Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bindungsproteine von kleinen Molekülen mithilfe einer Photoaffinitäts-Sonde zu identifizieren, die in lebenden Zellen an ihr Ziel binden kann, wodurch die anschließende Isolierung und Identifizierung des Targets ermöglicht wird. Diese Methode kann verwendet werden, um den molekularen Wirkmechanismus von Arzneimitteln oder anderen kleinen Molekülen aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine im nativen zellulären Umfeld stattfinden, wodurch das Risiko vermieden wird, die native Proteinstruktur und Bindungsbedingungen bei der Zelllyse zu stören.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie sterile Zellkulturschalen mit sechs Zentimeter Durchmesser in der gewünschten Anzahl vorbereiten. Üblicherweise wird eine Schale pro Behandlungsbedingung verwendet. Für diese Demonstration werden drei Zellkulturschalen vorbereitet: eine negative Kontrolle mit ausschließlich DMSO, gekennzeichnet als D, eine Probebehandlung allein, gekennzeichnet als P, sowie Probe in Kombination mit einem Konkurrenzinhibitor, gekennzeichnet als C. Geben Sie in jede Kulturschale 3,5 Millionen HEK 293 T-Zellen in vier Milliliter Kulturmedium.

Die Zellen über Nacht inkubieren. Vor der Behandlung der Zellen die benötigten Wirkstoffe in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vorportionieren. Für die Vorbehandlung mit dem Konkurrenzinhibitor vier Mikroliter DMSO zu jeweils zwei Röhrchen und vier Mikroliter 10-Millimolar-Konkurrenzinhibitor zu einem Röhrchen hinzufügen.

Für die Probentherapie geben Sie 16 Mikroliter DMSO in ein Röhrchen und jeweils 16 Mikroliter 15-Mikromolar-Photoaffinitätsprobe in zwei Röhrchen. Bringen Sie die Zellkulturschalen in die Zellkultursicherheitswerkbank, um die vorportionierten Wirkstoffe hinzuzufügen. Aspirieren Sie ein Milliliter Kulturmedium aus der Kompetitionstherapienschale, überführen Sie es in das Mikrozentrifugenröhrchen, das den vorportionierten Konkurrenzstoff enthält, und resuspendieren Sie den Wirkstoff im Medium.

Fügen Sie das Medium und die Wirkstoffmischung tropfenweise vorsichtig wieder der Schale hinzu. Fügen Sie auf die gleiche Weise DMSO sowohl der Negativkontrollschale als auch der Probenschale hinzu. Stellen Sie die Schalen für 30 Minuten zurück in den Inkubator.

Nach 30 Minuten bringen Sie die Schalen zurück in die Sterilbank und dimmen Sie das Licht. Geben Sie das vorportionierte DMSO zur Negativkontrollschale hinzu und fügen Sie den Sonden- sowie den Wettbewerbsschalen die Sonde hinzu. Stellen Sie die Schalen für eine Stunde zurück in den Inkubator.

Nach einer Stunde die Schalen auf Eis stellen. Die Zellen in jeder Schale vorsichtig mit fünf Milliliter eiskalter PBS waschen, um überschüssige Sonde zu entfernen. Die Zellen erneut mit vier Milliliter eiskalter PBS bedecken.

Stellen Sie eine Zellkulturschale zentriert drei Zentimeter unter der UV-Lampe auf einen Eisblock, um die Erwärmung durch die Lampe zu minimieren, und bestrahlen Sie sie drei Minuten lang. Nehmen Sie die Schale danach heraus und stellen Sie sie auf Eis. Bestrahlen Sie auf diese Weise alle Proben.

Nach der Bestrahlung aller Proben pipettieren Sie das PBS von den Zellen ab und geben 200 Mikroliter eiskaltes PBS mit Proteaseinhibitoren zu jeder Petrischale hinzu. Lösen Sie die Zellen mit einem Gummischaber von der Schale und überführen Sie sie in vorbeschriftete Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Geben Sie SDS zu jeder Probe hinzu, um eine Endkonzentration von 0,4 % zu erreichen. Lyse die Zellen, indem Sie die Suspension 10-mal kurz beschallen, eine Minute auf Eis inkubieren und anschließend erneut 10-mal beschallen.

Die Proben fünf Minuten lang in einem Heizblock bei 95 Grad Celsius zum Kochen bringen, um die Zelllyse abzuschließen und alle Proteine zu denaturieren. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration in jeder Probe gemäß der schriftlichen Anleitung die Proteinkonzentration durch Zugabe von PBS pH 8,5 plus 0,4 % SDS nach Bedarf auf 2,5 Milligramm pro Milliliter einstellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, 40 Mikroliter jedes in der vorherigen Phase hergestellten Zelllysats in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.

Geben Sie die folgenden Reagenzien in dieser Reihenfolge hinzu: 0,2 Mikroliter Flour-azid, 0,58 Mikroliter TCEP und 3,38 Mikroliter TBTA. Vortexen Sie, um zu mischen. Geben Sie 1,14 Mikroliter Kupfersulfat-Pentahydrat hinzu, um die Reaktion zu starten.

Kurz vortexen und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Zur Reaktionsquenchung 50 Mikroliter 2X SDS-Puffer hinzufügen. Die Proben auf einem SDS-PAGE-Gel laufen lassen und, sobald die Farbsäule das Ende des Gels erreicht hat, das Laufen des Gels weitere fünf Minuten fortsetzen, um sicherzustellen, dass der gesamte überschüssige, nicht umgesetzte Flour-Azid vollständig aus dem Gel ausgewandert ist.

Nachdem überschüssiges Flour-Azid vollständig abgewaschen wurde, das Gel auf eine Glasplatte geben und mithilfe eines fluoreszierenden Gelscanners gemäß den Herstelleranweisungen scannen. Zur Anheftung eines Biotin-Markers die maximale Menge an Zelllysaten nach der Proteinnormalisierung verwenden, sodass alle Proben das gleiche Volumen aufweisen. Die Lysate vorreinigen, indem jede Probe in ein neues Gefäß gegeben wird, das 50 µL vorgewaschene Streptavidin-Agarose-Hochkapazitätskügelchen enthält.

Ein Hour bei vier Grad Celsius unter Rotation inkubieren. Die Kügelchen durch Zentrifugation pelletieren. Das Überstandsmittel in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis überführen und die Kügelchen entsorgen.

Pro 500 Mikroliter Lyssat folgende Reagenzien hinzufügen: 1,38 Mikroliter Biotin-Azid, 5,5 Mikroliter TCEP und 32,5 Mikroliter TBTA. Ansatz kurz vortexen, um zu mischen. Danach 11 Mikroliter Kupfersulfat-Pentahydrat pro 500 Mikroliter Lyssat hinzufügen und kurz vortexen.

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Vier Probenvolumina Aceton, auf 20 Grad Celsius gekühlt, zugeben, die Proben vortexen und über Nacht bei 80 Grad Celsius inkubieren, um die Proteine vollständig zu präzipitieren und nicht umgesetztes Biotin-Azid zu entfernen. Am folgenden Tag die Proben bei 17.000 × g und 4 Grad Celsius 15 Minuten lang zentrifugieren, um die präzipitierten Proteine als Pellet abzutrennen.

Entfernen Sie den Überstand vollständig, geben Sie 150 Mikroliter PBS pH 7,4 und 1 % SDS zu jeder Probe hinzu und lösen Sie die Proteine durch Beschallung wieder auf. Geben Sie 600 Mikroliter PBS zu jeder Probe, um die Konzentration von SDS auf 0,2 % zu verdünnen, und geben Sie anschließend die Probe in ein neues Röhrchen, das 30 Mikroliter vorgewaschene Streptavidin-Agarose-Hochkapazitätskügelchen enthält. Inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius unter Rühren.

Nach einer Stunde die Kügelchen durch Zentrifugation bei 1000 x g für drei Minuten pelletieren. Den Überstand, der ungebundene Proteine enthält, abpipettieren und verwerfen. Ein Milliliter Waschpuffer zu den Kügelchen geben und fünf Minuten bei Raumtemperatur unter Rotation inkubieren.

Zentrifugieren, das Überstand entfernen und erneut mit Waschpuffer waschen. Nach dem letzten Waschschritt den Waschpuffer vollständig von den Perlen abpipettieren und 30 Mikroliter 2X SDS-Probelösungspuffer hinzufügen. Fünf Minuten lang in einem 95 Grad Celsius heißen Wärmepuffer inkubieren, um die Proteine von den Perlen freizusetzen.

Zentrifugieren Sie die Kügelchen bei 13000 x g bei Raumtemperatur für eine Minute. Pipettieren Sie vorsichtig den Probenpuffer, der die Proteine enthält, von den Kügelchen ab, um eine SDS-PAGE durchzuführen. Die Visualisierung der Proteine nach Markierung mit dem fluoreszierenden Farbstoff wird durch dieses fluoreszenzgescannte Gel veranschaulicht.

Die hauptsächliche spezifische Bindungsproteinbande bei etwa 35 Kilodalton ist nur in der Probenspur vorhanden und wird durch Überschuss der Ausgangsverbindung kompetitiv verdrängt. Dieselbe 35-Kilodalton-Bande wurde nach Biotin-Pulldown durch Silberfärbung sichtbar gemacht und anschließend mittels Massenspektrometrie als das Membranprotein VDAC1 identifiziert. Die Identität des Proteins wurde weiterhin mit einem spezifischen Antikörper gegen VDAC1 bestätigt.

Das Signal ist in der Probelane vorhanden und nimmt in der Wettbewerbslane ab. Durch die Einbeziehung der Input-Fraktion wird sichergestellt, dass der Antikörper funktioniert und das Protein von Interesse im Lysat nachgewiesen werden kann. Der leichte Anstieg des Molekulargewichts der Pulldown-Proben ist auf die kovalent gebundene Sonde zurückzuführen.

Es werden die Folgen dargestellt, die sich ergeben, wenn bestimmte Schritte des Protokolls nicht korrekt durchgeführt werden. Eine unvollständige Entfernung überschüssigen Flour-Azids führt zu großen schwarzen Verschmierungen am unteren Rand des fluoreszenzgescannten Gels, während eine unzureichende Vorklärfung der Lysate und/oder eine ungenügende Waschung der Kügelchen ein Silber-gefärbtes Gel mit sehr starker Hintergrundfärbung ergeben. Von Anfang bis Ende benötigt das Pull-down-Experiment zwei bis drei Tage zur Durchführung.

Nachdem das Zielprotein durch Massenspektrometrie oder Western Blot identifiziert wurde, sollten weitere zielgerichtete Validierungsexperimente durchgeführt werden, um die Relevanz des Targets für das druginduzierte Phänotyp zu bewerten.