Name: Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse synaptischer, zytoplasmatischer und nukleärer Fraktionen aus demselben Gehirn.

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Diese Arbeit wurde durch Start-up-Fonds des College of Agricultural and Life Sciences und des College of Science an der Virginia Tech unterstützt. T.M. wird vom George Washington Carver Program an der Virginia Tech unterstützt.

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<li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li>
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<li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII%2C+but+not+protein+kinase+A%2C+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).</li>
<li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349(2011).</li>
<li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li>
<li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li>
<li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li>
<li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li>
<li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li>
<li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li>
<li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li>
<li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier zeigen wir eine effiziente Methode zur Quantifizierung von Veränderungen der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten im selben Tier. Derzeit sind die meisten Versuche zur Messung subzellulärer Aktivitätsänderungen des Ubiquitin-Proteasom-Systems auf ein einziges Fach pro Probe beschränkt, was dazu führt, dass Experimente wiederholt werden müssen. Dies führt zu erheblichen Kosten und Verlusten an Tierleben. Unser Protokoll lindert dieses Problem, indem es Hemisphären spaltet, so da...

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein komplexes Netzwerk miteinander verbundener Proteinstrukturen und Ligasen, das den Abbau der meisten kurzlebigen Proteine in Zellen1steuert. In diesem System werden Proteine durch den kleinen Modifikator Ubiquitin für Abbau oder andere zelluläre Prozesse/Fates markiert. Ein Zielprotein kann 1-7 Ubiquitin-Modifikationen erwerben, die an einem von sieben Lysin(K)-Standorten (K6, K11, K27, K29, K33, K48 und K63) oder dem N-Terminal Methionin (M1; bekannt als linear) im vorherigen Ubiquitin2miteinander verknüpft werden können. Einige dieser Polyubiquitin-Tags sind abbauspezifisch (K48)3, während andere weitgehend unabhängig vom Proteinabbauprozess (M1)4,5,6sind. Daher ist der Protein-Ubiquitinationsprozess unglaublich komplex und die Fähigkeit, Veränderungen in einem bestimmten Polyubiquitin-Tag zu quantifizieren, ist entscheidend für das letztendliche Verständnis der Rolle dieser gegebenen Veränderung in der zellulären Funktion. Erschwerend kommt hinzu, dass die Untersuchung dieses Systems, das Proteasom,die katalytische Struktur der USV 7, sowohl Proteine abbaut, als auch aber auch an anderen nicht-proteolytischen Prozessen beteiligt sein kann8,9. Es überrascht nicht, dass seit seiner ersten Entdeckung eine normale und abnorme ubiquitin-proteasomische Aktivität in die Langzeitgedächtnisbildung und eine Vielzahl von Krankheitszuständen verwickelt ist, darunter viele neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen10,11. Infolgedessen sind Methoden, die die USS-Aktivität im Gehirn effektiv und effizient quantifizieren können, entscheidend für das letztendliche Verständnis, wie dieses System in Krankheitszuständen dysreguliert ist, und die letztendliche Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten, die auf Ubiquitin und/oder proteasom funktionadieren.
Es gibt eine Reihe von Problemen bei der Quantifizierung der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Hirngewebe von Ratten und Mäusen, die die häufigsten Modellsysteme sind, die verwendet werden, um die UPS-Funktion zu untersuchen, einschließlich 1) die Vielfalt der Ubiquitin-Modifikationen und 2) Die Verteilung und Differenzregelung der USUs-Funktion über subzelluläre Kompartimente12,13,14. Zum Beispiel verwendeten viele der frühen Demonstrationen der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn während der Gedächtnisbildung ganze Zelllysate und deuteten auf eine zeitabhängige Zunahme sowohl der Protein-Ubiquitination als auch der Proteasomenaktivität15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20. Vor kurzem stellten wir jedoch fest, dass die Ubiquitin-Proteasomen-Aktivität in den subzellulären Fächern als Reaktion auf das Lernen sehr unterschiedlich war, wobei in einigen Regionen gleichzeitig zunimmt und in anderen ein Muster abnimmt, das sich erheblich unterscheidet. von dem, was zuvor in ganzen Zelllysaten berichtet wurde21. Dies steht im Einklang mit der Einschränkung eines gesamten Zellansatzes, da er den Beitrag von Änderungen der USB-Aktivität über verschiedene subzelluläre Kompartimente hinweg nicht trennen kann. Obwohl neuere Studien synaptische Bruchprotokolle verwendet haben, um die USV speziell an Synapsen als Reaktion auf das Lernen22,23,24zu studieren, schließen die angewandten Methoden die Fähigkeit zur Messung kerntechnische und zytoplasmatische Ubiquitin-Proteasom-Veränderungen im selben Tier. Dies führt zu einer unnötigen Notwendigkeit, Experimente mehrmals zu wiederholen, wobei jeweils eine andere subzelluläre Fraktion gesammelt wird. Dies führt nicht nur zu einem größeren Verlust von Tierleben, sondern eliminiert auch die Möglichkeit, DIE USV-Aktivität in verschiedenen subzellulären Abteilungen als Reaktion auf ein bestimmtes Ereignis oder während eines bestimmten Krankheitszustands direkt zu vergleichen. Wenn man bedenkt, dass die Proteinziele von Ubiquitin und dem Proteasom in der Zelle sehr unterschiedlich sind, ist es entscheidend zu verstehen, wie sich die Ubiquitin-Proteasome-Signalisierung in verschiedenen subzellulären Kompartimenten unterscheidet, um die funktionelle Rolle der USB in der Gedächtnisbildung und neurologische, neurodegenerative und psychiatrische Störungen.
Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir vor kurzem ein Verfahren entwickelt, bei dem kerntechnische, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen für eine bestimmte Hirnregion desselben Tieres gesammelt werden könnten21. Um die begrenzte Menge an Protein zu berücksichtigen, die aus der Entnahme mehrerer subzellulärer Fraktionen aus derselben Probe gewonnen werden kann, haben wir zuvor etablierte Protokolle optimiert, um die In-vitro-Proteasomaktivität und die linkage-spezifische Protein-Ubiquitination in lysierten Zellen aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt. Mit diesem Protokoll konnten wir lernabhängige Veränderungen der Proteasomaktivität K48, K63, M1 und der gesamten Proteinpolyubiquitination im Kern und Zytoplasma sowie an Synapsen in der lateralen Amygdala von Ratten sammeln und direkt vergleichen. Hier beschreiben wir detailliert unser Verfahren (Abbildung 1), das unser Verständnis davon, wie die USV an der Langzeitgedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen beteiligt ist, erheblich verbessern könnte. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass die in unserem Protokoll diskutierte In-vitro-Proteasomaktivität zwar weit verbreitet ist, aber die Aktivität vollständiger 26S-Proteasomkomplexe nicht direkt misst. Vielmehr misst dieser Assay die Aktivität des 20S-Kerns, d. h. er kann nur als Proxy dienen, um die Aktivität des Kerns selbst im Gegensatz zum gesamten 26S-Proteasom-Komplex zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>15575020</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>20S Proteasom Activity Kit</td><td>Millipore Sigma</td><td>APT280</td><td>Andere Anbieter führen andere Versionen</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher</td><td>FERR1441</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>Beta-Aktin Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>4967S</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Beta-Tubulin Antikörper</td><td>Zelle Signalisierung</td><td>2128T</td><td>Verschiedene andere Hersteller</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 Plattenleser</td><td>BioTek</td><td>VATECHH1MT3</td><td>Andere Hersteller führen andere Versionen</td></tr><tr><td>B-Mercaptoethanol</td><td>Fisher ICN19024280</td><td></td><td>Verschiedene andere Hersteller</td></tr><tr><td>Clasto Lactacystin b-lacton</td><td>Millipore Sigma</td><td>L7035</td><td>Verschiedene andere Hersteller</td></tr><tr><td>Kryobecher</td><td>Fisher</td><td>033377B</td><td>Verschiedene andere Hersteller</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>DMSO</td><td>D8418</td><td>Verschiedene andere Hersteller</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td>Verschiedene andere Hersteller</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>H3 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher</td><td>SA48</td><td>Diverse andere Hersteller</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>Millipore Sigma</td><td>I3021</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>K48 Ubiquitin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab140601</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>K63 Ubiquitin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab179434</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td>Diverse Andere Anbieter</td></tr><tr><td>KONTES Gewebeschleifer</td><td>VWR</td><td>KT885300-0002</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-rad</td><td>161-0737</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Lineare Ubiquitin Antikörper</td><td>Life Sensors</td><td>AB-0130-0100</td><td>Nur M1 Antikörper</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Millipore Sigma 442611</td><td></td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>2231000213</td><td>Diverse andere Hersteller/Modelle</td></tr><tr><td>myr-AIP</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-P212-0500</td><td>geführt von Millipore-Sigma</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>Diverse andere Hersteller</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System</td><td>LiCor</td><td>2800-02</td><td>Andere Hersteller führen andere Versionen</td></tr><tr><td>Phosphatase-Hemmer</td><td>Millipore Sigma 524625</td><td></td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-rad</td><td>161-0373</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>Proteasehemmer</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8340</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>PSD95 Antikörper</td><td>Cell signaling</td><td>3450T</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3771</td><td>Verschiedene andere Anbieter</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher</td><td>SS255</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>TBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62938</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-100</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr><tr><td>Ubiquitin Antikörper</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-PW8810</td><td>Diverse andere Anbieter</td></tr></tbody></table>

quantifizierung subzellulärer ubiquitin-proteasom-aktivität im nagetierhirn

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist ein wichtiger Regulator des Proteinabbaus und einer Vielzahl anderer zellulärer Prozesse in Eukaryoten. Im Gehirn, Erhöhung enrubisiert-proteasom Aktivität sind entscheidend für synaptische Plastizität und Gedächtnisbildung und aberrante Veränderungen in diesem System sind mit einer Vielzahl von neurologischen, neurodegenerativen und psychiatrischen Störungen verbunden. Eines der Probleme bei der Untersuchung der Ubiquitin-Proteasom-Funktion im Gehirn ist, dass es in allen zellulären Kompartimenten vorhanden ist, in denen die Proteinziele, die funktionelle Rolle und die Regulationsmechanismen sehr unterschiedlich sein können. Infolgedessen ist die Fähigkeit, das Gehirn-Ubiquitin-Protein-Targeting und die katalytische Aktivität des Proteasomen in verschiedenen subzellulären Kompartimenten innerhalb desselben Tieres direkt zu vergleichen, entscheidend für das vollständige Verständnis, wie die USV zur synaptischen Plastizität beiträgt. Gedächtnis und Krankheit. Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Entnahme von kerntechnischen, zytoplasmatischen und rohen synaptischen Fraktionen aus demselben Nagetier (Ratten)-Gehirn, gefolgt von einer gleichzeitigen Quantifizierung der proteasomkatalytischen Aktivität (indirekt, die Aktivität des Proteasomkerns bereitstellt). ) und linkage-spezifische Ubiquitin-Protein-Tagging. So kann die Methode verwendet werden, um subzelluläre Veränderungen in der Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in verschiedenen Hirnregionen im selben Tier während der synaptischen Plastizität, Gedächtnisbildung und verschiedenen Krankheitszuständen direkt zu vergleichen. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die subzelluläre Verteilung und Funktion anderer Proteine innerhalb desselben Tieres zu bewerten.

Mit dem hier beschriebenen Verfahren wurden kernnukleare, zytoplasmatische und synaptische Fraktionen aus der lateralen Amygdala des Rattenhirns (Abbildung1) entnommen. Die Reinheit der einzelnen Fraktionen wurde durch Western Blotting bestätigt, wobei Antikörper gegen Proteine untersucht wurden, die im Lysat angereichert oder erschöpft werden sollten. In der ersten Hemisphäre, auf der eine grobe synaptische Fraktion gesammelt wurde, war das postsynaptische D...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Dieses Protokoll misst subzelluläre Protein-Ubiquitinationsspiegel und Proteasome-Aktivität im Nagetier-Gehirn ermöglicht innerhalb der Probanden Vergleiche darüber, wie sich die ubiquitin-proteasome Aktivität als Reaktion auf zelluläre Aktivität, Lernen oder Krankheit ändert. Das Protokoll ermöglicht die Sammlung von synaptischen, zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen aus demselben Nagetiergehirn. Minimierung des Verlustes, es könnte mit kleinen Gewebemengen und grundlegende Laborausrüstung durchgeführt werden.Demonstriert wird das Verfahren von Taylor McFadden, einem Doktoranden aus meinem Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung und Zerlegung von Nagetier-Hirngewebe, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Hemisphäre für jede Versuchsgruppe über die Extraktionsbedingungen hinweg gegenausgeglichen ist.Entfernen Sie das 1,5 Milliliter Zentrifugen-Mikrorohr, das eine Hemisphäre der Interessenregion enthält, aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Mit einem Skalpell das gefrorene Hirngewebe auf einen Zwei-Milliliter-Glas-Teflon-Homogenisator übertragen. Fügen Sie dem Teflonrohr 500 Mikroliter Lysepuffer hinzu.Mit dem Stöß

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Research

Forschung

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Neurowissenschaften

Dieses Video zeigt, wie man die Proteasomaktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten der lateralen Amygdala aus angstkonditionierten und kontrollierten Rattengehirnen mit einem fluorogenen Peptid-Assay messen kann. Das Proteasom spaltet das fluorogene Peptidsubstrat und setzt fluoreszierende Moleküle frei, die mit einem Plattenleser quantifiziert werden, um die Proteasomaktivität in den nukleären und synaptischen Proteinfraktionen zu bewerten. Eine erhöhte Kernaktivität deutet auf...

Messung der Proteasomaktivität in verschiedenen subzellulären Kompartimenten des Rattengehirns

Quelle: Kimmelmann-Shultz, B., &lt;span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'&gt;et. al. Mit Nahinfrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung der Proteinexpression im Nagetiergehirn. J. Vis. (2019) Dieses Video zeigt eine Nahinfrarot-Fluoreszenz- und hochauflösende Scanmethode zur Messung der Proteinexpression im Gehirn...

Messung der Proteinexpression im Nagetiergehirn mittels Nahinfrarot-Fluoreszenz und hochauflösender Abtastung 

Neuronale Membrantransport steuert dynamisch die Plasmamembran Protein Verfügbarkeit und wirkt sich deutlich auf die Neurotransmission. Bis heute hat es sich herausfordern, um neuronale endozytischen Handel bei erwachsenen Nervenzellen messen. Hier beschreiben wir eine hochwirksame, quantitative Methode, um schnelle Veränderungen in der Oberflächenproteinexpression ex vivo in akuten Hirnschnitten messen.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Auf den aktuellen Protokollinformationen ein Verfahren zur Messung der Aktivität der funktionell homolog Deubiquitinierungsenzyme. Specialized-Sonden, die das Enzym kovalent modifizieren und lassen für die Erkennung. Dieses Verfahren hält das Potenzial, neue therapeutische Targets zu identifizieren.

Verfahren zur Messung der Aktivität von Deubiquitinierungsenzyme in Zelllinien und Gewebeproben

Die Proteinsynthese ist ein kritischer biologischer Prozess für Zellen. Im Gehirn ist es für adaptive Veränderungen erforderlich. Die Messung der Raten der Proteinsynthese im intakten Gehirn erfordert sorgfältige methodische Überlegungen. Hier stellen wir die l-[1-14C]-eucinquantitative autoradiographische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in vivo vor.

Quantitative autoradiografische Methode zur Bestimmung der regionalen Raten der zerebralen Proteinsynthese in Vivo

Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Ubiquitin (Ub) und Ubiquitin-Likes (Ubls) spezifische Proteome zu etablieren, um Änderungen dieser Art von post-translationalen Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, die mit einer bestimmten Erkrankung wie einer Behandlung oder einem Phänotyp verbunden sind.

Profilierung von Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen abhängigen posttranslationalen Änderungen und Identifizierung signifikanter Änderungen

Hier stellen wir eine automatisierte Methode zur semi-quantitativen Bestimmung der dopaminergen Neuronenzahl in der Rattensubantia nigra pars compacta vor.

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für einen Ubiquitylierungsassay eines spezifischen Substrats und einer E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzellen. HEK293T-Zelllinien wurden zur Proteinüberexpression verwendet, das polyubiquitylierte Substrat wurde durch Immunpräzipitation von Zelllysaten gereinigt und in SDS-PAGE aufgelöst. Immunoblotting wurde verwendet, um diese posttranslationale Modifikation zu visualisieren.

Evaluierung der Substratubiquitylierung mittels E3-Ubiquitin-Ligase in Säugetierzelllysaten

In diesem Protokoll wird erläutert, wie die Wirkung genetischer Variation, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen verbunden ist, auf die deubiquitylierende Enzymaktivität gemessen werden kann, indem die rekombinante Proteinreinigung mit Ubiquitin-Kettenspaltungsassays kombiniert wird.

Messung der enzymatischen Aktivität von Enzymen, die mit neurologischen Entwicklungsstörungen assoziiert sind, mittels eines in vitro Ubiquitin-Kettenspaltungsassays

Lernen Sie die Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse synaptischer, zytoplasmatischer und nukleärer Fraktionen aus demselben Gehirn.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

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