Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

Das übergeordnete Ziel dieses proteomischen Ansatzes ist die Charakterisierung der molekularen Neuorganisation an Synapsen nach Lern- und Gedächtnisbildung, um grundlegende Mechanismen und Signalwege zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in einem hypothesenfreien Vorgehen, das eine umfassende Quantifizierung und Charakterisierung von posttranslationalen Modifikationen innerhalb synaptischer Proteome ermöglicht. Unser etablierter Arbeitsablauf erlaubt eine Korrelation zwischen einer bestimmten molekularen Veränderung und einem spezifischen Verhalten.

Lernen und Gedächtnisbildung beruhen auf Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit, weshalb proteomische Studien stärker auf die Analyse synaptischer Strukturen wie Synaptosomen als auf Homogenate von Hirngewebe ausgerichtet sein sollten. Proteomische Ergebnisse stellen hochkomplexe Datensätze dar und erfordern daher eine bioinformatische Aufbereitung. Beginnen Sie das Training, indem Sie die Testmaus in eine schwach beleuchtete Shuttle-Box innerhalb einer schallisolierten Kammer stellen.

Verwenden Sie einen vollständig computergesteuerten Lernzeitplan für das auditorische Diskriminationslernen. Beginnen Sie mit einer Gewöhnungsphase von drei Minuten Stille, bevor die Trainingssitzung startet. Während der Go-Versuche muss das Tier innerhalb von sechs Sekunden nach Tonpräsentation die Hürde überwinden, um einen Treffer zu erzielen.

Während der No-Go-Versuche muss das Tier während der sechssekündigen Tonpräsentation im aktuellen Fach des Shuttle-Boxsystems verbleiben. Führen Sie 30 Go-Versuche und 30 No-Go-Versuche in einer pseudorandomisierten Reihenfolge durch, mit einem Intertrialintervall von 20 Sekunden, sodass eine Sitzung aus 60 Versuchen besteht und etwa 25 Minuten dauert. Nach Abschluss aller Versuche bringen Sie die trainierte Maus bis zur Tötung in den Heimkäfig zurück.

Nach der Tötung der Maus und Entfernung des Gehirns lokalisieren Sie den auditorischen Kortex unter Verwendung visueller Landmarken, einschließlich Blutgefäße und der Oberflächenform. Anschließend dissezieren Sie mit Skalpell und Nadel beidseitig den auditorischen Kortex als rechteckigen Gewebeklotz. Unter Verwendung des Chiasma opticum als Landmarke schneiden Sie den frontalen Kortex als Gehirnschnitt zwischen Bregma 3,56 und 1,54 aus.

Präparieren Sie das Striatum als Gehirnschnitt zwischen Bregma 1,54 und 0,5 und entfernen Sie vorsichtig das kortikale Gewebe. Präparieren Sie das Hippocampus, indem Sie das Gehirn mit der Nadel durch das Kleinhirn stabilisieren und die Entfaltung der Großhirnrinde beginnend am Okzipitallappen vornehmen.

Tiefgefrieren Sie die entnommenen Gehirnproben schockartig in flüssigem Stickstoff. Beginnen Sie die Synaptosomenreinigung, indem Sie das entnommene Gehirngewebe in Homogenisiergefäße überführen, die ein Milliliter eiskalte Pufferlösung A enthalten. Anschließend homogenisieren Sie das Gewebe bei 900 U/min mit etwa 12 Hubbewegungen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 1.000 × g für 10 Minuten.

Nach der Zentrifugation die Überstände zurückbehalten. Den Pellet erneut wie zuvor homogenisieren und die Überstände vereinigen. Die vereinigten Überstände 20 Minuten bei 12.000 × g zentrifugieren. Die Pellets in einem Milliliter Homogenisierungspuffer resuspendieren und mit sechs Hubstößen bei 900 U/min homogenisieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.200 × g für 20 Minuten.

Während der Zentrifugation zur Herstellung der P2-Pellets bereiten Sie in Ultrazentrifugenröhrchen sukzessive Saccharose-Gradienten vor. Beginnen Sie mit 2,5 Milliliter 1,0-molarer Saccharose-Pufferlösung und schichten Sie dann mit einer Glas-Pasteur-Pipette 1,5 Milliliter 1,2-molarer Saccharose-Pufferlösung darunter. Nach der Zentrifugation geben Sie 0,5 Milliliter 0,32-molarer Saccharose-Pufferlösung zu den P2-Pellets hinzu.

Dann erneut homogenisieren, indem sechs Hubstöße durchgeführt werden. Die homogenisierten Fraktionen auf die Gradienten auftragen. Die beladenen Gradienten in einen Schwenkkorbrotor geben und dann zwei Stunden lang bei 85.000 × g in einem Ultrazentrifugengerät zentrifugieren.

Nach Beendigung der Zentrifugation wird die obere 0,32-molare Saccharoselösung, einschließlich des Materials an der Grenzfläche zum 1,0-molaren Saccharospuffer, verworfen. Sammeln Sie die Synaptosomen an der Grenzfläche zum 1,0- bis 1,2-molaren Saccharospuffer. Geben Sie 0,32-molaren Saccharospuffer im Verhältnis von 1,1 zum synaptosomalen Anteil hinzu.

Vorsichtig mischen und eine Stunde lang mit 150.000 × g zentrifugieren. Die Synaptosomen befinden sich im Pellet und können in einem Puffer für die weitere Verarbeitung resuspendiert werden. Lösen Sie die Synaptosomen jedes Hirnareals eines Tieres in 20 bis 50 Mikrolitern 8-molarer Harnstofflösung auf, indem Sie sie eine Stunde lang auf Eis im Ultraschallbad inkubieren.

Verdünnen Sie mit einem Prozent eines entfernbaren Detergens, um eine Endkonzentration von zwei Mol Harnstoff zu gewährleisten. Nach der Bestimmung der relativen Proteinmengen mittels SDS-PAGE pipettieren Sie ein Drittel des verbleibenden Anteils jeder Probe in ein frisches Gefäß. Führen Sie die Verdauung in Lösung durch Zugabe von zwei Millimolar DTT und 25 Millimolar Ammoniumbicarbonat durch und wirbeln Sie die Probe vorsichtig um.

Reduzieren Sie die Proben 45 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Geben Sie 10 Millimolar Iodaacetylamid zu, um Cysteinreste zu carboxyamidomethylieren, und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie 30 Minuten im Dunkeln bei 20 Grad Celsius.

Schließlich ein Mikroliter einer Trypsin-Standardlösung hinzufügen und 12 Stunden bei 20 Grad Celsius inkubieren. Um das säure-spaltbare Detergens zu entfernen, Trifluoressigsäure auf eine Endkonzentration von einem Prozent hinzufügen und weitere eine Stunde bei 20 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Zentrifugieren der Proben bei 16.000 × g für 10 Minuten die Überstände vorsichtig sammeln.

Setzen Sie die Festphasen-Extraktions-Säule in ein Gestell und equilibrieren Sie die Matrix mit zwei Millilitern Methanol. Nach dem Waschen geben Sie zusätzliche zwei Milliliter Puffer B hinzu und laden die Probe auf. Nach dreimaligem Waschen mit Puffer B eluieren Sie die Peptide durch Zugabe von 200 µL 70 Prozent Acetonitril und 0,1 Prozent Trifluoressigsäure.

Anschließend die gereinigten Proben in einer Vakuumzentrifuge trocknen. In diesem Beispiel zeigen Tiere, die im FM-Ton-Diskriminations-Test trainiert wurden, im Verlauf der Trainingssitzungen eine zunehmende Trefferquote und eine abnehmende Quote falscher Alarme. Eine signifikante Diskriminierung tritt ab der vierten Sitzung auf.

Die relativen synaptischen Mengen ausgewählter Proteine werden zwischen Mäusen, die am FM-Ton-Diskriminationsversuch trainiert wurden, und naiven Kontrollmäusen 24 Stunden nach der ersten Trainingssitzung verglichen. Nach dem Training sind die Konzentrationen des Proteins CYFP2 in allen untersuchten Regionen verändert. Vergessen Sie nicht, dass die Tiere häufig intra-individuelle Variabilitäten aufweisen.

Daher wird dringend empfohlen, mindestens fünf oder mehr biologische Wiederholungen gut abgestimmter Tiergruppen in die Studie einzubeziehen. Sobald die Technik etabliert ist, kann sie problemlos auf andere Arten übertragen werden. Beispielsweise wurde sie bereits verwendet, um lernabhängige Veränderungen der Proteinexpression in einzelnen Gehirnen der Fruchtfliege zu überwachen.