Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Dieses Protokoll misst subzelluläre Protein-Ubiquitinationsspiegel und Proteasome-Aktivität im Nagetier-Gehirn ermöglicht innerhalb der Probanden Vergleiche darüber, wie sich die ubiquitin-proteasome Aktivität als Reaktion auf zelluläre Aktivität, Lernen oder Krankheit ändert. Das Protokoll ermöglicht die Sammlung von synaptischen, zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen aus demselben Nagetiergehirn. Minimierung des Verlustes, es könnte mit kleinen Gewebemengen und grundlegende Laborausrüstung durchgeführt werden.

Demonstriert wird das Verfahren von Taylor McFadden, einem Doktoranden aus meinem Labor. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Sammlung und Zerlegung von Nagetier-Hirngewebe, wie im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Hemisphäre für jede Versuchsgruppe über die Extraktionsbedingungen hinweg gegenausgeglichen ist.

Entfernen Sie das 1,5 Milliliter Zentrifugen-Mikrorohr, das eine Hemisphäre der Interessenregion enthält, aus dem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Mit einem Skalpell das gefrorene Hirngewebe auf einen Zwei-Milliliter-Glas-Teflon-Homogenisator übertragen. Fügen Sie dem Teflonrohr 500 Mikroliter Lysepuffer hinzu.

Mit dem Stößel B homogenisieren Sie das gleiche Gewebe mit 15 Strichen, bis keine sichtbare Menge an festem Material vorhanden ist. Verwenden Sie bei jedem Hub eine Drehbewegung. Mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette die homogenisierte Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen.

Legen Sie die Röhre auf nasses Eis und inkubieren Sie für 30 Minuten. Die Röhre in die Mikrozentrifuge geben und 10 Minuten bei 845 mal g bei vier Grad Celsius drehen. Nach Derfertigstellung den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernen und in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben.

Dies ist die zytoplasmatische Fraktion. Fügen Sie dem resultierenden Pellet 50 Mikroliter Extraktionspuffer hinzu und setzen Sie es durch Pipettieren wieder auf. Wirbeln Sie das Pellet nicht.

Das Rohr mit dem resuspendierten Pellet auf Eis legen und 30 Minuten inkubieren. Dann zentrifugieren Sie das Rohr für 20 Minuten bei 21, 456 mal g in vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig durch Pipettieren entfernen und in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr geben.

Das ist die kerntechnische Fraktion. Homogenisieren Sie eine Hemisphäre der Region von Interesse wie zuvor, außer 500 Mikroliter TEVP-Puffer anstelle von Lysepuffer zu verwenden. Mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette die homogenisierte Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen.

Zentrifuge die Probe bei 1 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie das ursprüngliche Pellet, das Kerne und die großen Trümmer enthält. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Dies ist die zytosolische Fraktion.

Fügen Sie dem Pellet 50 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu und setzen Sie es durch Pipettieren wieder auf, bis kein festes Material sichtbar ist. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.

Dies ist die grobe synaptosomale Membranfraktion. Um den Test einzurichten, den Plattenleser auf 37 Grad Celsius vorwärmen und durch den Lauf halten. Stellen Sie die Anregung auf 360 Nanometer und die Emission auf 460 Nanometer ein.

Wenn die verwendete 96-Wellplatte klar ist, stellen Sie die Optikposition auf unten ein. Wenn eine dunkle 96-Well-Platte verwendet wird, stellen Sie die Optikposition nach oben ein. Programmieren Sie einen kinetischen Lauf mit einer Zeit von zwei Stunden, die alle 30 Minuten gescannt werden.

Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen 20S 10X-Assaypuffer mit 13,5 Milliliter Reinstwasser. Fügen Sie 14 Mikroliter 100 Millimolar ATP in den jetzt 1X Puffer. Dies verbessert die Proteasomaktivität in den Proben erheblich und verbessert die Zuverlässigkeit des Assays.

Rekonstituieren Sie den im Kit enthaltenen AMC-Standard mit 100 Mikroliter DMSO. Führen Sie Schritte mit dem AMC-Standard bei Dunkelheit oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da der Standard lichtempfindlich ist. Erstellen Sie eine Standardkurve von AMC aus einer Reihe von hohen bis niedrigen AMC-Konzentrationen.

Diese Kurve wird für die Kalibrierung des Plattenlesers und die Analyse der Proteasomenaktivität in den homogenisierten Proben verwendet. Rekonstituieren Sie das im Kit enthaltene Proteasomensubtrat mit 65 Mikroliter DMSO. Führen Sie diesen Schritt auch bei Dunkelheit oder bei schlechten Lichtverhältnissen durch, da das Substrat lichtempfindlich ist.

Dann erstellen Sie eine einbis 20 Verdünnung des Proteasomensubstrats in einem neuen 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit 20S Assaypuffer. Fügen Sie eine normalisierte Menge der gewünschten Proben zu einer 96-Well-Platte hinzu. Führen Sie jedes Beispiel in doppelter Ausführung aus.

Die benötigte Probenmenge variiert je nach Gewebevorbereitung. Im Allgemeinen reichen 10 bis 20 Mikrogramm für jede subzelluläre Fraktion. Bringen Sie die Probe gut Volumen auf 80 Mikroliter mit reinem Wasser.

Der hinzugefügte Betrag hängt vom Volumen der hinzugefügten Probe ab. In zwei separaten Brunnen, fügen Sie 80 Mikroliter Wasser allein. Dies werden die Test-Rohlinge sein.

Fügen Sie 10 Mikroliter 20S Assay-Puffer zu jedem Brunnen einschließlich Assay-Rohlinge hinzu. Verwenden Sie einen Repeater oder eine automatisierte Pipette, um ein konsistentes Assayvolumen in den Brunnen zu gewährleisten. Schalten Sie die Lichter aus oder betreten Sie einen dunklen Raum.

Fügen Sie alle 100 Mikroliter verdünnter AMC-Standards zu einem neuen Brunnen hinzu, indem Sie für jeden Standard einen einzigen Brunnen verwenden. Verwenden Sie im Dunkeln einen Repeater oder eine automatisierte Pipette, um 10 Mikroliter verdünntes Proteasossubstrat in Brunnen mit Proben- und Assayrohlingen, aber nicht in den AMC-Standard hinzuzufügen. Legen Sie die Platte in den Plattenleser und starten Sie den kinetischen Lauf.

Quantifizierung verschiedener Polyubiquitin-Tags in verschiedenen subzellulären Fraktionen, die aus Nagetier-Gehirngewebe gesammelt wurden, mit einer Vielzahl von Standard-Western-Blotting-Protokollen in Kombination mit einzigartigen linkage-spezifischen Polyubiquitin-Antikörpern. Einige ubiquitin Western Blot Bilder werden Spalten von unterschiedlichen Bändern bieten, während andere schmierartige Muster mit wenigen oder gar keinen klaren Linien erzeugen. Zur Quantifizierung der abgebildeten Ubiquitin Western Blots, zeichnen Sie eine Box um die Säule, die die gesamte molekulare Standards Leiter erweitert.

Passen Sie die Box an, wenn sich die Ubiquitinfärbung über die gesamte Leiter erstreckt. Dies ist üblich für Lysin 48 Modifikationen und variiert stark in subzellulären Fächern. Schließlich subtrahieren Sie den Hintergrund, der als mittlere optische Dichte des Hintergrunds berechnet wird, der die Spalte auf allen Seiten unmittelbar umgibt.

Hier ist die Quantifizierung der Proteasomaktivität in verschiedenen Fraktionen zu sehen, die aus der lateralen Amygdala desselben Tieres gesammelt wurden. Während des In-vitro-Proteasomen-Aktivitätstests stiegen die vom Anfang bis zum Ende des Tests nachgewiesenen relativen fluoreszierenden Einheiten in der synaptischen Fraktion, der zytoplasmatischen Fraktion und der Kernfraktion. Der Proteasomen-Inhibitor Beta-Lac verhinderte, dass sich die RFUs während der Sitzung änderten.

Subzelluläre Unterschiede wurden bei der Proteasomaktivität in der lateralen Amygdala desselben Tieres beobachtet. Bei ausgebildeten Tieren wurde eine Zunahme der nuklearen Proteasomaktivität im Vergleich zu Kontrollen festgestellt, die einer Abnahme der Aktivität innerhalb der synaptischen Fraktion entsprachen. Die zytoplasmatische Proteasomaktivität blieb an der Ausgangsbasis.

Hier sind subzelluläre Unterschiede in der linkagespezifischen Protein-Ubiquitination in der lateralen Amygdala desselben Tieres nach dem Lernen zu sehen. Nach dem Lernen, der mit einer Abnahme der zytoplasmatischen Fraktion korrelierte, stieg die Gesamtubiquitination in der Kernfraktion. Nach dem Lernen nahm die lineare Ubiquitination in der Kernfraktion zu, nicht aber in zytoplasmatischen oder synaptischen Fraktionen.

Interessanterweise nahm die K63-Ubiquitination in der Kernfraktion nach dem Lernen zu, das mit einer Abnahme der synaptischen Fraktion korrelierte. Während Die K48-Uniquitination in den kerntechnischen und zytoplasmatischen Fraktionen nach dem Lernen, aber nicht in der synaptischen Fraktion zunahm. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die subzelluläre Verteilung und Funktion anderer Proteine innerhalb desselben Tieres zu verstehen.