Name: Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie die optische Abbildung des sinuatrialen Knotens der Maus mit Langendorff-perfundiertem Herzen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Untersuchungen von Schrittmacherfunktionen und Arrhythmien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir werden vom Start-up der University of Wisconsin-Madison Medical School (A.V.G.) unterstützt.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung Nr. 80-23) durchgeführt. Alle Methoden und Protokolle in diesen Studien verwendet wurden von der University of Wisconsin Animal Care und Verwenden Protokoll Ausschuss nach den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren veröffentlicht von NIH (Veröffentlichung Nr 85-23, überarbeitet 1996) genehmigt. Alle Tiere in dieser Studie verwendeten erhielt humane Pflege im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Herzentfernung und Langendorff-Perfusion <ol><li> Vor der Herzisolierung, warm Tyrode-Lösung auf 37 ° C durch ein Wasserbad und einen Wassermantel verwendet wird. </li><li> Anesthetize die Maus mit 5% Isofluran / 95% O 2. </li><li> Stellen Sie sicher, angemessene Höhe der Anästhesie durch den Verlust der Schmerzreflex zu überprüfen. </li><li> Führen Sie Thorakotomie. Öffnen Sie die Brust durch die Verwendung gekrümmter 5,5 &quot;Mayo Schere und 5,5&quot; Kelly hämostatische fürCEPS ein 1 cm an der Vorderseite des Brustkorbs zu schneid machen. <ol><li> Schnell extrahieren das Herz aus der Brust (innerhalb von 30 Sekunden). Verwenden Sie 4 &quot;gekrümmten Iris Zange das Lungengewebe zu greifen und die Lunge, Thymus und Herz ausgeschnitten zusammen mit dem Herzbeutel mit 4.3&quot; Iris Schere. Nicht direkt das Herz zu greifen. </li><li> Waschen Sie es in oxygeniertem (95% O 2/5% CO 2), konstanter Temperatur (36,8 ± 0,4 ° C) modifizierte Tyrode-Lösung. Verwenden Sie die folgende Lösungszusammensetzung (in mM): 128,2 NaCl, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3 und 11,1 Glukose (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Während in der gleichen Lösung getaucht, identifizieren die Lunge, Thymus und Fettgewebe. sezieren sie vorsichtig aus dem Herzen. Verwenden gebogen 3 &quot;Vannas-Tübingen Schere und 4.3&quot; # 5 Pinzette. </li><li> Dann die Aorta identifizieren und kanülieren es auf einem maßgeschneiderten 21 G Kanüle. Verwenden Sie zwei gekrümmten 4.3 &quot;# 5B Kraftps. </li><li> gleichzeitig perfundieren nach Kanülierung (durch die Kanüle mit einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 5 ml / min, das auf der Grundlage der Aortendruck eingestellt werden sollte, siehe unten) und superfuse (in dem Bad bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ~ 50 ml / min) das Herz mit erwärmtem und Tyrode-Lösung während des gesamten Experiments filtriert. Übergeben Sie die Perfusionslösung durch eine in-line 11 &amp; mgr; m Nylonfilter zur Verstopfung der koronaren Zirkulation verhindern. </li><li> Verwendung eines Druckwandlers (oder ein Manometer) verbunden ist über ein 3-Wege-Hahn Luer Lock mit dem Perfusionsleitung, überwachen den Aortendruck und halten es zwischen 60 und 80 mmHg. Passen Sie Ihre Geschwindigkeit Perfusion bei Bedarf die Aortendrucks in diesem Bereich zu halten. </li></ol> 2. Optische Kartierung des SAN aus dem Langendorff-perfundierten ganzes Herz <ol><li> Instrumentierung <ol><li> Legen Sie das Herz horizontal und stecken die Herzspitze an den silikonbeschichteten Boden der Kammer mit 0,1 mm Durchmesser Stifte prevent Strom-induzierte Bewegung während des Experiments. 12 </li><li> Legen Sie eine kleine (0,012 &quot;ID x .005&quot;) Silikonschlauch in den linken Ventrikel (LV) über die Lungenvenen, die linken Vorhofs (LA) und die Mitralklappe (MV). Befestigen Sie das Rohr durch ein Seidenfaden (4-0) mit dem klingender Bindegewebe. </li><li> Positionieren Sie das Herz mit seiner hinteren Seite nach oben (Abbildung 1A, linkes Feld). </li><li> Pin der Kante des RA Anhängsel (RAA) mit dem Silizium Boden der Kammer unter Verwendung von 0,1 mm Durchmesser minutien Pins. Stellen Sie das Niveau, um die hintere Fläche des RA flach zu machen und ermöglichen es der Kamera Fokusebene befinden. Dies wird optischen Messungen aus der maximalen Fläche des Atriums ermöglichen. </li><li> Noose superior (SVC) und inferior (IVC) Hohlvene durch einen Seidenfaden (4-0), strecken und stecken Sie das andere Ende des Fadens auf dem Boden einer silikonbeschichteten Kammer (siehe 3A). Stellen Sie sicher, dass die Nähte nicht blockieren dieoptische Sehfeld. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulationselektrode, die auf dem Rand des RAA. Elektroden herzustellen, zu verwenden Silizium 0,25 mm Durchmesser Silberdrähte mit 0,5 mm Abstand zwischen den Elektroden und frei von Silizium für eine Länge von 1 mm an der Stimulations Ende beschichtet. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29-Gauge) monopolaren Elektroden in der Nähe der Basis des rechten und linken Ventrikels. Platzieren Sie den Boden EKG-Elektrode in der Nähe der Spitze der Ventrikel. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Da beide Fluoreszenzfarbstoffe und elektromechanische Entkupplungsgleise blebbistatin lichtempfindlich sind, führen alle Verfahren unten in einem dunklen Raum beschrieben. Erste spannungsempfindlichen Farbstoff RH-237 oder Di-4-ANNEPS als Stammlösung, 1,25 mg / ml in Dimethylsulfoxid (2,5 mM) herzustellen, aliquoten es (30 &amp; mgr; l pro Stück) und speichern Sie die Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Verdünnen 5-10 ul Farbstoff-Stammlösung in 1 ml erwärmt (37 ° C) Tyrode-Lösung und dann spritzen sie in die Koronarperfusion Linieüber einen Zeitraum von 5-7 min ein Inline-Luer-Injektionsanschluss verwenden. </li><li> Bereiten Sie blebbistatin als Stammlösung (2 mg / ml in Dimethylsulfoxid, 6,8 mM) im Voraus und lagern bei 4 ° C. </li><li> Nach 20 min Stabilisierung, 0,5 ml erwärmter (37 ° C) blebbistatin im Perfusat und 0,1 ml blebbistatin in 1 ml erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt. Dann spritzen in die Koronarperfusion Linie über einen Zeitraum von 5-7 min unter Verwendung eines in-line Luer Injektionsöffnung. </li></ol></li></ol> 3. Optische Kartierung des SAN aus dem isolierten Atrial Vorbereitung <ol><li> Instrumentierung <ol><li> Für die isolierten Vorhof Vorbereitung, zu isolieren und das Herz kanülieren wie in den Schritten 1.1-1.5 für Ganz Herz Vorbereitung oben beschrieben. </li><li> Präparieren Sie die Ventrikel weg von der vorderen Seite. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 1 für weitere Einzelheiten. </li><li> Öffnen Sie die RA durch Schneiden durch die tricuspid vaLVE (TV) entlang der TV-SVC-Achse. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 2 für weitere Einzelheiten. </li><li> Schneiden Sie den medialen Teil des Crista terminalis die RAA zu öffnen. Siehe Abbildung 1A, rechte Tafel, schneiden # 3. </li><li> Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand durch einen Schnitt von der Mittellinie des vorigen Schnitt # 3 an den Rand des rechten unteren Ecke des RAA Durchführung, glätten und stecken die atriale freie Wand auf dem Boden eines silikonbeschichteten Kammer. Siehe die Richtung , die durch den hohlen Pfeil in 1A gezeigt ist , schneiden # 4. Bewahren Sie einen Rand von ventrikulären Gewebe für Pinning die Vorbereitung Schäden an den Vorhöfen zu verhindern. </li><li> In ähnlicher Weise offen LA durch entlang der MV-oberen Ecke des LA Anhängsel (LAA) durch den MV zu schneiden. </li><li> Zum Öffnen des LAA, aus der Mitte des geöffneten LAA geschnitten, durch die vordere atriale freie Wand, bis in der Nähe eines mittleren Rand des LAA. </li><li> Öffnen Sie die vordere atriale freie Wand aloin die gleiche Richtung ng, dann abflachen und an der Unterseite eines Sylgard beschichtet Kammer fixieren. </li><li> entfernen teilweise die interatrial septalen Gewebe. Dadurch wird eine Streuung des optischen Signals von Gewebe zu reduzieren, die nicht im Fokus ist. Daher sind sowohl die LA und RA sowie die SAN und atrioventrikuläre Übergang (AVJ) zugänglich sind , in dieser Zubereitung (1B). </li><li> Heben die Endzubereitung von etwa 0,5 mm von der Unterseite des Silizium-beschichteten Kammer auf, um zu ermöglichen Superfusions sowohl epikardialen und endokardialen Oberflächen. </li><li> Superfuse die Herstellung mit erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung bei einer konstanten Rate von ~ 12 ml / min für eine gezielte Strömung in der Nähe der SVC und ~ 30 ml / min für ein Bad Superfusions. </li><li> Legen Sie die maßgeschneiderte Stimulations Ag / AgCl 2 Elektrode (0,25 mm Durchmesser) am Rande des seziert RAA. Dann werden zwei EKG-12 mm-Nadel legen (29G) Elektroden (monopolare) in der Nähe des RAA und LAA sind. Legen Sie den Boden EKG wählenritt in der Nähe des AVJ. </li></ol></li><li> Die Färbung <ol><li> Durchführen einer direkten Anwendung der spannungsempfindlichen Farbstoff (RH-237 oder di-4-ANNEPS). Hierzu 1-2 ul der Farbstoffstammlösung in 1 mm erwärmter (37 ° C) Tyrode-Lösung verdünnt und lösen sich langsam die verdünnte Farbstoff auf der Oberfläche der Zubereitung durch eine 1 mm Pipette. </li><li> Alternativ führen atrial Färbung mit dem spannungsempfindlichen Farbstoff durch eine koronare Perfusion des Langendorff perfundierten Herzen ähnlich der oben für die Vollherz Zubereitung beschrieben (Schritte 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Nach der Koronarperfusion Färbung, isolieren die atriale Zubereitung wie beschrieben. Führen Färbung zusätzliche Oberfläche, wenn eine zufriedenstellende Fluoreszenzniveau zu erreichen benötigt. Schnellvorhof Isolation bleichen den Farbstoff nicht und wirkt sich nicht auf die Qualität der Färbung. </li></ol></li><li> Immobilisieren der Präparation mit dem elektromechanischen Entkoppler, blebbistatin. Verdünnen Sie 3-5 ul blebbistatin Stammlösung im wärmten (37 ° C) Tyrode-Lösung und lassen Sie langsam die verdünnte blebbistatin auf der Oberfläche der Zubereitung und der umgebenden Lösung. Da blebbistatin wurde Licht lichtempfindlich, 13,14 Vermeiden Sie lange Aussetzung während der Herstellung und Färbung gezeigt werden. </li><li> Führen Sie zusätzliche blebbistatin Anwendung so viel wie nötig Kontraktion zu unterdrücken. Normalerweise können bis zu 3 zusätzliche Anwendungen (3-5 &amp; mgr; l pro jede Anwendung) kann die Bewegungsartefakt ausreichend, um genau zu rekonstruieren, SAN und Vorhofaktivierung zu unterdrücken. </li><li> Fügen Sie weitere 0,5 ml erwärmt blebbistatin im Perfusat. Während dieser Prozedur unterbrechen die Superfusions für 30 sec die Farbstoff / blebbistatin zu färben das Vorhofgewebe zu ermöglichen. </li></ol></li></ol> 4. Optische Mapping einrichten HINWEIS:. Eine detaillierte Beschreibung des optischen Abbildungssystems wird an anderer Stelle 12 vorgesehen ist <ol><li> Verwenden Sie eine Kamera mit einem Temporal Auflösung von 2000 Bildern / s oder höher, und eine Reihe von Kondensorlinsen räumlichen Auflösung von 100 &amp; mgr; m / Pixel oder höher zu erreichen. Dies ist erforderlich, SAN-Aktivierung und Vermehrung intranodal zu rekonstruieren. </li><li> Um Bewegungsartefakte aus der vibrierenden Lösung, fix ein kleines Deckglas auf der Oberfläche der Lösung über das Herz / isolierte atriale Vorbereitung reduzieren. </li><li> Verwenden Sie Anregungslicht (520 ± 45 nm Wellenlänge), die durch einen Konstantstrom, Low-Noise-Halogenlampe. Richten Sie die gefilterten Lichtstrahl auf die Herstellung durch ein flexibles gegabelten Lichtleiter verwendet wird. </li><li> Filtern Sie die emittierte Fluoreszenz durch ein Langpassfilter (&gt; 715 nm). Sammeln, zu digitalisieren und das erworbene Fluoreszenzsignal auf einem Computer mit Software, die von der Kamera-Herstellers zu speichern. </li></ol> 5. Datenverarbeitung Hinweis: Das optische Abbildungsdaten gesammelt und als eine Reihe von Matrizen von Fluoreszenzintensität bei verschiedenen Zeitpunkten gespeichert. Jedes Pixel represengen ein Maß für die Fluoreszenzintensität von einer bestimmten Stelle auf der Gewebepräparation zu einem bestimmten Zeitpunkt gesammelt. Die Hintergrundfluoreszenz wird automatisch pro Pixel entfernt zur besseren Visualisierung von Fluoreszenzänderungen durch Membranspannungsänderungen erzeugt zu ermöglichen und umgekehrt mit Aktionspotentiale (APs) von Mikroelektroden-Systeme gemessen entsprechen. Informationen über die verschiedenen Schritte bei der Verarbeitung von optischen Bilddaten, einschließlich Bildsegmentierung, räumliche Filterung, zeitliche Filterung und Basisliniendrift Entfernung, in der Schwerpunktprüfung zur Verfügung gestellt. 15 <ol><li> Manuell oder durch den speziellen Algorithmus (beispielsweise eine Schwellwertbildung oder Kantendetektion) 15 Gewebegrenzen , um zu bestimmen, Erstellen einer binären Maske von 1 (eingeschlossen Pixel) und 0 (ausgeschlossen Pixel) und die Maske in der Sequenz zu jedem Rahmen. Dieser Prozess erzeugt ein binäres Bild, das Bereiche von Interesse für die weitere Verarbeitung hervorhebt. </li><li> Zur Verbesserung der Signal-zu-Rausch-Verhältnis des Optschen Daten, filtern die Signale innerhalb der ausgewählten Bereiche von Interesse. Hierzu verwenden räumliche (dh Mittelung von benachbarten fluoreszierenden Bildpunkte , wie durch einen gewünschten Faltungs bin oder kernel definiert, beispielsweise 3 x 3 oder, für verrauschte Daten, 5 x 5) und / oder zeitliche Filterung (beispielsweise Butterworth, Chebyshev - Typ 1, Chebyshev - Typ 2, Elliptic etc.) (Abbildung 2). Halten Sie die Möglichkeit, gefiltert induzierten Artefakte im Auge, wenn die Daten zu interpretieren. Weitere Informationen finden Sie Bewertung. 15 </li><li> Entfernen Drift der Basislinie in optischen Aufnahmen bei Bedarf (durch Hochpassfilterung oder Polynomanpassung zum ursprünglichen Signal verwendet wird) und dann normalisiert jedes Pixelsignal von 0 (minimaler Fluoreszenz) bis 1 (maximale Fluoreszenz). </li><li> Wählen eines Zeitfensters, das die Aktivierungszeiten aller Pixel für einen einzelnen AP Ausbreitungs umfasst. Zuordnen jedes Pixel seine Aktivierungszeit als die Zeit der maximalen Aufwärtshub Derivat (dF / dt max, wobei F fluorescen istce Intensität). Unter Verwendung aller Pixelaktivierungszeiten, rekonstruieren die isochronen Aktivierungskarte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel zur gleichen Zeit aktiviert. </li><li> Um die AP Dauer (APD) Verbreitungskarte rekonstruieren, für jedes Pixel die Dauer zwischen der Aktivierungszeit und der Zeit auf einer bestimmten Ebene der Repolarisation berechnen (beispielsweise bei 80% der Repolarisation, APD 80). Mit allen APD Pixelwerte, rekonstruieren die APD Verteilung isochronen Karte. Jedes isochron zeigt somit die Pixel mit der gleichen APD. </li><li> Um die Leitungsgeschwindigkeit für AP Ausbreitung berechnen, passen eine Oberfläche der Vorbereitung auf die Aktivierungszeit-Daten berechnet in 5.4. Verwenden Sie hierzu Polynomfläche Anprobe oder lokale Glättungskerns Oberfläche und dann Geschwindigkeit lokale Leitungsvektoren aus dem Gradienten der angepassten Oberfläche berechnen. </li><li> Um die Repolarisation Karte zu erstellen, so dass jedes Pixel seine Repolarisation Zeit zuweisen, wie das Maximum der zweiten Ableitung definiert (d 2 F / dt2) des optischen Signals am Ende des OAP, oder die Zeit von 90% Repolarisation. </li></ol>

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+%26+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues.</a> Circ Res. 110 (4), 609-623 (2012).</li>
<li>Fedorov, V. V., Glukhov, A. V., Chang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduction+barriers+and+pathways+of+the+sino-atrial+pacemaker+complex%3A+their+role+in+normal+rhythm+and+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Conduction barriers and pathways of the sino-atrial pacemaker complex: their role in normal rhythm and atrial arrhythmias.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2012).</li>
<li>Boyett, M. R., Honjo, H., Kodama, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinoatrial+node%2C+a+heterogeneous+pacemaker+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The sinoatrial node, a heterogeneous pacemaker structure.</a> Cardiovasc Res. 47 (4), 658-687 (2000).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+Node+Reentry+in+a+Canine+Chronic+Left+Ventricular+Infarct+Model%3A+The+Role+of+Intranodal+Fibrosis+and+Heterogeneity+of+Refractoriness%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Arrhythm+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial Node Reentry in a Canine Chronic Left Ventricular Infarct Model: The Role of Intranodal Fibrosis and Heterogeneity of Refractoriness.</a> Circ Arrhythm Electrophysiol. , (2013).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex.</a> Eur Heart J. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>John, R. M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinus+Node+and+Atrial+Arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sinus Node and Atrial Arrhythmias.</a> Circulation. 133 (19), 1892-1900 (2016).</li>
<li>Swaminathan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+CaMKII+causes+cardiac+sinus+node+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidized CaMKII causes cardiac sinus node dysfunction in mice.</a> J Clin Invest. 121 (8), 3277-3288 (2011).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Egom, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+sinoatrial+node+function+and+increased+susceptibility+to+atrial+fibrillation+in+mice+lacking+natriuretic+peptide+receptor+C%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Impaired sinoatrial node function and increased susceptibility to atrial fibrillation in mice lacking natriuretic peptide receptor C.</a> J Physiol. 593 (5), 1127-1146 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> J Vis Exp. (55), e3275(2011).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li>
<li>Swift, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+blebbistatin+for+cardiac+optical+mapping+and+other+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications.</a> Pflugers Arch. 464 (5), 503-512 (2012).</li>
<li>Laughner, J. I., Ng, F. S., Sulkin, M. S., Arthur, R. M., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+and+analysis+of+cardiac+optical+mapping+data+obtained+with+potentiometric+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (7), H753-H765 (2012).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovasc Res. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Krishnaswamy, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+parasympathetic+nervous+system+regulation+of+the+sinoatrial+node+in+Akita+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Altered parasympathetic nervous system regulation of the sinoatrial node in Akita diabetic mice.</a> J Mol Cell Cardiol. 82, 125-135 (2015).</li>
<li>Nygren, A., Lomax, A. E., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+action+potential+durations+in+isolated+mouse+left+and+right+atria+recorded+using+voltage-sensitive+dye+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of action potential durations in isolated mouse left and right atria recorded using voltage-sensitive dye mapping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (6), H2634-H2643 (2004).</li>
<li>Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cardiac+pacemaker+circuits%3A+methodological+puzzles+of+the+sinoatrial+node+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping.</a> Circ Res. 106 (2), 255-271 (2010).</li>
<li>Aschar-Sobbi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+atrial+arrhythmia+susceptibility+induced+by+intense+endurance+exercise+in+mice+requires+TNFalpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFalpha.</a> Nat Commun. 6, 6018(2015).</li>
<li>Hansen, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+driven+by+micro-anatomic+intramural+re-entry+revealed+by+simultaneous+sub-epicardial+and+sub-endocardial+optical+mapping+in+explanted+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts.</a> Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).</li>
<li>Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+heart+rate+in+a+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart.</a> J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).</li>
<li>Kanlop, N., Sakai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+study+of+blebbistatin-induced+chaotic+electrical+activities+in+isolated+rat+atrium+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical mapping study of blebbistatin-induced chaotic electrical activities in isolated rat atrium preparations.</a> J Physiol Sci. 60 (2), 109-117 (2010).</li>
<li>Glukhov, A. V., Flagg, T. P., Fedorov, V. V., Efimov, I. R., Nichols, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+K%28ATP%29+channel+pharmacology+in+intact+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 48 (1), 152-160 (2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Hier präsentierten wir zwei Arten von Maus SAN Vorbereitungen: 1) intakte SAN in der Langendorff-perfundierten ganzen Herzen, und 2) SAN in der isolierten, geöffnet Vorhof Vorbereitung. Diese beiden Arten der Vorbereitung dienen unterschiedlichen experimentellen Zwecken. In der Langendorff perfundierten ganze Herz Herstellung wird das intakte atrial Struktur erhalten , welche es ermöglicht , komplexe atrialen Arrhythmien wie Vorhofflimmern sowie Wechselwirkungen zwischen dem SAN und Atrium während einspringenden Tachyar...

Neuartige wissenschaftliche Durchbrüche, die zu Sprüngen im Verständnis der menschlichen Physiologie führen, gehen oft technologische Fortschritte voraus. Die fluoreszierende optische Kartierung ermöglicht beispielsweise die Untersuchung mehrerer physiologischer Parameter sowohl in Zellen als auch in Geweben. 1,2 Es hat unser Verständnis dafür, wie die anatomische Struktur mit elektrophysiologischen Funktionen und Funktionsstörungen zusammenhängt, erheblich verbessert. Im Herzen bestehen die natürlichen Schrittmacher- und Leitungssysteme wie der Sinusknoten (SAN) und der atrioventrikuläre Übergang aus Knotenmyozyten, die von den umgebenden Vorhofmyozyten isoliert werden. 3-5 Eine solche Organisation schafft komplexe dreidimensionale Strukturen mit speziellen elektrischen Eigenschaften. Sowohl der strukturelle als auch der funktionelle Umbau dieser Schrittmacherstrukturen bilden signifikante elektrophysiologische Heterogenitäten. 6,7 Das Verständnis des Mechanismus, der zugrunde liegt, wie solche Heterogenitäten zu SAN-Dysfunktionen und atrialer Arrhythmogenese führen, wird der klinischen Behandlung dieser Erkrankungen von großem Nutzen sein. Es erfordert eine Technik, um die Ausbreitung elektrischer Signale auf Gewebeebene zu visualisieren, wie z. B. optisches Mapping. 
Kürzlich haben sich häufende Beweise den Fortschritt der optischen Kartierung in Studien der atrialen Elektrophysiologie und Pathologie bewiesen. 2 Neuartige und rigorose Studien sind jedoch auf die genaue Interpretation der experimentellen Daten angewiesen, deren Gültigkeit und Stabilität auf sorgfältigen Versuchsprotokollen beruhen. Genetisch veränderte Mäuse werden in großem Umfang als Tiermodelle für menschliche Krankheiten wie das Sick-Sinus-Syndrom, Herzschrittmacheranomalien und Vorhofarrhythmien verwendet. 6,8-11 Somit bietet eine Kombination aus fluoreszierender optischer Kartierung mit transgenen Mausmodellen ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung kardialer elektrischer Anomalien, die mit verschiedenen Pathologien verbunden sind. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für die hochauflösende optische Kartierung des Maus-SAN und des Atriums vor. Konkret diskutieren und vergleichen wir verschiedene Farbladeansätze, Zeiteffekte auf das Farbbleichen und die Herzfrequenzstabilität während des Experiments.

<table><tbody><tr><td>Wassermantel</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Gewebebad für die Isolierung großer Organe oder Einzelzellen Verfahren</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad / Zirkulator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>Druckverstärker</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Druckmessumformer</td><td>AD Instrumente</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins aus Edelstahl - 0,1 mm Durchmesser</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionspumpe</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Superfusionspumpe</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tübingen Schere&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Zange</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Kelly hämostatische Zange</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Iris Zange</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris Schere</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>EKG 12 mm Nadelelektroden (29 Gauge) (monopolar)&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Luer-Injektionsanschluss</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS-Kamera</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Halogenlampe</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher</td><td>Scientific S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

hochauflösende optische abbildung der maus sinuatrialer knoten

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) Dysfunktionen und damit verbundene Komplikationen stellen wichtige Ursachen für Morbidität bei Patienten mit Herzerkrankungen dar. Die Entwicklung neuartiger pharmakologischer Therapien zur Heilung dieser Patienten beruht auf einem gründlichen Verständnis sowohl der normalen Physiologie als auch der Pathophysiologie des SAN. Unter den Studien zur Herzschrittmacher wird das Maus-SAN häufig verwendet, da es für Modifikationen in der Expression verschiedener Gene geeignet ist, die für SAN-Ionenkanäle oder Kalzium-verarbeitende Proteine kodieren. Neue Erkenntnisse aus elektrophysiologischen und histologischen Studien haben auch die Repräsentativität und Ähnlichkeit der SAN-Struktur und -Funktionen der Maus mit größeren Säugetieren bewiesen, einschließlich des Vorhandenseins spezialisierter Leitungswege vom SAN zum Vorhof und einer komplexen Herzschrittmacherhierarchie innerhalb des SAN. In jüngster Zeit hat die Technik des optischen Mappings die Erforschung und Untersuchung des Ursprungs von Anregung und Leitung innerhalb und aus dem Maus-SAN erheblich erleichtert, was wiederum das Verständnis des SAN erweitert und der klinischen Behandlung von Krankheiten, die mit SAN-Dysfunktion verbunden sind, zugute gekommen ist. In diesem Manuskript haben wir ausführlich beschrieben, wie das optische Mapping des Maus-SAN aus dem intakten, Langendorff-perfundierten Herzen und aus der isolierten atrialen Präparation durchgeführt wird. Dieses Protokoll ist ein nützliches Werkzeug, um das Verständnis der SAN-Physiologie und Pathophysiologie von Mäusen zu verbessern.

Optische Kartierung des Intact SAN aus dem Langendorff-Herz perfundiert Ein typisches Beispiel für eine RA Aktivierungskonturkarte für spontane Sinusrhythmus rekonstruiert wird in Figur 3 für eine Langendorff perfundierten Herzen der Maus gezeigt. Die frühe Aktivierungspunkt innerhalb des intercaval Region in der Nähe des SVC befindet , wo die SAN ist anatomisch definiert. 3,16 Zwei RA Aktivierung Umrißkarten bei 1,0 und 0,5 ms Abtastra...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die optische Abbildung der elektrischen Aktivität aus dem rechten Vorhof Maus und vor allem die sinuatrialer Knoten, mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Protokolls besteht darin, die optische Abbildung des Sinusknotens der Maus an einem intakten, langendorff-perfudierten Herzen oder an einer isolierten Vorhofpräparation durchzuführen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Elektro- und Pathophysiologie des Sinusknotens bezüglich der Mechanismen von Schrittmacherstörungen, des kranken Sinusknotensyndroms und verschiedener mit Vorhofarrhythmien assoziierter Erkrankungen zu beantworten. Der wesentliche Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Untersuchung mehrerer Parameter in intaktem Gewebe mit sehr hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht.Nachdem die angemessene Anästhesietiefe durch Zehenquetschen bestätigt wurde, verwenden Sie gebogene 5,5-Zoll-Mayo-Scheren und 5,5-Zoll-Kelly-Hämostatik-Forceps, um einen ein Zentimeter langen Schnitt an der Vorderseite des Thorax durchzuführen. Greifen Sie mithilfe vier Zoll langer gebogener Iris-Forceps das Lungengewebe rasch an und schneiden Sie mit vier Drittel Zoll langen Iris-Scheren Lunge, Thymus und Herz gemeinsam mit dem Perikard aus. Spülen Sie das Gewebe in mit Sauerstoff angereicherter modifizierter Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius.Verwenden Sie dann gebogene drei Zoll lange Vannas-Tubingen-Scheren und 4,3 Zoll lange Nr.-5-Debaki-Zangen, um die Lunge, den Thymus und das Fettgewebe vom Herzen zu entfernen. Anschließend katheterisieren Sie die Aorta mit einer speziell angefertigten 21-Gauge-Kanüle und zwei gebogenen 4,3 Zoll langen Nr.-5-B-Debaki-Zangen und perfundieren sowie überströmen das Herz gleichzeitig mit Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius, wobei die Lösung vor der Perfusion durch einen inline 11-Mikron-Nylonfilter geleitet wird, um ein Verstopfen der Koronarzirkulation zu verhindern. Danach schließen Sie einen Druckmesswandler über einen Dreiweg-Hahn an eine Luer-Lock-Verbindung der Perfusionsleitung an, um den aortalen Druck zu überwachen, und passen die Perfusionsgeschwindigkeit nach Bedarf an, um den aortalen Druck zwischen 60 und 80 Millimeter Quecksilbersäule zu halten.Positionieren Sie das Organ für die optische Abbildung des Sinusknotens aus einem Langendorff-perfudierten Herzen horizontal mit der hinteren Seite nach oben in einer Glasorgankammer und verwenden Sie 0,1 Millimeter dicke Stifte, um die Ventrikelspitze am silikonbeschichteten Boden der Kammer zu befestigen, um bewegungsinduzierte Bewegungen während des Experiments zu verhindern. Führen Sie einen kleinen Silikonschlauch über die Lungenvene, die linke Vorhöfe und die Mitralklappe in den linken Ventrikel ein und verwenden Sie eine 40er Seidennaht, um den Schlauch am umgebenden Bindegewebe zu fixieren. Verwenden Sie anschließend eine weitere 40er Seidennaht, um die obere und untere Hohlvene zu umfassen, und befestigen Sie den Rand des rechten Vorhofohrs am Boden der Kammer. Dehnen Sie das andere Ende der Naht und befestigen Sie es am Boden der Kammer. Platzieren Sie eine speziell angefertigte Stimulations-Elektrode am Rand des rechten Atrium-Anhängsels. Danach platzieren Sie zwei 12-Millimeter-Nadelelektroden für das Elektrokardiogramm in monopolarer Anordnung nahe der Basis des rechten und linken Ventrikels und positionieren Sie die Erdungselektrode des Elektrokardiogramms in der Nähe der Ventrikelspitze. Um das Gewebe anzufärben, injizieren Sie den verdünnten Farbstoff über einen Inline-Perfusionshafen der Koronarperfusionsleitung, wobei die Applikation über einen Zeitraum von fünf bis sieben Minuten erfolgt.Nach 20 Minuten Stabilisierung 0,5 Milliliter 37 Grad Celsius warmes Blebbistatin in das Perfusat geben, gefolgt von der Injektion von 0,1 Milliliter Blebbistatin, verdünnt in 1 Milliliter 37 Grad Celsius warmer Tyrode-Lösung, über einen Zeitraum von weiteren fünf bis sieben Minuten in die koronare Perfusionsleitung mittels eines integrierten Luer-Lock-Injektionshakens. Blebbistatin sollte mit Vorsicht verwendet werden. Um eine Ausfällung des Inhibitors zu vermeiden, sollte Blebbistatin zunächst in ein auf klare 37 Grad erwärmtes Medium gelöst und das Gemisch kräftig gerührt werden.Um die Probe optisch abzubilden, befestigen Sie zunächst ein kleines Abdeckglas auf der Oberfläche der Lösung über dem Gewebe, um Bewegungsartefakte durch die vibrierende Lösung zu minimieren. Leiten Sie dann mithilfe eines flexiblen, geteilten Lichtwellenleiters, bei dem das Anregungslicht von einer konstantstromgespeisten, geräuscharmen Halogenlampe bereitgestellt wird, den gefilterten Lichtstrahl auf das Gewebe und nehmen Sie das resultierende fluoreszierende Signal auf. Nachdem das Herz wie zuvor gezeigt kaniert wurde, dissezieren Sie die Ventrikel von der vorderen Seite ab und öffnen Sie den rechten Vorhof entlang der Achse des Tricuspidalklappens und der oberen Hohlvene durch die Tricuspidalklappe hindurch, gefolgt von einem Schnitt durch das mediale Bein der Crista terminalis.Um die vordere freie Vorhofwand zu öffnen, führen Sie einen Schnitt von der Mittellinie des medialen Astschnitts bis zur Kante der rechten unteren Ecke des rechten Ohrenanhangs durch und fixieren Sie die flach ausgebreitete freie Vorhofwand am Boden einer silikonbeschichteten Kammer. Um den linken Ohrenanhang zu öffnen, schneiden Sie entlang der oberen Ecke des Mitralklappenklappensegels durch die Mitralklappe. Danach fixieren Sie den geöffneten linken Vorhof, wie zuvor beim rechten Vorhof durchgeführt.Entfernen Sie dann das Ventrikulargewebe teilweise. Bewahren Sie einen Saum des Ventrikulargewebes zum Fixieren der Präparation auf, um Schäden an den Vorhöfen zu vermeiden, und heften Sie das Gewebe an den Boden einer mit Sylgard beschichteten Kammer. Heben Sie nun die endgültige Präparation etwa 0,5 Millimeter vom Boden der silikonbeschichteten Kammer an, um eine Überströmung sowohl der epikardialen als auch der endokardialen Oberfläche zu ermöglichen, und überströmen Sie die Probe mit Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius.Danach eine selbstgefertigte Silberchlorid-Reizelektrode an den Rand des präparierten rechten Atriumohrs legen. Eine monopolare Elektrokardiogramm-Nadelelektrode mit 12 Millimeter Durchmesser in der Nähe jedes der rechten und linken Atriumohren platzieren und die Erdungselektrode des Elektrokardiogramms in der Nähe der Atrioventrikulargrenze anbringen. Um das Herzgewebe anzufärben, mit einer 1-Milliliter-Pipette spannungsabhängiges Farbstoffmittel, das in Tyrode-Lösung mit 37 Grad Celsius verdünnt wurde, langsam direkt auf das Gewebe geben.Danach fixieren Sie die Probe durch direkte Applikation von verdünntem Blebbistatin auf das Gewebe, gefolgt von der Gabe eines weiteren 0,5 Milliliter Blebbistatin über das Perfusat, und führen die optische Abbildung der Probe wie zuvor gezeigt durch. Die Schritte der Gewebefärbung und der Blebbistatin-Inhibition sind entscheidend und erfordern eine genaue Durchführung sowie ein präzises Färbeprotokoll, um sicherzustellen, dass die physiologischen Parameter des Vorhofs – einschließlich Herzfrequenz, Lokalisation des führenden Schrittmachers und Vorhofleitung – nicht beeinflusst werden. Hier ist eine typische Aktivierungskonturkarte des rechten Vorhofs dargestellt, rekonstruiert für spontanen Sinusrhythmus an einem Langendorff-perfudierten Mausherzen, zusammen mit zwei entsprechenden Konturkarten des rechten Vorhofs, die mit Abtastraten von 1 und 0,5 Millisekunden aufgezeichnet wurden.Der frühe Aktivierungspunkt befindet sich im interkavalen Bereich in der Nähe der Vena cava superior, wo der Sinusknoten anatomisch definiert ist. In diesem Experiment wurde nach einer mindestens eine Minute andauernden Stimulation des rechten Atrium-Anhängs mit 10 bis 12 Hertz die elektrische Stimulation gestoppt und die Sinusknoten-Rekoverzeit als Zeitintervall zwischen dem letzten erfassten Aktionspotential und dem ersten spontanen Aktionspotential berechnet. Die Aktivierung des isolierten atrialen Präparats während des spontanen Sinusrhythmus ermöglicht die genaue Identifizierung des führenden Schrittmacherbereichs.Wenn die chirurgischen Eingriffe und die Färbemethoden korrekt durchgeführt werden, sollten keine signifikanten Veränderungen in den physiologischen Eigenschaften des Vorhofs beobachtet werden. Obwohl die arterielle Färbung möglicherweise eine größere Menge an Farbstoff erfordern kann, erscheint das fluoreszierende Signal im Gewebe des Sinusknotens bei dieser Lademethode stabiler, wobei die Zerfallszeit der Signalintensität nach Koronarfärbung fast doppelt so lang ist wie nach Oberflächenfärbung. Ist die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in 30 bis 40 Minuten abgeschlossen werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Vorhofanatomie vor dem Durchtrennen zu lokalisieren, um das Vorhofgewebe und den Sinusknoten nicht zu beschädigen. Nach diesem Verfahren können weitere Untersuchungen wie konventionelle Aufzeichnungen mit gläsernen Mikroelektroden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der kommutativen transmembranen Potentialcharakteristika zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der Intelligenzphysiologie, um Vorhofarrhythmien einschließlich einer Sinusknotenfunktionsstörung im Herzen zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine optische Abbildung mit hoher Auflösung einer Maus-Sinusknopf-Präparation durchführt.

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung der Methodik und Ergebnisse der gleichzeitigen endokardiale und epikardialen optische Abbildung der elektrischen Erregung in der intakten linken Vorhof eines Langendorff-perfundierten Schafe Herzen während stretch-induzierten Vorhofflimmern.

High-Resolution Endocardial und Epikardiale Optical Mapping in ein Schaf Modell Stretch-Induced Vorhofflimmern

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Verfahren für die Durchführung optische Mapping-Experimente in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herzen mit dem Panorama-Imaging-System und der Dual-(Spannungs-und Kalzium) Bildgebungsverfahren.

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Isolierung von Sinusknoten oder SAN aus dem Mausherz. Das SAN beherbergt die Sinuszellen, die den Herzschlag initiieren, indem sie spontane Aktionspotentiale erzeugen.

Isolierung von Sinusknoten aus Mausmodell: Ein Verfahren zur Gewinnung von SA-Knoten aus dem Mausherz

Dieses Protokoll beschreibt die elektrophysiologische Bewertung der murinen Atrien mit Hilfe einer optischen Mapping-Systems mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, darunter zweite Aufnahmen der Membran Spannung und Ca2 + vorübergehend unter programmiert Stimulation durch eine spezielle Elektroden-Katheter.

Elektrophysiologische Bewertung der murinen Atria mit hochauflösenden optischen Mapping

Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) in murinen Herzen.

Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Erfahren Sie die optische Abbildung des sinuatrialen Knotens der Maus mit Langendorff-perfundiertem Herzen. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Untersuchungen von Schrittmacherfunktionen und Arrhythmien.

Hochauflösende optische Abbildung der Maus sinuatrialer Knoten

Weitere Videos entdecken