pH 7,4) + 1% SDS. </li><liHinzufügen&gt; 600 &amp; mgr; l PBS (pH 7,4), um die Konzentration von SDS auf 0,2% zu verdünnen. </li><li> Fügen Sie die Proben auf 30 &amp; mgr; l vorgewaschene hoher Kapazität Streptavidin-Agarose-Perlen und inkubiere 1 h bei 4 ° C unter Rotation. </li><li> Pellet die Perlen durch Zentrifugation bei 1000 × g für 3 min. Den Überstand aspirieren ungebundenen Proteine ​​und Verwerfungs enthält. </li><li> 1 ml Waschpuffer (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) auf die Kügelchen und inkubiere 5 min bei Raumtemperatur unter Rotation. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.12 und 4.13 3 mal. </li><li> Saugen Sie das Waschpuffer vollständig von den Kügelchen und 30 ul Puffer 2x SDS Probe hinzufügen. </li><li> Inkubieren für 5 min auf einem C Heizblock 95 ° um die Proteine ​​von den Kügelchen zu lösen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Perlen für 1 min bei 13.000 xg bei Raumtemperatur. HINWEIS: An dieser Stelle können die Proben bei -20 ° C bis zur fertig gelagert werden SDS-PAGE laufen. Wenn Proben Gefrieren, vor der Verwendung bei 95 ° C für 5 min aufwärmen. </li><li> Vorsichtigdie Probenpuffer pipettieren Proteine ​​aus der Perlen enthält, und laden auf SDS-PAGE 20 (siehe wichtige Überlegungen weiter unten). Die Kügelchen können später gespeichert werden, um Aufkochen, wenn nötig. HINWEIS: Für die Proteinerkennung durch Silberfärbung, werden bessere Ergebnisse erhalten eine 1 mm dicke Gel verwendet wird. Wenn eine Band aus dem silbergefärbten Gel für die Massenspektrometrie (MS) Analyse geschnitten werden soll, bereiten alle Reagenzien frisch aus sterilen Lösungen und lassen einen leeren Brunnen in zwischen den Proben auf dem Gel. Für jedes Band von der Sonde Spur schneiden, eine parallele Scheibe sollte aus der DMSO Spur genommen werden, so dass Hintergrundproteine ​​abgezogen werden können. Für die Validierung von Protein durch Western-Blot-ID, ist es entscheidend, auch die Eingangsabtastung von 4,4 Schritt laden, wenn das SDS-PAGE-Gel läuft. </li><li> Folgen einem Standardprotokoll für entweder Silberfärbung oder Western - Blot - 21 22 das Zielprotein (e) zu detektieren. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Verschiedene Ansätze, um die Ziele von kleinen Molekülen zu identifizieren können grob in zwei Kategorien eingeteilt werden: top-down, wo der zelluläre Phänotyp des Medikaments verwendet wird seine potenzielle Ziele zu verengen auf der Grundlage ihrer bekannten Funktionen oder von unten nach oben, wo das Ziel 3 direkt durch chemische oder genetische Mittel identifiziert. Top-down oder phänotypische Studien können bestimmte zelluläre Prozesse identifizieren durch das Medikament beeinflusst (zB Transkr...

Bioaktive kleine Moleküle funktionieren grundlegend durch die Interaktion mit und die Änderung der Funktion von einer oder mehreren &quot;Ziel&quot; Moleküle, am häufigsten Proteine ​​in der Zelle. Bei der Wirkstofffindung, wenn eine aktive Verbindung durch phänotypische Screening entdeckt wird, die Identifizierung der molekularen Ziel (en) dieser Verbindung ist von entscheidender Bedeutung, nicht nur für das Verständnis des Mechanismus der Wirkung und mögliche Nebenwirkungen der Verbindung, sondern auch für potenziell entdecken neue Biologie der Krankheitsmodell zugrunde liegen und den Weg für die Entwicklung neuer mechanistische Klassen von Therapeutika 1 geebnet. Obwohl Zielidentifizierung nicht für ein Medikament erforderlich ist, um therapeutisch verwendet werden, in den letzten Jahren hat es eine zunehmende Anerkennung gewesen, dass neuartigen Arzneimittelkandidaten eher in klinischen Studien erfolgreich zu sein, und damit eine bessere Rendite erzielen, wenn ein validiertes Ziel bekannt ist 2. Somit besteht für die Identifizierung kleiner ein wachsendes Interesse an Verfahren gewesenMolekül Zielproteine. Eine klassische Zielidentifizierung Experiment beruht typischerweise auf Affinitätsreinigung, wobei das kleine Molekül von Interesse auf einem Harz immobilisiert ist und mit ganzen Zelllysaten inkubiert, wonach ungebundene Proteine ​​weggewaschen werden , und die verbleibenden Proteine ​​werden eluiert und 3 identifiziert. Während diese Technik die Ziele vieler kleiner Moleküle 4 ist es ungeeignet als universelles Ziel - ID - Verfahren aus mehreren Gründen zu identifizieren , verwendet wurde. Erstens muss das Zielprotein seine native Konformation nach der Zelllyse um behalten ihre Fähigkeit, in das kleine Molekül zu binden, beibehalten. Dies kann für Membranproteine ​​besonders problematisch sein, die oft Konformationsänderungen durchlaufen, nachdem sie von ihrer natürlichen Umgebung entfernt werden, oder einfach zu aggregieren und ausfallen Lösung. Zweitens muss das kleine Molekül chemisch so modifiziert werden, dass sie auf das Harz immobilisiert werden kann unter Beibehaltungseine Fähigkeit, das Zielprotein zu binden. Tiefbindungstaschen kann daher an ein kleines Molekül nicht mehr zugegriffen werden, wenn es zu dem Harz fixiert ist. Drittens muss die Bindungsaffinität ausreichend hoch sein, dass die Wechselwirkung während der Waschschritte aufrecht erhalten wird, die Identifizierung von geringerer Affinität Herstellung Wechselwirkungen schwierig. Viertens Umgebungsbedingungen wie pH, Ionenkonzentration oder der Anwesenheit anderer endogener Moleküle können räumlich innerhalb der Zelle variieren und sind manchmal Voraussetzungen für arzneimittel Target-Wechselwirkungen. Somit finden die richtigen Bedingungen außerhalb der Zelle zu ermöglichen und aufrechtzuerhalten Bindung kann eine erhebliche Menge von Versuch und Irrtum erforderlich. Photoaffinitätsmarkierung umgeht diese Probleme durch die kovalente wodurch eines kleinen Moleküls und dessen Ziel innerhalb der nativen Kontext einer Zelle binden. Anstatt das kleine Molekül zu einem großen sperrigen Harz Immobilisierung wird das Molekül anstelle chemisch modifiziert zwei kleine funktionelle g installierenroups: eine photoaktivierbare Gruppe, die eine kovalente Vernetzung an das Zielprotein erlaubt, wenn es mit einer bestimmten Wellenlänge von Licht bestrahlt wird, und einer Reportergruppe, die das Zielprotein ermöglicht werden erkannt und anschließend isoliert. Lebende Zellen werden mit dem Photoaffinitäts-Sonde behandelt, wobei die Sonde bindet und kovalent vernetzt an das Zielprotein und die Sonde-Protein-Komplex wird dann isoliert intakt. Die Spezifität der Sonde an die Zielbindungs ​​wird durch Durchführen einer Konkurrenzexperiment parallel gezeigt, wo ein Überschuß der Ausgangsverbindung verwendet wird, entfernt zu konkurrieren der Sonde an das Zielprotein binden. Das Design und die Synthese von Photoaffinitätssonden variiert stark von einem kleinen Molekül zu einem anderen, und wird nicht in diesem Protokoll abgedeckt werden; jedoch einige sehr gute Gespräche zu diesem Thema wurden 5-9 veröffentlicht. Die Hauptüberlegung ist, dass die Sonde die Bioaktivität der Stammverbindung behält daher presumably Bindung an das gleiche Ziel (s). Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) -Studien durchgeführt werden müssen, um zu bestimmen, welche Teile des Moleküls ohne Verlust der Bioaktivität kann geändert werden. Eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Gruppen wurden als photoaktivierbare Vernetzer, einschließlich Diazirin, Benzophenon und Arylazid, die jeweils Vor- und Nachteile 10 verwendet. Ebenso gibt es mehrere Reporter-Tags, die verwendet wurden Sonde-bindende Proteine ​​zu isolieren. Reporter - Gruppen können allein, wie beispielsweise die üblicherweise verwendeten Biotin oder Fluoreszenzmarker funktionsfähig sein, oder sie können Vorstufen sein , die weitere Funktionalisierung an der photochemischen Vernetzungsschritt im Anschluss erfordern, die den Vorteil haben , kleiner ist und daher weniger wahrscheinlich 11 - Bioaktivität zu kompromittieren. In diesem Protokoll haben wir eine Photoaffinitäts-Sonde, enthaltend ein Diazirin photochemischen Vernetzungsgruppe und eine endständige Alkin für die Befestigung einer Reportergruppe über eine Cu (I) verwendet -catalyzed Azid-Alkin Sharpless-Huisgen - Cycloaddition (oder klicken) Reaktion 12-15. Die SAR - Studien, die Sonde Design und die Synthese und die Ergebnisse dieser Untersuchungen an anderer Stelle 16-18 veröffentlicht wurden.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>Machen Sie einen frischen Tag der Anwendung. Bereiten Sie 100 mM Brühe in Wasser mit 4 eq NaOH vor.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amin (TBTA)</td><td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>Bereiten Sie 1,7 mM Brühe in einem Verhältnis von 4:1 von t-Butanol zu DMSO vor und lagern Sie sie bei -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Kupfersulfat (CuSO4&#8226; 5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>50 mM Brühe in Wasser zubereiten, bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Biotin-Azid</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>AZ104-100</td><td>Bereiten Sie 10 mM Vorrat in DMSO vor, lagern Sie bei -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azid&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td> 1 <td>Mio. Bestand in DMSO vorbereiten, lagern bei -20&nbsp; &deg;C.</td></tr>Während <tr>des Betriebs sollte eine <td>365-nm-UV-Lampe</td><td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>UV-Blockerbrille getragen werden.</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Tabletten, EDTA-frei</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>50x Lösung in Wasser zubereiten und bei -20&nbsp; lagern &deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 250</td><td>Auf Ausgang 1 einstellen, Einschaltdauer 30%.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoreszierender Gelscanner</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Verwenden Sie einen roten Laser, um Alexa-Fluor 647 zu erkennen.</td></tr><tr><td>Detergenzien-kompatibles Dc-Protein-Assay-Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Agarose-Kügelchen mit hoher Kapazität&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td> mit mittlerem, niedrigem Glukosegehalt, qualifiziert <td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin-Lösung</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 15140122</td><td></td></tr><tr><td>SDS-Probenpuffer (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nr. LC2676</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung von kleinen molekülen-bindende proteine ​​in nativer zellulären umgebung von lebenden zellen photoaffinitatsmarkierung

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Die Identifizierung des/der molekularen Ziel(s) von kleinen Molekülen ist ein herausfordernder, aber notwendiger Schritt zum Verständnis ihres Wirkmechanismus. Obwohl mehrere Methoden zur Identifizierung von Zielen entwickelt und verwendet wurden, um die Bindungsproteine einer Vielzahl von kleinen Molekülen erfolgreich aufzuklären, haben diese Techniken Nachteile, die sie für den Nachweis bestimmter Arten von kleinen Molekül-Ziel-Wechselwirkungen ungeeignet machen. Insbesondere nicht-kovalente Wechselwirkungen, die von nativen zellulären Bedingungen abhängen, wie z. B. die von Membranproteinen, deren Strukturen bei der Zelllyse gestört werden können, sind oft nicht für affinitätsbasierte Zielidentifizierungsmethoden zugänglich. Hier demonstrieren wir ein Verfahren, bei dem eine Sonde, die eine photolabile Gruppe enthält, verwendet wird, um kovalent mit dem niedermolekularen Bindungsprotein in der Umgebung der lebenden Zelle zu vernetzen, was den Nachweis und die Isolierung des Zielproteins ermöglicht, ohne dass die Interaktion nach der Zelllyse aufrechterhalten werden muss. Diese Technik ist ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung biologisch interessanter kleiner Moleküle mit unbekannten Mechanismen, sowohl im Rahmen der Grundlagenbiologie als auch in der Wirkstoffforschung.

Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit einer Photoaffinitätssonde des Antimykotikum Itraconazol erhalten, deren Verwendung bisher 16 veröffentlicht wurde. Diese Ergebnisse zeigen die Verwendung der Lebendzellphotoaffinitätsmarkierungstechnik, um erfolgreich eine große Itraconazol-bindende Protein als 35 kDa membrane protein Spannungsabhängiger Anionenkanal 1 (VDAC1) identifizieren. Das obige Protokoll wurde in HEK...

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bindungsproteine von kleinen Molekülen mithilfe einer Photoaffinitäts-Sonde zu identifizieren, die in lebenden Zellen an ihr Ziel binden kann, wodurch die anschließende Isolierung und Identifizierung des Targets ermöglicht wird. Diese Methode kann verwendet werden, um den molekularen Wirkmechanismus von Arzneimitteln oder anderen kleinen Molekülen aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine im nativen zellulären Umfeld stattfinden, wodurch das Risiko vermieden wird, die native Proteinstruktur und Bindungsbedingungen bei der Zelllyse zu stören.Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sterile Zellkulturschalen mit sechs Zentimeter Durchmesser in der gewünschten Anzahl vorbereiten. Üblicherweise wird eine Schale pro Behandlungsbedingung verwendet. Für diese Demonstration werden drei Zellkulturschalen vorbereitet: eine negative Kontrolle mit ausschließlich DMSO, gekennzeichnet als D, eine Probebehandlung allein, gekennzeichnet als P, sowie Probe in Kombination mit einem Konkurrenzinhibitor, gekennzeichnet als C. Geben Sie in jede Kulturschale 3,5 Millione

identification-small-molecule-binding-proteins-native-cellular

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

SNAP-tag und CLIP-tag Proteinmarkierung Systeme ermöglichen die spezifische, kovalente Bindung von Molekülen, einschließlich Fluoreszenzfarbstoffe, um ein Protein von Interesse in lebenden Zellen. Einmal kloniert und exprimiert, kann die markierte Protein mit einer Vielzahl von Substraten für zahlreiche nachgelagerte Anwendungen, ohne sich erneut Klon verwendet werden.

Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

Eine neuartige Technik zum Nachweis von endogenen Rezeptoren mit geringer Abundanz in Zebrafischembryonen wird beschrieben. Wir haben es AFLIP genannt, weil es aus der Affinitätsmarkierung des Rezeptors durch seinen Liganden besteht, der mit der Immunpräzipitation verbunden ist.

Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Wir bieten eine schrittweise Protokoll für Split-BioID, ein Protein-Fragmente-Ergänzung-Assay basiert auf der Nähe-labeling Technik BioID. Auf das Zusammenspiel der zwei bestimmte Proteine aktiviert, ermöglicht es die Proteomik-Analyse der Kontext-abhängige Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung. Die Methode ist einfach, kostengünstig und erfordert nur standard Laborgeräten.

Split-BioID — Proteomic Analyse der kontextspezifischen Proteinkomplexe in ihrer natürlichen zellulären Umgebung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Es wurde gezeigt, dass viele intrinsisch ungeordnete Proteine an der Bildung hochdynamischer biomolekularer Kondensate beteiligt sind, ein Verhalten, das für zahlreiche zelluläre Prozesse wichtig ist. Hier stellen wir eine auf Einzelmolekül-Bildgebung basierende Methode zur Quantifizierung der Dynamik vor, mit der Proteine in biomolekularen Kondensaten in lebenden Zellen miteinander interagieren.

Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Dieses Protokoll beschreibt die Single-Antibody-Markierung (SAL), um die nanoskalige räumliche Organisation von Plasmamembranproteinen zu klären. Durch die Nutzung kumulativer Antikörper-Epitope-Interaktionen auf Einzelmolekülebene kartiert Membran-SAL (mSAL) lokale Epitope-Verteilungen und erfasst gleichzeitig das Antikörperbindungsverhalten in der nativen zellulären Umgebung.

Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von Membranproteinen mittels Einzel-Antikörper-Markierung

Lernen Sie die Photoaffinitätsmarkierung zur Identifizierung kleiner Molekül-bindender Proteine in lebenden HEK 293 T Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse nativer Proteinstrukturen für die Wirkstoffforschung.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

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