Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die multiple Genexpression in einzelnen Zellen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, wie z. B. die Heterogenität molekularer Signaturen innerhalb einer Zellpopulation oder eine seltene molekulare Signatur. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass spezifische molekulare Signaturen mit mindestens 48 verschiedenen Genen in vielen Zellen gleichzeitig erfasst werden können.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Voramplifikationsmischung für 48 Reaktionen in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vorbereiten. Geben Sie 240 Mikroliter spezifischen Retrotranskriptionspuffer, 62,4 Mikroliter Puffer mit niedrigem EDTA-TE-Gehalt und 9,6 Mikroliter Taq-DNA-Polymerase in das Röhrchen. Verteilen Sie mit einer elektronischen Pipette 6,5 Mikroliter der Voramplifikationsmischung auf jede der 48 Vertiefungen in einer 96-Well-Einzelzellplatte.

Bereiten Sie anschließend eine 0,2-fache Assay-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen vor. Geben Sie 1,4 Mikroliter jeder Grundierung in die Tube. Stellen Sie das Endvolumen auf 140 Mikroliter mit niedrigem EDTA TE-Puffer ein.

Verteilen Sie mit einer elektronischen Pipette 2,5 Mikroliter der 0,2-fachen Assay-Mischung auf die 48 Wells in der 96-Well-Einzelzell-Sortierplatte, die die Voramplifikationsmischung enthält. Versiegeln Sie die Platte mit einer Abdeckfolie. Wirbeln Sie die Platte und drehen Sie sie eine Minute lang mit dem 280-fachen g.

Einzelne hepatische angeborene lymphatische Zellen (ILCs) werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung sortiert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine leere 96-Well-Platte als Test verwenden. Positionieren Sie die Testplatte auf dem Plattenhalter, wobei die a Vertiefung nach links und in Richtung des Experimentators zeigt.

Stellen Sie den Plattenhalter so ein, dass er mit Verifizierungsperlen einen Tropfen in der Mitte der Vertiefung erhält. Wenn sie richtig eingestellt ist, legen Sie die 96-Well-Einzelzell-Sortierplatte mit der Assay-Mischung und der Voramplifikation auf den Plattenhalter. Zeichnen Sie das Plattenlayout, und sortieren Sie eine Zelle pro Vertiefung der abgegrenzten Population.

Die richtige Positionierung jeder Zelle auf der 96-Well-Einzelzell-Sortierplatte ist von entscheidender Bedeutung, und ein Plattenlayout sollte in einer Tabellenkalkulationssoftware beibehalten werden. Lassen Sie eine Vertiefung mit 0,2x Assay-Mix und Pre-Amplifikations-Mix ohne Zellen, als No-Input-Kontrolle. Lassen Sie optional zwei Reihen mit je sechs Wells für die cDNA-Verdünnung als Kontrolle für die Primereffizienz.

Unmittelbar nach der Einzelzellensortierung die 96-Well-Einzelzellsortierplatte vortexen und nach unten drehen. Legen Sie die Platte in den Thermocycler. Führen Sie die reverse Transkription und Präamplifikation wie angegeben durch.

Eine Voramplifikation spezifischer Zielgene auf sortierten Einzelzellen ist erforderlich, um genügend Material zu haben. Verdünnen Sie die voramplifizierten Proben, indem Sie 36 Mikroliter Puffer mit niedrigem EDTA-TE-Gehalt in jede Vertiefung geben. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie 191 Mikroliter eines Mastermixes vor, indem Sie 175 Mikroliter eines qPCR-Mastermixes und 17,5 Mikroliter des Probenladereagenzes in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pipettieren.

Verteilen Sie auf einer neuen 96-Well-Platte 3,6 Mikroliter des Master Mix auf jede der 48 Wells. Dies ist die 96-Well-Probenplatte. Übertragen Sie 2,9 Mikroliter voramplifizierter cDNA von der 96-Well-Einzelzellsortierplatte auf die neue 96-Well-Probenplatte, wobei für jede Probe zwischen den beiden Platten die gleiche Position beibehalten wird.

Bereiten Sie eine 96-Well-Assay-Platte vor, indem Sie drei Mikroliter Assay-Ladereagenz auf jede der 48 Vertiefungen auf einer neuen 96-Well-Platte verteilen. Geben Sie drei Mikroliter Primer in jede Vertiefung. Die richtige Positionierung jedes Primers in der 96-Well-Assay-Platte ist von entscheidender Bedeutung.

Behalten Sie ein Plattenlayout in einer Tabellenkalkulationssoftware bei. Um diesen Vorgang zu starten, platzieren Sie den integrierten mikrofluidischen Schaltkreis (IFC) auf dem Tisch und überprüfen Sie die Ventile mit einer Spritze. Entfernen Sie die Kappe der Spritze, setzen Sie sie senkrecht zu einem Ventil auf und drücken Sie sie fest.

Der O-Ring sollte sich bewegen. Füllen Sie den Chip mit Flüssigkeit aus der Steuerleitung. Nachdem Sie die vorherigen Schritte mit dem zweiten Ventil wiederholt haben, entfernen Sie die schwarze Folie von der Unterseite des Chips.

Laden Sie den Chip in den IFC-Controller. Wählen Sie auf dem Bildschirm des IFC-Controllers die Option "Prime" und dann "Ausführen" aus. Werfen Sie anschließend den Chip aus und versiegeln Sie die schwarze Folie auf der Unterseite des Chips wieder.

Übertragen Sie mit einer Achtkanalpipette fünf Mikroliter von der 96-Well-Assay-Platte auf die linke Seite des Chips. Ändern Sie die Spitzen für jede Vertiefung des Chips. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, und wenn Blasen auftreten, verwenden Sie 10-Mikroliter-Spitzen, um sie zu entfernen.

Füllen Sie die linke Seite des Chips wie angegeben aus. Füllen Sie auf die gleiche Weise die rechte Seite des Chips mit fünf Mikrolitern aus der 96-Well-Probenplatte. Für den Erfolg dieses Experiments ist es unerlässlich, dass der IFC-Chip ordnungsgemäß gefüllt ist, damit er ordnungsgemäß in den IFC-Controller geladen werden kann.

Entfernen Sie die blaue Folie von der Unterseite des Chips und legen Sie den Chip in den IFC-Controller ein. Wählen Sie auf dem Bildschirm des IFC-Controllers die Option Load Mix und dann Run (Ausführen) aus. Wenn Sie fertig sind, werfen Sie den Chip aus und versiegeln Sie die blaue Folie auf der Unterseite des Chips wieder.

Um den Chip auszuführen, wählen Sie zunächst die Datenerfassungssoftware auf dem mikrofluidischen qPCR-Computer aus. Wählen Sie nach dem Start Neue Ausführung aus. Wählen Sie Auswerfen und laden Sie den Chip.

Nachdem Sie die Software wie im Textprotokoll beschrieben eingerichtet haben, wählen Sie Ausführung starten. Die Reaktion dauert ca. 90 Minuten. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, öffnen Sie die Echtzeit-PCR-Analysesoftware, wählen Sie eine Datei aus, öffnen Sie den Experimentordner und wählen Sie den Chip-Laufpunkt in einer Datei.

Klicken Sie auf Analyseansicht, Ergebnistabelle und Heatmap-Ansicht. Felder, die mit einem x markiert sind, liegen unterhalb des Schwellenwert-Nachweispegels und/oder weisen fehlerhafte Verstärkungskurven auf. Benennen Sie die Beispiele.

Gehen Sie zum Beispiel-Setup und wählen Sie das neue SBS 96 aus. Klicken Sie auf Mapping und wählen Sie das Probenlayout entsprechend dem Layout der 96-Well-Probenplatte aus. Kopieren Sie das Beispiel-Layout-Design aus der Tabellenkalkulationssoftware und fügen Sie es ein.

Definieren Sie das eingefügte Layout als Beispielname. Gehen Sie auf die gleiche Weise vor, um die Assays zu benennen. Geben Sie die Primernamen in der Detektoreinrichtung ein und definieren Sie das eingefügte Layout als Detektorname.

Klicken Sie auf Analyseansicht und Analysieren. Wählen Sie Datei aus, exportieren Sie sie und speichern Sie sie als Heatmap-Ergebnisse. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden hepatische ILC-Populationen auf der Grundlage von weit exprimierten ILC-Markern sortiert und drei verschiedene Populationen definiert.

Ein ordnungsgemäß bestückter Einzelzell-Multiplex-Genexpressionschip sollte mit geraden Linien und Reihen erscheinen, wobei jede Reaktionskammer gefüllt und in der gleichen Dimension sein sollte. Ein falsch beladener Chip hat leere Linien und Reihen von Reaktionskammern sowie Biegelinien. Diese Fluoreszein-Amidit-Zahl eines richtig beladenen Chips zeigt Unterschiede in der Reaktionskammerhelligkeit, die nach einigen Zyklen auftreten.

Reaktionskammern mit einem Verstärkungssignal erscheinen heller als Reaktionskammern ohne oder mit geringen Verstärkungssignalen. Nach korrekter Zellsortierung, Präamplifikation und Beladung erschien die ILC-Population heterogen in Bezug auf die Genexpression in der Leber adulter Wildtyp-Mäuse. Auf der linken Seite befindet sich eine Heatmap ohne Änderungen.

Auf der rechten Seite befindet sich die modifizierte Heatmap, die nach der Definition der Probe und des Assay-Namens erhalten wurde. Mit Hilfe von Online-Software wurden zellspezifische Genexpressionssignaturen und Zellpopulationsbeziehungen identifiziert. Jede Zeile steht für ein Gen, und jede Zeile steht für dieselbe Zelle, und die drei Zellpopulationen werden in Blau, Rot und Grün dargestellt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in neun Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Ausrichtung der Platte für die Zell- und Primerverteilungen sorgfältig zu verfolgen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, seltene und spezifische molekulare Signaturen in Zellpopulationen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Mehrfachgenexpression in vielen einzelnen Zellen gleichzeitig beurteilen können, nachdem die Zellen richtig sortiert, vorampliziert und geladen wurden.