Einzellige Genexpressionsprofile mittels FACS und qPCR mit internen Standards

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den mRNA-Gehalt in einzelnen Zellen mittels mikrofluidischer qPCR mit internen Standards zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Einzelzellbiologie zu beantworten, z. B. ob Zellpopulationen von Zellen auf charakteristisch unterschiedliche Weise auf einen Stimulus reagieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Expression von mehr Genen als RNA-FISH zu geringeren Kosten als RNA-Seq in einzelnen Zellen messen kann.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir Protokolle zur Messung der Genexpression in einzelnen Zellen mittels mikrofluidischer qPCR untersuchten. Wir wollten bestehende Methoden modifizieren, um die absolute Anzahl verschiedener Transkripte in einzelnen Zellen genauer zu schätzen. William Telford, der Leiter der Durchflusszytometrie-Einrichtung, die von meinem Labor genutzt wird, wird das Verfahren zur Zellsortierung vorführen.

Nach der Erzeugung und Reinigung von Amplikons aus Genen von Interesse gemäß dem Textprotokoll werden 18 Mikroliter jedes gereinigten Amplikons in einem 2,0-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung kombiniert, dann DNA-Suspensionspuffer bis zu 1.800 Mikroliter hinzugefügt, so dass die Konzentration jedes Amplikons fünfmal 10 bis zum sechsten Molekül pro Mikroliter beträgt. Den 5e6-Standard gründlich durchziehen und in 20-Mikroliter-Aliquoten in PCR-Röhrchen mit geringer Bindung aufteilen. Nach dem Plattieren von MCF7 p53-Venuszellen gemäß dem Textprotokoll fügen Sie den Zellen 400 Nanogramm pro Milliliter Neocarzinostatin hinzu und behandeln Sie sie drei, 8,5, 14 oder 24 Stunden lang.

Um Lysepuffer herzustellen, kombinieren Sie die in dieser Tabelle aufgeführten Reagenzien. 92,4 Mikroliter des Puffers werden in ein separates Röhrchen überführt, das als Lysepuffer für die Amplikonstandards dient. Der verbleibende Lysepuffer ist für die Zellen bestimmt.

Bereiten Sie E.coli-DNA vor und fügen Sie sie dem Lysepuffer für die Zellen hinzu, gemäß dem Textprotokoll. Zur Vorbereitung von Standards beschriften Sie sechs Zentrifugenröhrchen mit geringer Bindung. Geben Sie 90 Mikroliter DNA-Suspensionspuffer in das 5e5-Röhrchen.

Geben Sie 90 Mikroliter Puffer mit 6,2 Pikogramm pro Mikroliter E.coli-DNA zu jedem der anderen fünf Röhrchen und halten Sie alle Röhrchen auf Eis. Nachdem Sie ein Aliquot des 5e6-Standards aus dem Lager genommen haben, wirbeln Sie das Röhrchen kurz ein, drehen Sie es dann, um sicherzustellen, dass sich die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens befindet, und geben Sie dann mit einer Pipettenspitze mit geringer Bindung 10 Mikroliter 5e6-Standard in das 5e5-Röhrchen. Vortexen, drehen und die Röhre wieder auf Eis legen.

Pipettieren Sie als Nächstes 10 Mikroliter aus dem 5e5-Röhrchen in das 5e4-Röhrchen, wirbeln Sie das Röhrchen kurz, drehen Sie es und legen Sie das Röhrchen wieder auf Eis. Wiederholen Sie die seriellen Verdünnungen mit jedem Röhrchen und erhalten Sie 10 Mikroliter aus dem vorherigen Röhrchen, bis alle Röhrchen eine Standardverdünnung haben. Verteilen Sie nach der Vorbereitung der PCR-Röhrchen mit Lysepuffer mit einer 12-Kanal-Pipette neun Mikroliter Zelllysepuffer aus der Reihe der PCR-Röhrchen in jede Vertiefung der ersten sieben Reihen einer PCR-Platte.

Verteilen Sie sieben Mikroliter Standard-Lysepuffer in jede Vertiefung der letzten Reihe der Platte, geben Sie dann mit Pipettenspitzen mit niedriger Bindung zwei Mikroliter Standard in jede Vertiefung der unteren Reihe gemäß der Plattenkarte. Geben Sie zwei Mikroliter mit 3,1 Pikogramm pro Mikroliter E.coli-DNA in die 10-Zell- und 100-Zell-Wells und fügen Sie dann zwei Mikroliter mit 6,2 Pikogramm pro Mikroliter E.coli-DNA in die Vertiefungen ohne Zellen hinzu. Nach der Programmierung des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers zum Sortieren in eine 96-Well-Platte gemäß der Plattenkarte richten Sie die Maschine aus, versiegeln eine leere PCR-Platte und verwenden den Teststrom, um Tröpfchen und PBS auf die Dichtung der leeren Platte zu sortieren.

Wenn die Tröpfchen nicht in der richtigen Position landen, wischen Sie sie von der Oberfläche der Dichtung ab, kalibrieren Sie den Zellensorter gemäß den Anweisungen des Maschinenherstellers neu und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Tröpfchen im Sortierstrom korrekt abgelegt sind. Ernten Sie Zellen durch Trypsinisierung und suspendieren Sie sie in 0,5 Millilitern PBS mit 2 % FBS und übertragen Sie sie dann in ein Durchflusszytometrieröhrchen. Um Zellen zu sortieren, führen Sie das Röhrchen mit der Zellsuspension in den Zellsortierer ein, öffnen Sie das Siegel an der Platte mit dem Lysepuffer und sortieren Sie die interessierenden Zellen gemäß der Plattenkarte vorsichtig in die Platte.

Um sicherzustellen, dass einzelne Zellen mit maximaler Reinheit sortiert werden, betreiben Sie die Maschine im Einzelzellmodus und verwenden Sie ein standardmäßiges Durchflusszytometrie-Gating, das auf Vorwärts- und Seitenstreuung basiert. Verwenden Sie nach dem Lauf eine neue sterile Thermodichtung, um die Platte zu versiegeln, und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 400 mal g für vier Grad Celsius, legen Sie dann die Platte in den Thermocycler und führen Sie das zuvor vorbereitete RT-STA-Programm aus. Nachdem Sie die fertige RT-STA-Platte gedreht haben, verwenden Sie eine 12-Kanal-Pipette, um 3,6 Mikroliter verdünnte Exonuklease I in jede Vertiefung der Platte zu verteilen.

Versiegeln und drehen Sie die Platte kurz, legen Sie die Platte dann in den Thermocycler und führen Sie das exo I-Programm aus. Um die Genexpression im Haushalt in jeder Probe zu messen, bereiten Sie 900 Mikroliter DNA-Bindungsfarbstoff qPCR-Mastermix für 96 Reaktionen mit Primern aus einem der ausgewählten Haushaltsgene vor. Verteilen Sie neun Mikroliter Mastermix in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte und geben Sie dann einen Mikroliter Probe aus der Probenplatte in die entsprechende Vertiefung der PCR-Platte.

Lassen Sie die Platte auf einer Echtzeit-PCR-Maschine unter Verwendung eines vom Mastermix-Hersteller vorgeschlagenen Temperaturwechselprotokolls oder nach einem Standardprotokoll laufen, analysieren Sie dann die Proben und erstellen Sie eine Plattenkarte für Probenmischungen gemäß dem Textprotokoll. Markieren Sie eine Plattenprobenmischung, und verteilen Sie dann mit einer Achtkanalpipette 3,3 Mikroliter Mastermix-Probenbeladungsreagenzmischung in jede Vertiefung einer 96-Well-PCR-Platte. Wirbeln Sie die Platte für jede PCR-Platte mit Proben 10 Sekunden lang und drehen Sie sie 10 Sekunden lang mit dem 500-fachen g.

Entfernen Sie den Deckel und geben Sie 2,7 Mikroliter jeder positiven Einzelzellprobe in die entsprechende Vertiefung auf der Probenmischplatte für die auf der Plattenkarte angegebenen Einzelzellvertiefungen. Ziehen Sie den Aufkleber von der Unterseite eines neuen mikrofluidischen qPCR-Chips ab, drücken Sie dann mit einer Spritze mit Kontrollleitungsflüssigkeit bei noch aufgesetzter Kappe jede Akkumulatorfeder nach unten, um sie zu lösen, und injizieren Sie jeden Akkumulator mit 100 bis 200 Mikrolitern Kontrollleitungsflüssigkeit. Setzen Sie den Chip in die Lademaschine ein und führen Sie das Prime-Skript aus, dann übertragen Sie mit einer Achtkanalpipette 4,5 Mikroliter jeder Assay-Mischung in die linke Seite des mikrofluidischen qPCR-Chips.

Es ist wichtig, die Bildung von Luftblasen am Boden der Vertiefungen zu vermeiden. Dies führt zu Ladeproblemen. Um dies zu verhindern, berühren Sie die Pipettenspitzen an der Seite der Vertiefung und pipettieren Sie dann nur bis zum ersten Anschlag.

Übertragen Sie 4,5 Mikroliter jedes Probenmixes auf die rechte Seite des mikrofluidischen qPCR-Chips, setzen Sie dann den Chip in die Lademaschine ein und führen Sie das Load-Mix-Skript aus. Wenn das Load-Mix-Skript fertig ist, stellen Sie sicher, dass sich keine Linien auf dem Chip befinden, die auf ein Ladeproblem hinweisen würden, und verwenden Sie dann Klebeband, um Staubpartikel vorsichtig vom Chip zu entfernen, setzen Sie dann den Chip in das mikrofluidische Echtzeit-PCR-Gerät ein und führen Sie das Datenerfassungsskript aus. Analysieren Sie abschließend die Daten gemäß dem Textprotokoll.

Diese Abbildung zeigt die Expressionsniveaus eines Housekeeping-Gens, die mittels qPCR gemessen wurden, um zu bestimmen, in welchen Brunnen eine einzelne Zelle aufgenommen wurde. Proben, die eine Zelle erhalten haben, haben niedrige CT-Werte. Proben ohne Zelle haben deutlich höhere CT-Werte.

Die Vertiefungen für den Amplikon-Standard sollten gleichmäßig verteilte Amplifikationskurven aufweisen. Auch in den Kurven für die Vertiefungen ohne Zelle, 10 Zellen und 100 Zellen sollte eine klare Trennung vorhanden sein. Seed-DNA-Proben, die tatsächliche Zellen repräsentieren, werden aus mehreren sortierten 96-Well-Platten ausgewählt und in einer einzigen Platte kombiniert, um sie für die mikrofluidische qPCR vorzubereiten.

Diese Heatmap fasst die Ergebnisse der mikrofluidischen qPCR zusammen. Die Farbvariation in jeder Spalte zeigt die Variabilität in der Expression jedes Gens zwischen verschiedenen Zellen. Die beiden Zeilen, die viel dunkler sind als der Rest, stellen höchstwahrscheinlich fehlerhafte Stichproben dar.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, Ihren Arbeitsbereich RNase- und DNA-frei zu halten, insbesondere bei der Herstellung der Standards und des Lysepuffers. Die Prä-PCR-Teile dieses Protokolls sind empfindlich gegenüber Kontaminationen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Expression mehrerer Gene von Interesse in einzelnen Zellen quantifizieren können.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. Einzelmolekül-RNA-FISH, durchgeführt werden, um Messungen der mRNA-Abundanz in einzelnen Zellen zu validieren.