Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirksamkeit von immunmodulatorischen Medikamenten mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers zu bewerten, indem die T-Lymphozyten-Blastogenese oder die Blastentransformation gemessen wird. Dieser Assay bietet eine schnelle Methode zur Quantifizierung der T-Lymphozytenaktivierung unter Verwendung eines automatisierten Zellzählers, der für die Messung von Zelldurchmessern ausgestattet ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie im Gegensatz zu herkömmlichen T-Lymphozyten-Proliferationsassays eine schnelle, einfache und direkte Messung aus einzelnen Zellen ermöglicht.

Die Behandlung von Lymphozyten mit immunmodulatorischen Medikamenten erhöht oder verringert die Geschwindigkeit und das Ausmaß der zellulären Blastogenese. Mit dem Zellzähler-Assay kann das Ausmaß dieser Blastogenese in etwa vier Minuten pro Probe gemessen werden. Besprühen Sie innerhalb von zehn Minuten nach der Tötung den Bauch der Maus mit 70 Prozent Ethanol und machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in das Fell und die Haut auf der linken Seite des Tieres.

Halten Sie die Haut auseinander und zurück, um das Bauchfell freizulegen. Tragen Sie dann vier Prozent Chlorhexidin auf die Inzisionsstelle auf. Machen Sie mit einer zweiten Schere und Pinzette einen zwei bis drei Zentimeter langen Schnitt entlang des Mittelbauchs, um das Bauchfell zu öffnen.

Entfernen Sie dann die viszeralen Ansätze und das überschüssige Fett, das die Milz umgibt, und übertragen Sie das Gewebe in einen Behälter mit DPBS. Geben Sie anschließend zehn Milliliter des kompletten RPMI 1640 Mediums in eine zehn Zentimeter große Kulturschale und zerkleinern Sie die Milz zwischen zwei sterilisierten Milchglasobjektträgern. Filtern Sie die Gewebeaufschlämmung durch ein steriles 40-Mikron-Nylon-Zellsieb in eine neue Zehn-Zentimeter-Kulturschale, um das Bindegewebe und die Ablagerungen zu entfernen, und überführen Sie die Einzelzellsuspension zur Zentrifugation in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Resuspendieren Sie das Pellet in 20 Millilitern Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Nach zehn Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und suspendieren das Pellet in zehn Millilitern frischem Medium. Dann zentrifugieren Sie die Zellen erneut zur Resuspension in zwei Milliliter 37 Grad Celsius Vollmedium.

Um die T-Zellen zu reinigen, waschen Sie zunächst ein bis zwei Nylonwollsäulen pro Milz zweimal mit fünf Millilitern vollständigem RPMI und legen Sie die Säulen für eine Stunde in einen 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation werden zwei Milliliter der isolierten Splenozytensuspension auf die Oberseite jeder Säule geladen und die Zellen durch die Säule gelassen, bis die Flüssigkeit die Oberseite der Wolle erreicht. Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter frisches 37 Grad Celsius vollwertiges Medium auf die Oberseite der Säulen und lassen Sie das Medium durch die Nylonwolle laufen, bis die Flüssigkeit am oberen Ende der Säule die Oberseite der Wolle erreicht.

Bedecken Sie nun die Wolle mit drei Millilitern 37 Grad Celsius Vollmedium und geben Sie die Säule in den Zellkultur-Inkubator zurück, um alle B-Zellen, Fibroblasten und akzessorischen Zellen an den Wollfasern zu haften. Waschen Sie die Säule nach einer Stunde in einem neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen zweimal mit fünf Millilitern frischem Komplettmedium, um die nicht anhaftenden T-Zellen zu eluieren. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt.

Nachdem Sie die T-Zellen einmal mit zehn Millilitern vollständigem Medium gewaschen haben, resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern frischem vollständigem Medium. Zählen Sie dann die Zellen und verdünnen Sie die Suspension auf eine Konzentration von 0,5 mal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter in frischem vollständigem Medium zur Aussaat in eine Zellkulturplatte mit sechs oder 24 Vertiefungen, je nach experimenteller Eignung. Aktivieren Sie innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Isolierung die isolierten T-Zellen aus Nylonwolle mit dem entsprechenden Stimulus und dem experimentellen Medikament von Interesse.

Verwenden Sie nach 12 bis 72 Stunden eine Ein-Milliliter-Pipette, um die aktivierten behandelten Zellen vorsichtig zu mischen, um alle Klumpen zu entfernen. Um die Zelldurchmesser mit dem automatisierten Zellzähler zu messen, geben Sie einen Milliliter der behandelten Zellen aus jeder Vertiefung in einzelne Probenbecher und platzieren Sie die Probenbecher in das Probenkarussell des automatisierten Zellzählers. Geben Sie die Beispiel-ID und die Zellentypinformationen ein, um die Stichproben zu protokollieren und mit der Ausführung der Stichproben zu beginnen.

Nach dem Mischen von Trypanblau mit der Zellsuspension werden die Zellen über ein Bildgebungsfeld geleitet, bis von jeder Probe etwa 100 Zellbilder gesammelt wurden. Die Software zeichnet einen Kreis um jede detektierte, trypanblau gefärbte und ungefärbte Zelle, um den Zelldurchmesser zu bestimmen. Wenn alle Zellen gemessen wurden, werden die Daten in eine Tabelle exportiert, in der die Ergebnisse als Gesamt- und lebensfähige Zellzahl für jeden gemessenen Durchmesser angezeigt werden.

Die Daten können dann als Histogramme dargestellt werden. Nach zweitägiger Stimulation mit PMA und Ionomycin wird eine signifikante Verschiebung des Medians der Häufigkeitsverteilung hin zu größeren Zelldurchmessern beobachtet, wobei die Anzahl der T-Zellen mit kleinerem Durchmesser entsprechend reduziert wurde. Bei einer festen Konzentration von 250 nanomolaren Ionomycin wird der PMA-Effekt nicht signifikant verändert, indem die Konzentration des Aktivierungsstimulus von zwei auf 250 Nanogramm pro Milliliter erhöht wird.

Es gibt auch keinen nennenswerten Unterschied in der beobachteten T-Zell-Proliferation. Calcineurin-Hemmer unterdrücken teilweise sowohl die T-Zell-Blastogenese als auch die Proliferation. Die T-Zell-Behandlung mit immunsuppressiven Verbindungen, die auf den Calcineurin-Kernfaktor aktivierter T-Zellen abzielen, hemmt die blastogene Reaktion um fast 72 Prozent.

Rapamycin und FTY720 zeigen moderate, aber statistisch signifikante Effekte auf die Blastogenese. Während TRAM34 die Proliferation von murinen T-Zellen selbst bei 700 nanomolaren Konzentrationen offenbar nicht beeinflusst. Wenn Rapamycin und Cyclosporin A zusammen angewendet werden, wird die Blastogenese vollständig gehemmt.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei murinen T-Zellen beobachtet, die mit anti-CD3- und anti-CD28-konjugierten magnetischen Kügelchen aktiviert wurden. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Wirkungen verschiedener immunmodulatorischer Arzneimittel erfolgreich zu quantifizieren, was eine bessere Beurteilung der Wirksamkeit des Arzneimittels im Vergleich zu typischen Proliferationsassays ermöglicht, die auch Beiträge von apoptotischen und nekrotischen Zellen enthalten. Mit dieser Methode können bis zu 15 Proben ein- und ausgemessen werden, was eine gleichzeitige und anschließende Quantifizierung sowohl der Blastogenese- als auch der Proliferationsraten ermöglicht.

Gelegentlich können Luftblasen in die Durchflusszelle gelangen, die die Messung unbrauchbar machen, daher sollten alle Bilder auf Luftblasen untersucht werden, bevor die Daten aus jedem Versuch zur Analyse akzeptiert werden. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass bei der Messung zu viele Ablagerungen in der Probe als lebensfähige Zellen behandelt werden können. Mit geeigneten Modifikationen hat dieser Assay das Potenzial, für die Untersuchung der Zellgrößenänderung in Neutrophilen und Hepatozyten angepasst zu werden.