Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls ist es, eine optische Kartierung des Sinusknotens der Maus aus einem intakten Langendorff-perfundierten Herzen oder einem isolierten Vorhofpräparat durchzuführen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Elektro- und Pathophysiologie des Sinusknotens über die Mechanismen von Herzschrittmacheranomalien, dem Sick-Sinus-Syndrom und verschiedenen damit verbundenen Erkrankungen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Untersuchung mehrerer Parameter in den intakten Geweben mit sehr hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht.

Nachdem Sie das entsprechende Maß an Anästhesie durch Zehenkneifen bestätigt haben, verwenden Sie eine gebogene 5,5-Zoll-Mayo-Schere und eine 5,5-Zoll-Kelly-Hämostatikzange, um einen Zentimeter langen Schnitt an der Vorderseite des Brustkorbs vorzunehmen. Fassen Sie mit einer vier Zoll gebogenen Iriszange schnell das Lungengewebe und schneiden Sie mit einer 4-Drittel-Zoll-Irisschere die Lunge, den Thymus und das Herz zusammen zusammen mit dem Perikard heraus. Waschen Sie das Taschentuch in sauerstoffhaltiger, 37 Grad Celsius modifizierter Tyrodenlösung.

Verwenden Sie dann eine gebogene Vannas Tübingen-Schere und eine Vierdrittel-Zoll-Pinzette mit fünf Zoll, um die Lunge, den Thymus und das Fettgewebe aus dem Herzen zu entfernen. Verwenden Sie als Nächstes eine speziell angefertigte 21-Gauge-Kanüle und zwei gebogene 4,3-Zoll-Pinzetten mit der Nummer fünf B, um die Aorta zu kanülieren und gleichzeitig das Herz mit 37 Grad Celsius Tyrodenlösung zu perfundieren und zu überfusionieren, wobei die Lösung vor der Perfusion durch einen Inline-11-Mikron-Nylonfilter geleitet wird, um eine Verstopfung des Koronarkreislaufs zu verhindern. Schließen Sie dann einen Druckmesskopf über einen Drei-Wege-Absperrhahn an eine Luer-Sperre an der Perfusionsleitung an, um den Aortendruck zu überwachen und die Perfusionsgeschwindigkeit so anzupassen, dass der Aortendruck bei Bedarf zwischen 60 und 80 Millimetern Quecksilbersäule gehalten wird.

Für die optische Kartierung des Sinusknotens aus einem Langendorff-perfundierten Herzen positionieren Sie das Organ in horizontaler Ausrichtung mit der hinteren Seite nach oben in einer Organbadkammer aus Glasgewebe und fixieren Sie die ventrikuläre Spitze mit Stiften mit einem Durchmesser von 0,1 Millimetern am silikonbeschichteten Boden der Kammer, um eine strömungsinduzierte Bewegung während des Experiments zu verhindern. Führen Sie einen kleinen Silikonschlauch über die Lungenvene, den linken Vorhof und die Mitralklappe in die linke Herzkammer ein und fixieren Sie den Schlauch mit einer 40er Seidennaht am umgebenden Bindegewebe. Als nächstes verwenden Sie eine weitere 40er Seidennaht, um die obere und untere Hohlvene zu schlingen und den Rand des rechten Vorhofohrs an den Boden der Kammer zu stecken.

Strecken Sie das andere Ende der Naht und stecken Sie es an den Boden der Kammer und platzieren Sie eine speziell angefertigte Stimulationselektrode am Rand des rechten Vorhofohrs. Platzieren Sie dann zwei monopolare Elektroden mit 12-Millimeter-Nadeln in der Nähe der Basis des rechten und linken Ventrikels und platzieren Sie die geschliffene Elektrokardiogramm-Elektrode in der Nähe der Ventrikelspitze. Um das Gewebe zu färben, injizieren Sie den verdünnten Farbstoff in eine Inline-Perfusionsöffnung der koronaren Perfusionsleitung, um ihn über einen Zeitraum von fünf bis sieben Minuten zu verabreichen.

Nach 20 Minuten Stabilisierung fügen Sie 0,5 Milliliter 37 Grad Celsius Blebbistatin in das Perfusat hinzu, gefolgt von der Injektion von 0,1 Millilitern Blebbistatin, verdünnt in 1 Milliliter 37 Grad Celsius Tyrodenlösung, in die koronare Perfusionslinie über weitere fünf bis sieben Minuten unter Verwendung eines Inline-Luer-Lock-Injektionsports. Blebbistatin sollte mit Vorsicht angewendet werden. Um eine Ausfällung des Inhibitors zu verhindern, lösen Sie zuerst das Blebbistatin in einem auf klare 37 Grad erwärmten Medium auf und rühren Sie die Mischung kräftig um.

Um die Probe optisch abzubilden, befestigen Sie zunächst ein kleines abgedecktes Glas auf der Oberfläche der Lösung über dem Gewebe, um Bewegungsartefakte durch die vibrierende Lösung zu reduzieren. Richten Sie dann unter Verwendung eines flexiblen, gegabelten Lichtleiters mit einem Anregungslicht, das von einer rauscharmen Halogenlampe mit konstantem Strom bereitgestellt wird, den gefilterten Lichtstrahl auf das Gewebe und bilden Sie das resultierende Fluoreszenzsignal ab. Nach der Kanülierung des Herzens, wie gerade gezeigt, präparieren Sie die Ventrikel von der vorderen Seite weg und öffnen Sie den rechten Vorhof durch die Trikuspidalklappe entlang der Achse der oberen Hohlvene der Trikuspidalklappe, gefolgt von einem Schnitt durch den medialen Schenkel der Crista terminalis.

Um die vordere atriale freie Wand zu öffnen, machen Sie einen Schnitt von der Mittellinie des Schnitts an den medialen Gliedmaßen bis zum Rand der rechten unteren Ecke des rechten Vorhofohrs und stecken Sie die abgeflachte atriale freie Wand an den Boden einer silikonbeschichteten Kammer. Um das linke Vorhofohr zu öffnen, durchtrennen Sie die Mitralklappe entlang der oberen Ecke der Mitralklappe des linken Vorhofohrs. Stecke dann den geöffneten linken Vorhof fest, wie es zuvor für den rechten Vorhof gemacht wurde.

Anschließend wird das ventrikuläre Gewebe teilweise entfernt. Bewahren Sie einen Rand aus ventrikulärem Gewebe auf, um das Präparat zu fixieren, um eine Beschädigung der Vorhöfe zu vermeiden, und befestigen Sie das Gewebe am Boden einer mit Sylgard beschichteten Kammer. Heben Sie nun das endgültige Präparat etwa 0,5 Millimeter vom Boden der silikonbeschichteten Kammer an, um eine Superfusion sowohl von der Epikard- als auch von der Endokardoberfläche zu ermöglichen, und übermalen Sie die Probe mit 37 Grad Celsius Tyrodenlösung.

Platzieren Sie dann eine maßgefertigte Stimulationselektrode aus Silberchlorid am Rand des präparierten rechten Vorhofohrs. Platzieren Sie jeweils eine monopolare Elektrode mit 12-Millimeter-Nadel in der Nähe des rechten und linken Vorhofohrs und platzieren Sie die geerdete Elektrokardiogramm-Elektrode in der Nähe des atrialen ventrikulären Übergangs. Um das Herzgewebe zu färben, verwenden Sie eine 1-Millimeter-Pipette, um den spannungsempfindlichen Farbstoff, der in 37 Grad Celsius Tyrodenlösung verdünnt ist, langsam direkt auf das Gewebe abzugeben.

Immobilisieren Sie dann die Probe durch direktes Auftragen von verdünntem Blebbistatin auf das Gewebe, gefolgt von der Verabreichung von weiteren 0,5 Millilitern Blebbistatin über das Perfusat und kartieren Sie die Probe optisch, wie gerade demonstriert. Die Schritte zur Gewebefärbung und Blabbistatin-Hemmung sind entscheidend und erfordern eine genaue Implementierung und ein präzises Färbeverfahren, damit die atrialen physiologischen Parameter, einschließlich der Herzfrequenz, der Zuweisung des führenden Schrittmachers und der Vorhofleitung, nicht beeinflusst werden. Hier wird eine typische rechtsatriale Aktivierungskonturkarte gezeigt, die für den spontanen Sinusrhythmus für ein Langendorff-perfundiertes Mausherz rekonstruiert wurde, mit zwei entsprechenden rechtsatrialen Konturkarten, die mit Abtastraten von 1 und 0,5 Millisekunden aufgenommen wurden.

Der frühe Aktivierungspunkt befindet sich in der interkavalen Region in der Nähe der oberen Hohlvene, wo der Sinusknoten anatomisch definiert ist. In diesem Experiment wurde nach einer mindestens einminütigen Stimulation des rechten Vorhofohrs bei 10 bis 12 Hertz die elektrische Stimulation gestoppt und die Erholungszeit des Sinusknotens als Zeitintervall zwischen dem letzten erfassten Aktionspotential und dem ersten spontanen Aktionspotential berechnet. Durch die Aktivierung der isolierten Vorhofpräparation während des spontanen Sinusrhythmus kann der genaue Bereich der Position des führenden Herzschrittmachers identifiziert werden.

Wenn die Verfahren zur Operation und zur Beladung mit Farbstoffen angemessen befolgt werden, sollten keine signifikanten Veränderungen der physiologischen Eigenschaften des Vorhofs beobachtet werden. Obwohl die arterielle Färbung eine größere Menge an Farbstoff erfordern kann, scheint das Fluoreszenzsignal im Gewebe des Sinusknotenbereichs durch diese Belastungsmethode stabiler zu sein, mit einer Signalintensitätsabklingzeit nach der Koronarfärbung, die fast doppelt so lang ist wie die nach der Oberflächenfärbung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30, 40 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Achten Sie bei diesem Verfahren darauf, die Anatomie des Vorhofs zu lokalisieren, bevor Sie einen Schnitt vornehmen, um eine Beschädigung des Vorhofgewebes und des Sinusknotens zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Maßnahmen wie konventionelle Glasmitralelektrodenaufnahmen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Eigenschaften des kommutativen Transmembranpotentials zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Intellektphysiologie, um atriale Arrhythmien einschließlich der Sinusknotendysfunktion im Herzen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine hochauflösende optische Kartierung einer Maus-Sinusknotenpräparation durchführen.