Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls besteht darin, die optische Abbildung des Sinusknotens der Maus an einem intakten, langendorff-perfudierten Herzen oder an einer isolierten Vorhofpräparation durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Elektro- und Pathophysiologie des Sinusknotens bezüglich der Mechanismen von Schrittmacherstörungen, des kranken Sinusknotensyndroms und verschiedener mit Vorhofarrhythmien assoziierter Erkrankungen zu beantworten. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Untersuchung mehrerer Parameter in intaktem Gewebe mit sehr hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht.

Nachdem die angemessene Anästhesietiefe durch Zehenquetschen bestätigt wurde, verwenden Sie gebogene 5,5-Zoll-Mayo-Scheren und 5,5-Zoll-Kelly-Hämostatik-Forceps, um einen ein Zentimeter langen Schnitt an der Vorderseite des Thorax durchzuführen. Greifen Sie mithilfe vier Zoll langer gebogener Iris-Forceps das Lungengewebe rasch an und schneiden Sie mit vier Drittel Zoll langen Iris-Scheren Lunge, Thymus und Herz gemeinsam mit dem Perikard aus. Spülen Sie das Gewebe in mit Sauerstoff angereicherter modifizierter Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie dann gebogene drei Zoll lange Vannas-Tubingen-Scheren und 4,3 Zoll lange Nr.-5-Debaki-Zangen, um die Lunge, den Thymus und das Fettgewebe vom Herzen zu entfernen. Anschließend katheterisieren Sie die Aorta mit einer speziell angefertigten 21-Gauge-Kanüle und zwei gebogenen 4,3 Zoll langen Nr.-5-B-Debaki-Zangen und perfundieren sowie überströmen das Herz gleichzeitig mit Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius, wobei die Lösung vor der Perfusion durch einen inline 11-Mikron-Nylonfilter geleitet wird, um ein Verstopfen der Koronarzirkulation zu verhindern. Danach schließen Sie einen Druckmesswandler über einen Dreiweg-Hahn an eine Luer-Lock-Verbindung der Perfusionsleitung an, um den aortalen Druck zu überwachen, und passen die Perfusionsgeschwindigkeit nach Bedarf an, um den aortalen Druck zwischen 60 und 80 Millimeter Quecksilbersäule zu halten.

Positionieren Sie das Organ für die optische Abbildung des Sinusknotens aus einem Langendorff-perfudierten Herzen horizontal mit der hinteren Seite nach oben in einer Glasorgankammer und verwenden Sie 0,1 Millimeter dicke Stifte, um die Ventrikelspitze am silikonbeschichteten Boden der Kammer zu befestigen, um bewegungsinduzierte Bewegungen während des Experiments zu verhindern. Führen Sie einen kleinen Silikonschlauch über die Lungenvene, die linke Vorhöfe und die Mitralklappe in den linken Ventrikel ein und verwenden Sie eine 40er Seidennaht, um den Schlauch am umgebenden Bindegewebe zu fixieren. Verwenden Sie anschließend eine weitere 40er Seidennaht, um die obere und untere Hohlvene zu umfassen, und befestigen Sie den Rand des rechten Vorhofohrs am Boden der Kammer.

Dehnen Sie das andere Ende der Naht und befestigen Sie es am Boden der Kammer. Platzieren Sie eine speziell angefertigte Stimulations-Elektrode am Rand des rechten Atrium-Anhängsels. Danach platzieren Sie zwei 12-Millimeter-Nadelelektroden für das Elektrokardiogramm in monopolarer Anordnung nahe der Basis des rechten und linken Ventrikels und positionieren Sie die Erdungselektrode des Elektrokardiogramms in der Nähe der Ventrikelspitze. Um das Gewebe anzufärben, injizieren Sie den verdünnten Farbstoff über einen Inline-Perfusionshafen der Koronarperfusionsleitung, wobei die Applikation über einen Zeitraum von fünf bis sieben Minuten erfolgt.

Nach 20 Minuten Stabilisierung 0,5 Milliliter 37 Grad Celsius warmes Blebbistatin in das Perfusat geben, gefolgt von der Injektion von 0,1 Milliliter Blebbistatin, verdünnt in 1 Milliliter 37 Grad Celsius warmer Tyrode-Lösung, über einen Zeitraum von weiteren fünf bis sieben Minuten in die koronare Perfusionsleitung mittels eines integrierten Luer-Lock-Injektionshakens. Blebbistatin sollte mit Vorsicht verwendet werden. Um eine Ausfällung des Inhibitors zu vermeiden, sollte Blebbistatin zunächst in ein auf klare 37 Grad erwärmtes Medium gelöst und das Gemisch kräftig gerührt werden.

Um die Probe optisch abzubilden, befestigen Sie zunächst ein kleines Abdeckglas auf der Oberfläche der Lösung über dem Gewebe, um Bewegungsartefakte durch die vibrierende Lösung zu minimieren. Leiten Sie dann mithilfe eines flexiblen, geteilten Lichtwellenleiters, bei dem das Anregungslicht von einer konstantstromgespeisten, geräuscharmen Halogenlampe bereitgestellt wird, den gefilterten Lichtstrahl auf das Gewebe und nehmen Sie das resultierende fluoreszierende Signal auf. Nachdem das Herz wie zuvor gezeigt kaniert wurde, dissezieren Sie die Ventrikel von der vorderen Seite ab und öffnen Sie den rechten Vorhof entlang der Achse des Tricuspidalklappens und der oberen Hohlvene durch die Tricuspidalklappe hindurch, gefolgt von einem Schnitt durch das mediale Bein der Crista terminalis.

Um die vordere freie Vorhofwand zu öffnen, führen Sie einen Schnitt von der Mittellinie des medialen Astschnitts bis zur Kante der rechten unteren Ecke des rechten Ohrenanhangs durch und fixieren Sie die flach ausgebreitete freie Vorhofwand am Boden einer silikonbeschichteten Kammer. Um den linken Ohrenanhang zu öffnen, schneiden Sie entlang der oberen Ecke des Mitralklappenklappensegels durch die Mitralklappe. Danach fixieren Sie den geöffneten linken Vorhof, wie zuvor beim rechten Vorhof durchgeführt.

Entfernen Sie dann das Ventrikulargewebe teilweise. Bewahren Sie einen Saum des Ventrikulargewebes zum Fixieren der Präparation auf, um Schäden an den Vorhöfen zu vermeiden, und heften Sie das Gewebe an den Boden einer mit Sylgard beschichteten Kammer. Heben Sie nun die endgültige Präparation etwa 0,5 Millimeter vom Boden der silikonbeschichteten Kammer an, um eine Überströmung sowohl der epikardialen als auch der endokardialen Oberfläche zu ermöglichen, und überströmen Sie die Probe mit Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius.

Danach eine selbstgefertigte Silberchlorid-Reizelektrode an den Rand des präparierten rechten Atriumohrs legen. Eine monopolare Elektrokardiogramm-Nadelelektrode mit 12 Millimeter Durchmesser in der Nähe jedes der rechten und linken Atriumohren platzieren und die Erdungselektrode des Elektrokardiogramms in der Nähe der Atrioventrikulargrenze anbringen. Um das Herzgewebe anzufärben, mit einer 1-Milliliter-Pipette spannungsabhängiges Farbstoffmittel, das in Tyrode-Lösung mit 37 Grad Celsius verdünnt wurde, langsam direkt auf das Gewebe geben.

Danach fixieren Sie die Probe durch direkte Applikation von verdünntem Blebbistatin auf das Gewebe, gefolgt von der Gabe eines weiteren 0,5 Milliliter Blebbistatin über das Perfusat, und führen die optische Abbildung der Probe wie zuvor gezeigt durch. Die Schritte der Gewebefärbung und der Blebbistatin-Inhibition sind entscheidend und erfordern eine genaue Durchführung sowie ein präzises Färbeprotokoll, um sicherzustellen, dass die physiologischen Parameter des Vorhofs – einschließlich Herzfrequenz, Lokalisation des führenden Schrittmachers und Vorhofleitung – nicht beeinflusst werden. Hier ist eine typische Aktivierungskonturkarte des rechten Vorhofs dargestellt, rekonstruiert für spontanen Sinusrhythmus an einem Langendorff-perfudierten Mausherzen, zusammen mit zwei entsprechenden Konturkarten des rechten Vorhofs, die mit Abtastraten von 1 und 0,5 Millisekunden aufgezeichnet wurden.

Der frühe Aktivierungspunkt befindet sich im interkavalen Bereich in der Nähe der Vena cava superior, wo der Sinusknoten anatomisch definiert ist. In diesem Experiment wurde nach einer mindestens eine Minute andauernden Stimulation des rechten Atrium-Anhängs mit 10 bis 12 Hertz die elektrische Stimulation gestoppt und die Sinusknoten-Rekoverzeit als Zeitintervall zwischen dem letzten erfassten Aktionspotential und dem ersten spontanen Aktionspotential berechnet. Die Aktivierung des isolierten atrialen Präparats während des spontanen Sinusrhythmus ermöglicht die genaue Identifizierung des führenden Schrittmacherbereichs.

Wenn die chirurgischen Eingriffe und die Färbemethoden korrekt durchgeführt werden, sollten keine signifikanten Veränderungen in den physiologischen Eigenschaften des Vorhofs beobachtet werden. Obwohl die arterielle Färbung möglicherweise eine größere Menge an Farbstoff erfordern kann, erscheint das fluoreszierende Signal im Gewebe des Sinusknotens bei dieser Lademethode stabiler, wobei die Zerfallszeit der Signalintensität nach Koronarfärbung fast doppelt so lang ist wie nach Oberflächenfärbung. Ist die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in 30 bis 40 Minuten abgeschlossen werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Vorhofanatomie vor dem Durchtrennen zu lokalisieren, um das Vorhofgewebe und den Sinusknoten nicht zu beschädigen. Nach diesem Verfahren können weitere Untersuchungen wie konventionelle Aufzeichnungen mit gläsernen Mikroelektroden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der kommutativen transmembranen Potentialcharakteristika zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Intelligenzphysiologie, um Vorhofarrhythmien einschließlich einer Sinusknotenfunktionsstörung im Herzen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine optische Abbildung mit hoher Auflösung einer Maus-Sinusknopf-Präparation durchführt.