Identifizierung von Fettsäuren in Bacillus cereus

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Fettsäuren aus Bakterien zu identifizieren und die Position von Methylverzweigungen und Doppelbindungen zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Bakteriologie zu beantworten, wie z. B. die Rolle von Fettsäuren bei der Anpassung von Bakterien an ihre Umwelt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Vermehrung der Fettsäuren erforderlich ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich aufgrund der Bedeutung der Fettsäurezusammensetzung in der bakteriellen Taxonomie auf die bakterielle Identifizierung. Obwohl diese Methode an dem Bakterium Bacillus cereus entwickelt wurde, ist sie auch sehr relevant, um andere Spezies zu untersuchen, die verzweigtkettige Fettsäuren enthalten. Im Allgemeinen hatten wir bei der Entwicklung dieser Methode Schwierigkeiten.

Denn die derzeitige Identifizierungsmethode für Fettsäuren identifiziert keine Methylverzweigungen in Doppelbindungsposition. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie einen Rasen mit den Bakterien vor, indem Sie 100 Mikroliter einer Übernachtkultur des Stammes, die bei 30 Grad Celsius in LB inkubiert wurde, auf die Oberfläche der Platte mit LB-Agar-Medium verteilen. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius.

Um Lipidfettsäuren zu erhalten, ernten Sie Bakterienzellen, indem Sie Kolonien von der Agarplatte abkratzen. Und die Umfüllung von ca. 40 Milligramm in ein Zehn-Milliliter-Glasröhrchen mit Schraubverschluss und PTFE-Dichtung. Um die Umesterung durchzuführen, geben Sie fünf Milliliter 0,2 molare Kaliumhydroxid in Methanol zu den frischen Bakterienzellen.

Vortexen und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie anschließend einen Milliliter einer molaren Asketensäure hinzu, um den pH-Wert auf sieben zu senken. Fügen Sie nun drei Milliliter Hexan hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang vortexen, um die Fettsäuremethylester oder FAMEs zu extrahieren.

Die obere Phase wird in saubere Röhrchen überführt und durch Verdampfen bei Raumtemperatur unter einem kontinuierlichen Stickstoffstrom konzentriert, um etwa 200 Mikroliter FAME-Extrakt zu erhalten. Übertragen Sie dann die Extrakte in GC-Fläschchen mit Einsätzen. Injizieren Sie die Extrakte in ein Gaschromatographie-Massenspektrometrie- oder GC-MS-System, das mit einer Kapillarsäule ausgestattet ist.

Stellen Sie die Temperatur der Einspritzöffnung auf 250 Grad Celsius ein. Halten Sie die Ofentemperatur eine Minute lang auf 50 Grad Celsius. Erhöhen Sie die Temperatur auf 190 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von 20 Grad Celsius pro Minute und erhöhen Sie sie auf eine Endtemperatur von 230 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von zwei Grad Celsius pro Minute.

Für die MS zeichnen Sie die Massenspektren durch Elektronenionisation (EI) bei 70 Elektronenvolt auf und stellen die Erfassung des Gesamtionenstroms zwischen 50 und 400 atomaren Masseneinheiten (AMU) ein. Eine Probe des getrockneten FAME-Extrakts wird in einem Milliliter trockenem Dichlormethan aufgelöst. Fügen Sie dann die Extraktlösung und 0,2 Milliliter 3-Pyridinemethanol zu 0,1 Millilitern eines molaren Kalium-tert-Butoxids in Tetrahydrofuran hinzu.

Erhitzen Sie die Lösung 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius in einem geschlossenen Fläschchen. Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie zwei Milliliter gereinigtes entionisiertes Wasser und vier Milliliter Hexan hinzu. Mischen Sie die Lösung eine Minute lang mit einem Wirbelmischer.

Nachdem Sie die Phasen getrennt haben, sammeln Sie die obere organische Phase. Fügen Sie anschließend wasserfreies Natriumsulfat hinzu, bis die organische Phase klar ist. Übertragen Sie die organische Phase in ein sauberes Rohr und verdampfen Sie dann die organische Phase unter einem Stickstoffstrom, bis ein Volumen von etwa 200 Mikrolitern erreicht ist.

Geben Sie 250 mg 2-Amino-2-methyl-1-propanol in die Probe des getrockneten FAME-Extrakts. Spülen Sie das Rohr mit Stickstoff und verschließen Sie es mit einem Stopfen. Erhitzen Sie dann die Lösung über Nacht auf 190 Grad Celsius.

Nachdem Sie die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt haben, fügen Sie drei Milliliter Dichlormethan und fünf Milliliter gereinigtes deionisiertes Wasser hinzu. Wirbeln Sie die Mischung und lassen Sie die Phasen trennen. Entfernen Sie dann die wässrige Phase.

Waschen Sie anschließend die organische Phase mit fünf Millilitern Wasser. Fügen Sie wasserfreies Natriumsulfat hinzu, bis die organische Phase klar ist. Nachdem Sie die organische Phase in ein neues Reagenzglas überführt haben, verdampfen Sie sie unter einem Stickstoffstrom, bis ein Volumen von etwa 200 Mikrolitern erreicht ist.

Das Massenspektrum des I16-Picololinderivats bestätigt die Methylverzweigung. Die Lücke von 28 AMU zwischen den Ionen an 304 und 332 entspricht Fragmenten, die vor und nach dem verzweigten Kohlenstoff gebildet wurden. Die für DMOX-Derivate charakteristischen diagnostischen Ionen 113 und 126 sind hier dargestellt.

Das Molekülion 307 ist charakteristisch für das 16:1-Isomer, und eine Lücke von 12 AMU zwischen 196 und 208 deutet auf eine Doppelbindung an Kohlenstoff hin. Die Lücke von 12 AMU wird nicht mehr beobachtet, wenn die Doppelbindung vor Kohlenstoff 7 liegt. Das intensive 153-Ion, charakteristisch für eine Doppelbindung an Kohlenstoff-5, und das 307-Molekülion im Massenspektrum des DMOX-Derivats identifizierten diese Verbindung als n16 eins delta fünf.

Das 307-Ion des DMOX-Derivats und das 345-Ion des Picolnal-Derivats weisen auf ein 16:1-Fettsäureisomer hin. Ein Spalt von 28 AMU zeigt die Verzweigungsposition an, und ein Spalt von 12 AMU für DMOX und 26 AMU für Picolinalester kennzeichnet die Doppelbindung. Die in Bacillus cereus identifizierten Fettsäuren und entsprechenden diagnostischen Ionen sind hier aufgeführt.

Die diagnostischen Ionen identifizieren die Methylverzweigungen und Doppelbindungspositionen auf der Kohlenstoffkette für die DMOX- und Picolinalesterderivate. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren kann die Fettsäure durch GC-MS und die Freisetzung der FAME-Derivate quantifiziert werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Bakteriologie, um die bakterielle Vielfalt und die Mechanismen bakterieller Anpassungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Fettsäuren in Bakterien untersucht, einschließlich methylverzweigter und ungesättigter Fettsäuren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten mit einem Laborabzug und das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.