Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirksamkeit immunmodulatorischer Wirkstoffe mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts zu bewerten, indem die Blastogenese oder Blastentransformation von T-Lymphozyten gemessen wird. Dieser Test bietet eine schnelle Methode zur Quantifizierung der Aktivierung von T-Lymphozyten unter Verwendung eines automatischen Zellzählgeräts, das zur Messung von Zelldurchmessern geeignet ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie – im Gegensatz zu gängigen Proliferationstests an T-Lymphozyten – eine schnelle, einfache und direkte Messung an Einzelzellen ermöglicht.

Die Behandlung von Lymphozyten mit immunmodulatorischen Wirkstoffen erhöht oder verringert die Rate und das Ausmaß der zellulären Blastogenese. Mithilfe des Zellzählassays kann das Ausmaß dieser Blastogenese innerhalb von etwa vier Minuten pro Probe gemessen werden. Innerhalb von zehn Minuten nach der Tötung des Tieres den Bauch der Maus mit 70 Prozentigem Ethanol besprühen und mit einer Schere einen Schnitt im Fell und in der Haut auf der linken Seite des Tieres anlegen.

Die Haut auseinander- und zurückgehalten, um das Peritoneum freizulegen. Anschließend wird eine vierprozentige Chlorhexidinlösung auf die Schnittstelle aufgetragen. Mit einem zweiten Satz an Scheren und Pinzetten erfolgt ein zwei bis drei Zentimeter langer Schnitt entlang des mittleren Abdomens, um das Peritoneum zu öffnen.

Entfernen Sie anschließend die viszeralen Anhänge und das überschüssige Fettgewebe um die Milz herum und überführen Sie das Gewebe in einen Behälter mit DPBS. Geben Sie danach zehn Milliliter vollständiges RPMI 1640-Medium in eine zehn Zentimeter große Kulturschale und zerdrücken Sie die Milzen zwischen zwei sterilisierten rauen Glasobjektträgern. Filtern Sie die gewebliche Suspension durch einen sterilen 40-Mikron-Nylon-Zellfilter in eine neue zehn Zentimeter große Kulturschale, um Bindegewebe und Zelltrümmer zu entfernen, und überführen Sie die Einzelzell-Suspension in ein 50-Milliliter-Konischrohr zur Zentrifugation.

Suspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Nach zehn Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schwenken sammeln Sie die Zellen durch eine weitere Zentrifugation ein und suspendieren das Pellet in zehn Milliliter frischem Medium. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen erneut, um sie in zwei Milliliter komplettem Medium bei 37 Grad Celsius zu resuspendieren.

Um die T-Zellen zu reinigen, spülen Sie zunächst ein bis zwei Nylonwoll-Säulen pro Milz zwei Mal mit je fünf Millilitern vollständigem RPMI und stellen die Säulen eine Stunde lang in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation geben Sie zwei Milliliter der isolierten Milzzell-Suspension auf das obere Ende jeder Säule und lassen die Zellen durch die Säule fließen, bis die Flüssigkeit den oberen Rand der Wolle erreicht. Fügen Sie danach zwei Milliliter frisches, auf 37 Grad Celsius erwärmtes vollständiges Medium auf das obere Ende der Säulen hinzu und lassen Sie das Medium durch die Nylonwolle fließen, bis die Flüssigkeit an der Säulenspitze den oberen Rand der Wolle erreicht.

Decken Sie die Wolle nun mit drei Milliliter vollständigem Medium bei 37 Grad Celsius ab und stellen Sie die Säule zurück in den Zellkulturinkubator, damit alle B-Zellen, Fibroblasten und Begleitzellen an den Wollfasern haften können. Nach einer Stunde waschen Sie die Säule in einem neuen 50-Milliliter-Konischglas zweimal mit je fünf Milliliter frischem vollständigem Medium, um die nicht haftenden T-Zellen auszuwaschen. Sammeln Sie anschließend die Zellen durch Zentrifugation.

Nachdem die T-Zellen einmal mit zehn Milliliter komplettem Medium gewaschen wurden, das Pellet in zwei Milliliter frischem komplettem Medium resuspendieren. Anschließend die Zellen zählen und die Suspension auf eine Konzentration von 0,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in frischem komplettem Medium verdünnen, um sie je nach experimentellen Anforderungen in eine 6- oder 24-Loch-Zellkulturplatte auszusäen. Innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Isolierung die mittels Nylonwollsäule isolierten T-Zellen mit dem geeigneten Stimulus und dem experimentellen Wirkstoff der Wahl aktivieren.

Nach 12 bis 72 Stunden die aktivierten behandelten Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette vorsichtig mischen, um eventuelle Klumpen aufzulösen. Um die Zelldurchmesser mittels automatischem Zellzähler zu messen, eine Milliliter der behandelten Zellen aus jedem Wells in separate Probenbecher überführen und die Probenbecher in das Probencarousel des automatischen Zellzählgeräts stellen. Die Proben-ID und Informationen zum Zelltyp eingeben, um die Proben zu erfassen und mit der Analyse zu beginnen.

Nachdem Trypanblau mit der Zellsuspension vermischt wurde, werden die Zellen über ein Bildgebungs-Feld geleitet, bis etwa 100 Zellbilder von jeder Probe gesammelt wurden. Die Software zeichnet einen Kreis um jede erfasste, mit Trypanblau angefärbte und ungefärbte Zelle, um den Zelldurchmesser zu bestimmen. Sobald alle Zellen gemessen wurden, werden die Daten in eine Tabellenkalkulation exportiert, die die Ergebnisse als Gesamt- und lebensfähige Zellzahlen für jeden gemessenen Durchmesser anzeigt.

Die Daten können anschließend als Histogramme dargestellt werden. Nach zwei Tagen Stimulation mit PMA und Ionomycin wird eine signifikante Verschiebung des Medians der Häufigkeitsverteilung hin zu größeren Zelldurchmessern beobachtet, wobei die Anzahl der T-Zellen mit kleineren Durchmessern entsprechend abnimmt. Bei einer festen Ionomycin-Konzentration von 250 Nanomolar ändert sich der PMA-Effekt nicht signifikant, wenn die Konzentration des Aktivierungsreizes von zwei auf 250 Nanogramm pro Milliliter erhöht wird.

Auch gibt es keinen nennenswerten Unterschied in der beobachteten T-Zell-Proliferation. Calcineurin-Inhibitor-Medikamente hemmen sowohl die T-Zell-Blastogenese als auch die Proliferation teilweise. Die Behandlung von T-Zellen mit immunsuppressiven Verbindungen, die auf den Calcineurin-Kernfaktor aktivierter T-Zellen abzielen, inhibiert die blastogene Antwort um nahezu 72 Prozent.

Rapamycin und FTY720 zeigen moderate, aber statistisch signifikante Effekte auf die Blastogenese. Während TRAM34 offensichtlich die Proliferation muriner T-Zellen selbst bei Konzentrationen von 700 Nanomolar nicht beeinflusst. Wenn Rapamycin und Cyclosporin A zusammen verwendet werden, ist die Blastogenese vollständig inhibiert.

Ähnliche Ergebnisse werden bei murinen T-Zellen beobachtet, die mit anti-CD3- und anti-CD28-gebundenen magnetischen Mikrokügelchen aktiviert wurden. Dieser Test kann erfolgreich zur Quantifizierung der Wirkungen verschiedener immunmodulatorischer Arzneimittel eingesetzt werden und ermöglicht eine genauere Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit im Vergleich zu typischen Proliferationsassays, die auch Beiträge von apoptotischen und nekrotischen Zellen enthalten. Mit dieser Methode können bis zu 15 Proben ein- und ausgeschaltet gemessen werden, wodurch gleichzeitige und anschließende Quantifizierungen sowohl der Blastogenese- als auch der Proliferationsraten möglich sind.

Gelegentlich können Luftblasen in die Durchflusszelle gelangen und die Messung unbrauchbar machen. Daher sollten alle Bilder auf Luftblasen überprüft werden, bevor die Daten aus jedem Versuch zur Analyse akzeptiert werden. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die Messung bei zu viel Verunreinigung in der Probe die Partikel als lebensfähige Zellen interpretieren kann. Mit geeigneten Modifikationen besteht das Potenzial, diesen Assay für die Untersuchung der Zellgrößenänderung in Neutrophilen und Hepatozyten anzupassen.