Name: Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mRNA-Expression in einzelnen Zellen mittels FACS und qPCR mit internen Standards quantifizieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von bis zu 96 Genen pro Zelle.

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Wir möchten, dass bei der Durchführung der Zellsortierung bei der Entwicklung dieses Protokolls V. Kapoor in der CCR ETIB Flow Cytometry Kern für ihre Hilfe zu danken. Wir danken auch M. Raffeld und die CCR LP Molecular Diagnostics Unit und J. Zhu und die NHLBI DNA-Sequenzierung und Genomics Core-für ihre Hilfe in der qPCR bei der Entwicklung dieses Protokolls durchgeführt wird. Diese Forschung wurde von der Intramural Programm des NIH unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben zur Isolierung von einzelnen Säugerzellen aus einer Population von anhaftenden Zellen in der Kultur und zur Untersuchung der Expression von etwa 96 Gene in jeder Zelle gezüchtet ein Verfahren dargestellt. Gute rechtzeitige Vorbereitung ist entscheidend für diese Methode gut zu funktionieren. Insbesondere Entwerfen und Testen Primerpaare spezifisch für die Transkripte von Interesse (Schritte 1,2-1,3) sind zeitaufwendig, aber wichtige Schritte, wie die Primer, die Qualität der Einzelzellmessungen bestimmen. Soba...

Einzelne Zellen in einer Population kann zu einem einheitlichen physiologischen Reiz 1, 2, 3, 4 sehr unterschiedliche Reaktionen zeigen. Die genetische Veränderung der Zellen in einer Population eines Mechanismus für diese Vielzahl von Antworten, aber es gibt auch einige nicht-genetischen Faktoren, die die Variabilität von Antworten erhöhen können, selbst in einer klonalen Population von Zellen. Zum Beispiel können die Ebenen der einzelnen Proteine ​​und andere wichtige Signalmoleküle variieren auf einer Zelle-für-Zelle-Basis, was zu geben Variation in nachgeschalteten Genexpressionsprofilen. Zusätzlich können kurzzeitige Bursts von Transkripten 5 treten Genaktivierung in 6, der 7 auf eine relativ kleine Anzahl von Transkripten pro Burst begrenzt sein kann, 8, 9. Eine solchestochasticity in Genaktivierung kann stark von Schwankungen der biologischen Reaktionen beitragen und einen selektiven Vorteil in Mikroorganismen 10 und in Säugetierzellen 1, 2 reagiert auf einen physiologischen Reiz bieten kann. Aufgrund beiden genetischen und nicht-genetischen Variationsquellen kann das Genexpressionsprofil eines beliebigen gegebenen Zelle in Reaktion auf einen Reiz deutlich vom Durchschnitt Genexpressionsprofil unterscheiden sich von der Messung der Massenantwort erhalten. Das Ausmaß, in dem einzelne Zellen Variabilität in Reaktion auf einen Reiz zeigen, erfordert Techniken zur Isolierung von einzelnen Zellen, die Messung der Expressionsspiegel für Transkripte von Interesse, und die Computeranalyse der resultierenden Expressionsdaten. Es gibt mehrere Ansätze zur Untersuchung der Genexpression in einzelnen Zellen, eine breite Palette von Kosten abdeckt, die Anzahl der Transkripte sondiert, undGenauigkeit der Quantifizierung. So bietet zum Beispiel Single-Cell-RNA-Seq eine große Tiefe transcript Abdeckung und der Möglichkeit, Tausende von verschiedenen Transkripte für den am höchsten exprimierten Gene in einzelnen Zellen zu quantifizieren; jedoch verbunden sind die Kosten, die mit solchen Sequenzierungstiefe kann unerschwinglich sein, auch wenn die Kosten weiter sinken. Im Gegensatz dazu bietet Einzelmolekül RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH smRNA) genaue Quantifizierung von Transkripten für sogar Low-Expression von Genen zu vernünftigen Kosten pro Gen von Interesse; jedoch nur eine geringe Anzahl von Zielgenen können durch diese Vorgehensweise in einer gegebenen Zelle untersucht werden. Quantitative PCR-basierten Assays, in diesem Protokoll beschrieben, einen Mittelweg zwischen diesen Techniken bereitzustellen. Diese Assays verwenden eine mikrofluidische Echtzeit-PCR-Maschine zu einem Zeitpunkt, zu 96 Transkripte von Interesse zu quantifizieren bis in bis zu 96 Zellen. Während jedes der vorgenannten Verfahren erforderliche Hardwarekosten hat, sind die Kosten eines einzelnen qPCR Assay relativniedrig. Dieses Protokoll wird von einem durch den Hersteller eines mikrofluidischen Echtzeit-PCR-Maschine (Protokoll ADP 41, Fluidigm) vorgeschlagen angepasst. Um die Abschätzung der absoluten Nummer jedes Transkript in einem PCR-basierten Ansatz zu ermöglichen, haben wir das Protokoll erweitert, um die Verwendung von internen Kontrollen vorbereiteter Zielgen Amplikons machen, die über mehrere Experimente verwendet werden kann. Als ein Beispiel für diese Technik ist 11 beschrieben die Quantifizierung der Expression von Genen durch den Tumorsuppressor p53 in menschlichen MCF-7 - Brustkarzinomzellen reguliert. Die Zellen werden mit einem chemischen Mittel in Frage gestellt, die DNA-Doppelstrangbrüche induziert. Frühere Studien haben gezeigt , dass die p53 - Antwort auf DNA - Doppelstrangbrüchen eine große Heterogenität in einzelnen Zellen aufweist, sowohl in Bezug auf p53 Ebenen 12 und bei der Aktivierung verschiedener Zielgene 11. Darüber hinaus reguliert p53 die Expression von mehr als 100gut charakterisierten Zielgene in zahlreichen Downstream Wegen beteiligt, einschließlich Zellzyklusarrest, Apoptose und Seneszenz 13, 14. Da die p53-vermittelte Reaktion in jeder Zelle sowohl komplex und variabel ist, kann die Analyse des Systems profitiert von einem Ansatz, bei dem nahezu 100 Zielgene gleichzeitig in einzelnen Zellen werden untersucht, wie das unten beschrieben wird. Mit leichten Modifikationen (wie alternative Verfahren zur Einzelzellisolierung und Lyse), kann das Protokoll leicht ein breites Spektrum von Säugerzelltypen, Protokolle und zelluläre Antworten zu untersuchen angepasst werden. Mit der richtigen rechtzeitige Vorbereitung kann eine Runde der Zellsortierung und Genexpressionsmessung durchgeführt werden, gemäß diesem Protokoll über einen Zeitraum von drei Tagen. Das folgende Zeit wird vorgeschlagen: im Voraus, die Transkripte von Interesse auswählen, zu identifizieren und die Primerpaare zu validieren, die die cDNA von jenen transcr verstärkenIPTS und bereite die Standards und Zündmittelmischungen diese Primer verwendet. Am Tag 1 nach Zellbehandlung, Ernte und sortieren Sie die Zellen, führen die reverse Transkription und spezifische Ziel-Amplifikation und Behandlung der Proben mit einer Exonuklease unincorporated Primer zu entfernen. Am Tag 2, führen an der sortierten Zellen Qualitätskontrolle mit qPCR. Schließlich, am Tag 3, messen die Genexpression in den sortierten Zellen mikrofluidischen qPCR verwendet wird. In Abbildung 1 sind die Schritte beteiligt.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität und RNase-Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Hochempfindliches dsDNA-Assay-Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33120&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Suspensionspuffer</td><td>Teknova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 0,2 ml Maxymum Recovery Dünnwandige PCR-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>GE 96.96 Dynamic Array DNA-Bindungsfarbstoff-Probe & Assay Loading Reagenzien-Kit</td><td>Fluidigm</td><td>100-3415</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Medien</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert (US)</td><td>ThermoFisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotische Lösung</td><td>Corning</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Neocarzinostatin</td><td>Sigma</td><td>N9162</td><td></td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Decon Labs</td><td>1101</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect QRT-PCR-Kit in einem Schritt</td><td>ThermoFisher</td><td>11753500</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DNA</td><td>Affymetrix</td><td>14380 10 MG</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal-Versiegelungsfolie, steril</td><td>Excel Scientific</td><td>STR-THER-PLT</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria IIu</td><td>BD Biowissenschaften</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0,05 %</td><td>GE Gesundheitswesen Biowissenschaften</td><td>SH30236,01</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & Mikro; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Exonuklease I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix mit niedrigem ROX</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5210</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC für die Genexpression (mikrofluidischer qPCR-Chip)</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td></td></tr><tr><td>IFC Controller HX (Lademaschine)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioMark oder BioMark HD (mikrofluidisches qPCR-Gerät)</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-Analysesoftware&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Software</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzellige genexpressionsprofile mittels facs und qpcr mit internen standards

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Genexpressionsmessungen von Massenpopulationen von Zellen können die beträchtliche transkriptomische Variation einzelner Zellen innerhalb dieser Populationen verschleiern. Einzelzell-Genexpressionsmessungen können helfen, die Rolle von Rauschen bei der Genexpression zu bewerten, Korrelationen in der Expression von Genpaaren zu identifizieren und Subpopulationen von Zellen aufzudecken, die unterschiedlich auf einen Stimulus reagieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Messung der Expression von bis zu 96 Genen in einzelnen Säugetierzellen, die aus einer in Gewebekultur wachsenden Population isoliert wurden. Die Zellen werden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) in Lysepuffer sortiert, und die interessierenden mRNA-Spezies werden rückwärts transkribiert und amplifiziert. Die Genexpression wird dann mit einem mikrofluidischen Echtzeit-PCR-Gerät gemessen, das bis zu 96 qPCR-Assays an bis zu 96 Proben gleichzeitig durchführt. Wir beschreiben auch die Generierung und Verwendung von PCR-Amplikon-Standards, um die Abschätzung der absoluten Anzahl jedes Transkripts zu ermöglichen. Im Vergleich zu anderen Methoden zur Messung der Genexpression in einzelnen Zellen ermöglicht dieser Ansatz die Quantifizierung von deutlicheren Transkripten als RNA-FISH zu geringeren Kosten als RNA-Seq.

Eine allgemeine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1, mit Schritten zur Zellbehandlung, die Isolierung von einzelnen Zellen durch FACS, die Erzeugung gezeigt und Vorverstärkung von cDNA - Bibliotheken aus single-Zelllysaten, die Bestätigung der Einzelzell - cDNA - Bibliotheken in sortierter Wells, und die Messung der Genexpression durch qPCR. In Vorbereitung auf die Analyse Einzelzellisolierung und ...

Wir beschreiben eine Methode, um einzelne Säugetierzellen zu sortieren und die Expression von bis zu 96 Zielgenen von Interesse in jeder Zelle zu quantifizieren. Diese Methode beinhaltet die Verwendung interner qPCR-Standards, um die Schätzung der absoluten Transkriptzahlen zu ermöglichen.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mengen von mRNA in einzelnen Zellen mithilfe einer Mikrofluidik-qPCR mit internen Standards zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Einzelzellbiologie zu beantworten, beispielsweise, ob Zellpopulationen auf einen Reiz charakteristisch unterschiedlich reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Expression einer größeren Anzahl von Genen messen kann als die RNA-FISH und dabei kostengünstiger ist als die RNA-Seq bei Einzelzellen.Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir Protokolle zur Messung der Genexpression in einzelnen Zellen mittels mikrofluidischer qPCR erforschten. Wir wollten bestehende Methoden so modifizieren, dass die absolute Anzahl verschiedener Transkripte in einzelnen Zellen genauer geschätzt werden kann. Die Demonstration des Zellsortierverfahrens wird William Telford durchführen, der Leiter der Durchflusszytometrie-Einrichtung, die von meinem Labor genutzt wird.Nach der Erzeugung und Reinigung von Amplifikaten aus Genen des Interesses gemäß dem Textprotokoll 18 Mikroliter jedes gereinigten Amplifikats in einem 2,0-Milliliter-Low-Bin

single-cell-gene-expression-profiling-using-facs-qpcr-with-internal

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Genetik

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Verfahren zur Isolierung von einzelnen Zellen der Netzhaut und anschließende Amplifikation der cDNA beschrieben. Einzelzell-Transcriptomics zeigt den Grad der zellulären Heterogenität in einem Gewebe und deckt neuen Markergene für seltene Zellpopulationen. Die beigefügten Protokoll kann eingestellt werden, um viele verschiedene Zelltypen zu entsprechen.

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Einzelzell-Genexpression Test wird für das Verständnis der Stammzell Heterogenitäten benötigt.

Profiling Individuelle humanen embryonalen Stammzellen durch quantitative RT-PCR

Designer-Chromosomen des Synthetic Yeast Genome-Projekts, Sc2.0, können von ihren nativen Gegenstücken mit Hilfe eines PCR-basierten Genotypisierungsassays namens PCRTagging unterschieden werden, der einen Anwesenheits-/Abwesenheitsendpunkt hat. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Echtzeit-PCR-Nachweismethode für die PCRTag-Genotypisierung.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.

Einzellige Gene Expression Mit Multiplex-RT-qPCR zum Charakterisieren Heterogene Rare Lymphatische Populations

Bulk-gen Ausdruck Messungen Wolke Einzelzelle Unterschiede in heterogenen Zellpopulationen. Hier beschreiben wir ein Protokoll wie einzellige gen Expressionsanalyse und Index Sortierung durch die Blüte aktiviert Zelle sortieren (FACS) kann kombiniert werden, um die Heterogenität zu umreißen und immunophenotypisch charakterisieren molekular unterschiedliche Zellpopulationen.

Eine kombinatorische einzellige Ansatz zur molekularen Charakterisierung und Immunophenotypic Heterogenität der menschlichen Stammzellen und Vorläuferzellen Populationen

Diese Methode beschreibt die Schritte zur Verbesserung der Qualität und Quantität der Sequenzdaten, die aus formal in-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) RNA-Proben gewonnen werden können. Wir beschreiben die Methodik zur genaueren Bewertung der Qualität von FFPE-RNA-Proben, bereiten Sequenzierungsbibliotheken vor und analysieren die Daten aus FFPE-RNA-Proben.

Optimierung zur Sequenzierung und Analyse degradierter FFPE-RNA-Proben

Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Erfahren Sie, wie Sie mRNA-Expression in einzelnen Zellen mittels FACS und qPCR mit internen Standards quantifizieren. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von bis zu 96 Genen pro Zelle.

Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

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