Hohe Auflösung Quantitative Synaptische Proteome Profilieren von Maus Hirnregionen Nach Auditory Diskriminierung Lernen

Das übergeordnete Ziel dieses proteomischen Ansatzes ist die Charakterisierung der molekularen Reorganisation an Synapsen nach dem Lernen und der Gedächtnisbildung, um grundlegende Mechanismen und Signalwege zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein hypothesenfreier Ansatz, der eine großflächige Quantifizierung und Charakterisierung von Posttranslationen und Modifikationen innerhalb synaptischer Proteome ermöglicht. Unser etablierter Workflow ermöglicht eine Korrelation zwischen einer bestimmten molekularen Veränderung und einem bestimmten Verhalten.

Lernen und Gedächtnisbildung basieren auf Veränderungen der synaptischen Wirksamkeit, daher sollten sich proteomische Studien mehr auf die Analyse synaptischer Strukturen wie Synaptosomen als auf Homogenate aus Hirngewebe konzentrieren. Proteomische Ergebnisse stellen hochkomplexe Datensätze dar und erfordern daher eine bioinformetische Verarbeitung. Beginnen Sie das Training, indem Sie die Testmaus in eine schwach beleuchtete Shuttle-Box in einer schalldichten Kammer legen.

Verwenden Sie einen vollständig computergesteuerten Lernplan für das Lernen zur auditiven Diskriminierung. Beginnen Sie mit einer Gewöhnungsphase von drei Minuten Stille, bevor Sie mit dem Training beginnen. Bei Go-Versuchen muss das Tier die Hürde innerhalb von sechs Sekunden nach der Tonvorstellung überwinden, um einen Treffer zu erzielen.

Bei No-Go-Versuchen muss das Tier während der sechs Sekunden der Tonvorführung im Stromfach der Shuttle-Box bleiben. Führen Sie 30 Go-Versuche und 30 No-Go-Versuche in pseudo-randomisierter Reihenfolge durch, mit einem Intervall von 20 Sekunden zwischen den Versuchen, so dass eine Sitzung aus 60 Versuchen besteht und etwa 25 Minuten dauert. Sobald alle Prüfungen durchgeführt wurden, bringe die trainierte Maus bis zum Opfer in den Heimatkäfig zurück.

Nachdem Sie die Maus geopfert und das Gehirn entfernt haben, lokalisieren Sie den auditorischen Kortex anhand visueller Orientierungspunkte wie Blutgefäße und der Form der Oberfläche. Anschließend wird der auditorische Kortex mit Skalpell und Nadel beidseitig als rechteckiger Gewebeblock präpariert. Mit dem Chiasma opticum als Orientierungspunkt präparieren Sie den frontalen Kortex als Hirnschnitt zwischen Bregma 3,56 und 1,54.

Präparieren Sie das Striatum als Hirnschnitt zwischen Bregma 1,54 und 0,5. Und entfernen Sie vorsichtig das kortikale Gewebe. Präparieren Sie den Hippocampus, indem Sie das Gehirn mit der Nadel durch das Kleinhirn stabilisieren und den Kortex beginnend am Okzipitallappen abwickeln.

Schockfrosten von sezierten Gehirnproben in flüssigem Stickstoff. Beginnen Sie mit der Reinigung der Synaptosomen, indem Sie das präparierte Hirngewebe in Homogenisierungsgefäße mit einem Milliliter eiskaltem Puffer A überführen. Homogenisieren Sie dann das Gewebe bei 900 U/min mit etwa 12 Hüben. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 1.000 mal G.

Nach der Zentrifugation die Überstände zurückhalten. Homogenisieren Sie das Pellet wieder wie zuvor und kombinieren Sie die Überstände. Die kombinierten Überstände werden 20 Minuten lang bei 12.000 G geschleudert.Die Pellets werden in einem Milliliter Homogenisierungspuffer resuspendiert und mit sechs Hüben bei 900 U/min homogenisiert, gefolgt von einer Zentrifugation bei 1.200 G für 20 Minuten.

Während der Zentrifugation zur Herstellung der P2-Pellets werden Saccharose-Stufengradienten in Ultrazentrifugenröhrchen vorbereitet. Beginnen Sie mit 2,5 Millilitern 1,0 molaren Saccharosepuffer und verwenden Sie dann eine Pasteurpipette aus Glas, um 1,5 Milliliter 1,2 molaren Saccharosepuffer zu unterschichten. Nach der Zentrifugation fügen Sie 0,5 Milliliter 0,32 molare Saccharosepuffer zu den P2-Pellets hinzu.

Anschließend mit sechs Hüben wieder homogenisieren. Laden Sie die homogenisierten Fraktionen auf die Gradienten. Legen Sie die geladenen Gradienten in einen schwingenden Schaufelrotor und drehen Sie sich dann zwei Stunden lang in einer Ultrazentrifuge mit dem 85.000-fachen G.

Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entsorgen Sie die oberste 0,32-molare Saccharoseschicht, einschließlich des Materials an der Grenzfläche zum 1,0-molaren Saccharosepuffer. Sammeln Sie Synaptosomen an der Schnittstelle zwischen einem und 1,2 molaren Saccharosepuffer. Geben Sie 0,32 molaren Saccharosepuffer in einem Verhältnis von 1,1 zur synaptosomalen Fraktion.

Vorsichtig mischen und eine Stunde lang bei 150.000 g schleudern. Synaptosomen befinden sich im Pellet und können zur weiteren Verarbeitung in einem Puffer wieder suspendiert werden. Lösen Sie die Synaptosomen jedes Gehirnbereichs eines Tieres in 20 bis 50 Mikrolitern 8-molaren Harnstoff auf, indem Sie eine Stunde lang in einem Ultraschallbad auf Eis inkubieren.

Mit einem Prozent eines abnehmbaren Reinigungsmittels verdünnen, um eine Endkonzentration von zwei molaren Harnstoff zu gewährleisten. Nach der Bestimmung der relativen Proteinmengen mit SDS-PAGE pipettieren Sie ein Drittel des Rests jeder Probe in ein frisches Röhrchen. Führen Sie den Aufschluss in Lösung durch, indem Sie zwei millimolare DTT- und 25 millimolare Ammoniumbicarbonat hinzufügen und die Probe vorsichtig vortexen.

Reduzieren Sie die Proben 45 Minuten lang bei 20 Grad Celsius. Geben Sie 10 millimolare Jota-Acedomid zu den Carbamidmethylat-Cystein-Rückständen und mischen Sie. 30 Minuten im Dunkeln bei 20 Grad Celsius inkubieren.

Zum Schluss fügen Sie einen Mikroliter einer Trypsin-Stammlösung hinzu und inkubieren Sie 12 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Um das säurespaltbare Reinigungsmittel zu entfernen, wird Trifluoressigsäure bis zu einer Endkonzentration von einem Prozent zugegeben und eine weitere Stunde bei 20 Grad Celsius inkubiert. Nachdem die Proben 10 Minuten lang bei 16.000 G zentrifugiert wurden, sind die Überstände vorsichtig zu sammeln.

Stellen Sie die Festphasen-Extraktionssäule in ein Gestell und äquilibrieren Sie die Matrix mit zwei Millilitern Methanol. Fügen Sie nach dem Waschen weitere zwei Milliliter Puffer B hinzu und laden Sie die Probe. Nach dreimaligem Waschen mit Puffer B eluieren Sie die Peptide durch Zugabe von 200 Mikrolitern 70 Prozent Acetonitril und 0,1 Prozent Trifluoressigsäure.

Anschließend trocknen Sie die gereinigten Proben in einer Vakuumzentrifuge. In diesem Beispiel zeigen Tiere, die mit der FM-Tonunterscheidungsaufgabe trainiert wurden, eine zunehmende Trefferrate und eine abnehmende Rate von Fehlalarmen im Laufe der Trainingseinheiten. Ab der vierten Sitzung kommt es zu einer erheblichen Diskriminierung.

Die relativen synaptischen Häufigkeiten ausgewählter Proteine werden zwischen Mäusen, die mit der FM-Tonusunterscheidungsaufgabe trainiert wurden, und naiven Kontrollmäusen 24 Stunden nach der ersten Trainingseinheit verglichen. Nach dem Training sind die Spiegel des CYFP2-Proteins in allen untersuchten Regionen verändert. Vergessen Sie nicht, dass die Tiere oft intraindividuelle Variabilitäten aufweisen.

Daher wird dringend empfohlen, mindestens fünf oder mehr biologische Replikate von gut aufeinander abgestimmten Tiergruppen in die Studie einzubeziehen. Einmal etabliert, kann diese Technik leicht auf andere Arten übertragen werden. Zum Beispiel wurde es verwendet, um lernabhängige Proteinexpressionsänderungen in Gehirnen von einzelnen Fruchtfliegen zu überwachen.