Name: Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Lernen Sie die schnelle Quantifizierung von T-Lymphozyten-Blastogenese mit einem automatisierten Zellzähler zur Bewertung immunmodulatorischer Wirkstoffe. Diese Methode ermöglicht direkte Einzelzellmessungen.

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Wir danken Lucile Wrenshall für die Nutzung des Plattenlesers, Nancy Bigley für die nützliche Diskussion und Tom Brown für das Geschenk von ICR-Mäusen. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium 1R01AI114804 des National Institute of Allergy and Infectious Diseases und durch WSU Faculty Development Funds (an J.A.K.) finanziert. J.N.G. wurde teilweise durch das National Institute of General Medical Sciences Stipendium R25GM090122 unterstützt.

Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Wright State University Lab Animal Care und Use Committee und Institutional Review Board genehmigt durchgeführt. HINWEIS: Human PBMCs durch das Verfahren Ficoll - Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert werden 5. 1. Spleen Ernte <ol><li> Haus erwachsene weibliche ICR - Mäuse in Standard - Laborbedingungen mit den Lebensmitteln, Wasser und Bettwäsche spezifische Anforderungen im Hinblick auf die Arten. HINWEIS: Die Tiere hatten ein mittleres Alter von 2,9 Monaten und einem Durchschnittsgewicht von 30,4 g zum Zeitpunkt der Euthanasie. </li><li> Am Tag der Isolierung (DOI), einschläfern die Tiere einzeln ohne andere Artgenossen Tiere vorhanden. Machen Sie alle Anstrengungen minimale Belastung auf die Maus zu gewährleisten. Euthanize unter Verwendung von CO 2 mit sekundären Zervikaldislokation Tod zu gewährleisten. <ol><li> Legen Sie das Tier, noch innerhalb der Transfer Käfig, in die CO 2 Kammer und start, um den Gasstrom bei 5 l / min. Diese Strömungsgeschwindigkeit verdrängt Sauerstoff in der empfohlenen 10-30% pro min. </li><li> Nachdem das Tier bewusstlos ist, erhöhen zu 15 l / min , um die CO 2 Durchfluss. Überprüfen Sie das Tier für die Einstellung der Atmung und verlassen in der Kammer für weitere 2 min. </li><li> Die Zugkraft Zervikaldislokation mit Ablenkung Tod zu gewährleisten. </li></ol></li><li> Ernten Sie die Milz aus dem Tier unter aseptischen Bedingungen innerhalb von 10 Minuten des Todes. <ol><li> Sterilisieren zwei Sätze von Scheren und Pinzetten für die Entfernung der Milz in einem Autoklaven Ofen vor der Verwendung. Sterilisieren Sie die Dissektion Oberfläche von 70% Ethanol Anwendung. </li><li> Bewerben 70% Ethanol auf die Maus Bauch. Mit einem Satz von Schere und Pinzette, machen Sie einen Schnitt in der Fell und Haut von der linken Seite des Bauches, dann auseinander ziehen und ziehen Sie die Haut wieder das Peritoneum zu offenbaren. Einmal ausgesetzt, gelten 4% Chlorhexidin-Lösung, bevor das Peritoneum geöffnet wird. </li><li> Mit dem zweiten Satz von scissors und Pinzetten, eine 2- bis 3-cm Schnitt entlang der zentralen Abdomen machen. Öffnen Sie das Peritoneum und entfernen Sie die Milz durch Wegschneiden viszeralen Anlagen und überschüssiges Fett. Legen Sie die Milz in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS). </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Roh-Splenozyten HINWEIS: Führen Sie alle Schritte unter einem Laminar-Flow-Biosicherheitsschrank unter aseptischen Bedingungen. <ol><li> Einweichen der geernteten Milzen in 10 ml deionisiertem sterilem H 2 O für 5 min in einer 10 cm Kulturschale , die Oberflächen Erythrozyten zu lysieren. HINWEIS: Dieser Schritt kann entfallen, wenn die Milz während der Isolierung beschädigt wurde. </li><li> Zum Lösen der Splenozyten, zerquetschen die Milzen zwischen zwei sterilisierte Glasdias (mattiert Seite der Milz zugewandten) über eine frische 10 cm Kulturschale. Mischen mit 10 ml RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 50 IU / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin (nachstehend bezeichnet as vollständiges RPMI). </li><li> Filtern Sie die Zellen durch ein steriles 40 &amp; mgr; m Nylon-Zellsieb in eine neue 10 cm-Kulturschale das Bindegewebe und Schmutz zu entfernen. </li><li> Lysieren die verbleibenden Erythrozyten durch Zugabe von 20 ml RBC - Lyse - Puffer besteht aus 155 mM NH 4 Cl, 10 mM NaHCO 3 und 0,1 mM EDTA bei pH 7,4 und ~ 300 mOsm / L. HINWEIS: Die Osmolalität wird durch einen Gefrierpunkt oder einem Dampfdruck-Osmometer gemessen. <ol><li> Übertragen, um die Zellen von der 10-cm-Platte auf eine 50 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 250 xg für 10 min (4 ° C). </li><li> Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 20 ml RBC-Lyse-Puffer und erneut zu suspendieren die pelletierten Zellen durch Pipettieren. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min unter leichtem Schütteln im Lysepuffer. </li><li> Zentrifuge für 10 min bei 250 xg (4 ° C), um die Zellen zu pelletieren. Gießen Sie den Lysepuffer aus. </li><li> Re-suspendieren Zellen in 10 ml vollständigem RPMI und zentrifugieren wieder (250 xg, 10 min, 4 ° C). Scheibeard den Überstand. </li></ol></li><li> Re-suspend die Splenozyten in 2 ml komplettem RPMI erwärmt auf 37 ° C für die Übertragung auf die Nylonwolle Fasersäule. </li></ol> 3. Reinigung von T-Lymphocyten <ol><li> Waschen Sie die Nylonwolle - Säulen zweimal mit 5 ml komplettem RPMI. Für 1 h in einem 5% CO 2 Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C inkubieren. HINWEIS: Es ist zwingend notwendig, die Nylonwolle wet für die Dauer des Experiments zu halten, und vollständiges RPMI bis 37 ° C für alle Nylonwolle Isolierungsschritte erwärmt zu verwenden. </li><li> Isolated Splenozyten auf die Säule und Inkubation für 1 h die B - Zellen, Fibroblasten zu ermöglichen und akzessorischen Zellen auf die Nylonwolle anhaftet. <ol><li> 2 ml RPMI die Splenozyten in die Spalte enthält, und durchlaufen, bis die Spitze des Nylonwolle erreicht ist. </li><li> 2 ml komplettem RPMI erwärmt auf 37 ° C an der Oberseite des Nylonwolle und führen Sie das Medium durch die Wollebis der Flüssigkeitspegel erreicht die Oberfläche. </li><li> In 3 ml warmem komplettem RPMI auf die Säule vollständig die Nylonwolle abdecken. </li><li> Inkubieren Die beladene Säule ungestört in einem 37 ° C, 5% CO 2 Zellkultur - Inkubator für 1 Stunde. </li></ol></li><li> Eluieren die Zellen durch die Säule zweimal mit 5 ml vollständigem RPMI gewaschen. Führen Sie eine zusätzliche Wäsche der eluierten Zellen durch Zentrifugation. <ol><li> Füllen Sie die Spalte in den oberen 2-mal mit komplettem RPMI und lassen Sie die Lösung in der Säule durch in eine 50 ml sterile konische Röhrchen fließen. HINWEIS: Vermeiden Sie tippen oder die Spalte zu stoßen, die die B-Zellen zu verdrängen können, akzessorischen Zellen und anhaftende Fibroblasten auf die Nylonwolle. </li><li> Sammeln der Durchflussfraktion und Schleudern bei 250 xg für 10 min (4 ° C), um die Zellen zu pelletieren. Wasche einmal mit 10 ml vollständigem RPMI. Pelletieren Sie die Zellen nochmals (250 xg, 10 min, 4 ° C) und resuspendieren in 2 ml des vollständigen RPMI. </li><li> Messen Sie die c<html> ell Dichte unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnt in vollständigem RPMI bis 0,5 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Seed 1 oder 2 ml Aliquots von Zellen in jeder Vertiefung einer 24- oder 6-well Zellkulturplatte, jeweils, und die Kultur der Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2. HINWEIS: 1 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT) kann in diesem Stadium zu jeder Vertiefung gegeben werden, um T-Zell-Überleben zu verbessern. </li><li> Optional: Bestätigen Sie die Effizienz des Isolierungsprotokolls mittels Durchflusszytometrie. Dieses Protokoll normalerweise ergibt ~ 80% T 23 Lymphozyten. HINWEIS: Nylonwolle-gereinigten Zellen enthalten ca. 50% CD4 + und 23% CD8 + -Zellen. Zur Reinigung können die CD4 + und CD8 + Subpopulationen weiter eine einzelne immunomagnetischen Abreicherungsschritt werden 24 durchgeführt unter Verwendung von acht Antikörper und magnetischen Kügelchen. Alternativ reineren CD4 + und CD8 + T-Zellpopulationen können durch positive oder negative Selektion mit spezifischen Antikörpern isoliert werden. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Die Aktivierung von T-Lymphozyten und experimentelle Arzneimittelexposition <ol><li> Aktivieren T - Lymphozyten innerhalb von 24 h von der Isolation durch Zugabe von PMA und Ionomycin Calciumsalz oder magnetische Beads , beschichtet mit anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper 23,25,26. In experimentellen Medikamente (zB Ciclosporin, FK506, Rapamycin, TRAM-34, und FTY720) zum Zeitpunkt der Aktivierung. HINWEIS: Hier variiert PMA Konzentrationen von 2 bis 250 ng / ml und die Konzentration Ionomycin wurde bei 250 nM gehalten. Wenn möglich, Verdünnungen sollten ab Lager Aliquots jeder Droge hergestellt werden, so dass das Volumen jeder Vertiefung Zellen gegeben ≥1 ul ist die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Verhältnis 1 bead-to-cell: Die anti-CD3 / anti-CD28-beschichteten magnetischen Kügelchen werden in einem 1 zugegeben. Erhöhung der Anzahl der Kügelchen pro Zelle (dh der Wulst-zu-Zell - Verhältnis) wird die Intensität der Stimulation 25,26 erhöhen. Die Kügelchen werden gewaschen und in komplettem RPMI vor ihrer Zugabe zu den Zellen resuspendiert. Man beachte, daß Trypanblau färbt die Perlen. </li><li> Kultur die Zellen für 12-72 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2 , bevor sie mit der automatisierten Zellzähler zu analysieren. </li></ol> 5. Automatische Zellzähler Datenerfassung <ol><li> Bevor die Probe ausgeführt wird , stellen Sie sicher , dass die Zellen mit einer serologischen Pipette vorsichtig gemischt werden Klumpen zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig für aktivierte Lymphozyten aufgrund ihrer erhöhten Klebrigkeit. <ol><li> Für Kulturen, die mit anti-CD3 / CD28-Perlen, nach dem Pipettieren aktiviert werden, übertragen Sie die Probe in ein 1,5 ml oder 2 ml Zentrifugenröhrchen. Trennen Sie die Perlen durch auf einem Magneten das Rohr zu halten für 1-2 min. Verwenden Sie den Überstand der Zellen für die Analyse enthält. HINWEIS: Analysieren sowohl ruhenden und aktivierten Zellen innerhalb 1 Stunde für jede Voraktivierung der ruhenden Zellen von anwesenden Medium in dem Kulturserum zu berücksichtigen. Nach 12 h PMA / Ionomycin - Stimulation, eine kleine Zunahme in der Zellgröße nachweisbar war (Abbildung 2 </strong&gt;). Bei 72 h, keine signifikante Erhöhung der Zellgröße im Vergleich zu 48 Stunden beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). </li></ol></li><li> 1 ml der Zellsuspension in ein Probengefäß und führen Sie es durch die automatisierte Zellzähler gemäß den Anweisungen im Handbuch. HINWEIS: Für jeden der Versuche, ein Minimum von 1 ml (maximal 2 ml) der Zellkultur verwendet werden soll. Die automatisierten Zellzähler verwendet eine Spritze Trypanblau mit der Zellsuspension zu mischen und übergibt die zell Trypanblau Mischung über einen Bereich, der abgebildet wird, und von der Software analysiert. Die Software erkennt Trypanblau gefärbten Zellen, zieht einen Kreis um jede Zelle, und bestimmt den Durchmesser. 100 Bilder werden von jeder Probe gesammelt, und die Lebensfähigkeit der Zellen und Größen bestimmt werden. Die Detektionsschwelle der Zählerzelle verwendet hier eine untere Grenze von 5 &amp; mgr; m. </li><li> Übertragen von Daten von jedem zur weiteren Analyse in ein Tabellenkalkulationsprogramm auszuführen. </li><li> Kalibrieren Sie das Gerät in regelmäßigen Abständen mit einer 1ml Probe von 6 &amp; mgr; m und 8 &amp; mgr; m Durchmesser Polystyrolkügelchen. HINWEIS: Die tatsächlichen Perlengrößen vom Hersteller für jede Charge gemessen werden soll, nicht die Nennweite. 6 und 8 &amp; mgr; m Kügelchen sind praktisch , da diese Durchmesser nahe an den erwarteten Durchmesser von ruhenden und aktivierten T - Zellen (siehe Abbildung 1) sind. </li></ol> 6. Daten und statistische Analyse <ol><li> Analysieren Sie die Daten geeignete statistische und grafische Darstellungen Software. HINWEIS: Die Tabelle für jeden Lauf enthält die Anzahl der Zellen, die mit jedem Durchmesser (Bereich: 5 &amp; mgr; m bis 70 &amp; mgr; m). Die Zellen über einem 17 um Durchmesser werden aus der Analyse entfernt Staubpartikel und kleine Bläschen auszuschließen, die als lebende Zellen durch das Instrument gelesen werden kann. </li><li> Führen Hypothese zu testen Welch-t-Test für Datensätze mit ungleichen Varianz; Ergebnisse sind statistisch signifikant, wenn p &lt;0,001 betrachtet. Die Formel verwendet wurde, <img alt = &quot;Gleichung 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55212 / 55212eq1.jpg&quot; /&gt; woher <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq2.jpg" /> und <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq3.jpg" /> Probenmittel, <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq4.jpg" /> und <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq5.jpg" /> Abweichungen sind Probe und <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq6.jpg" /> und <img alt="Gleichung 7" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq7.jpg" /> sind Stichprobengrößen für jeden Datensatz. Die Anzahl der Freiheitsgrade für jeden Vergleich mit dem kleineren der beiden Probengrößen konservativ geschätzt. Balkendiagramme sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. </li></ol> 7. Milz-T-Lymphozyten-Proliferations-Assay <ol><li> Messung der T-Zellproliferation eine MTS- oder MTT-basierten kolorimetrischen Plattenleser Proliferationstest verwendet. HINWEIS: Der Test ist Basisd auf MTS Tetrazoliumverbindung (Owen-Reagenz) Reduktion auf löslichen Formazanprodukts, wahrscheinlich durch NADPH oder NADH in metabolisch aktiven Zellen durch Dehydrogenaseenzyme produziert. </li><li> Zählen gereinigt T - Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren sie in vollständigem RPMI-1640 zu einer endgültigen Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml. HINWEIS: 1 mM DTT kann an die Zellen in diesem Stadium zugegeben werden. </li><li> Aktivieren Sie die Zellen mit PMA und Ionomycin mit Test Drogen zusammen, falls erforderlich, und vorsichtig mischen (ähnlich zu Schritt 4). </li><li> Platte 100 ul der Zellen in jede Vertiefung einer 96-well Zellkulturplatte behandelt und mit 5% CO 2 für 48 Stunden bei 37 ° C inkubieren. 100 l RPMI-1640-Medium ohne Zellen in einem gut eine Lesung der Hintergrundabsorption zu erhalten. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l MTS-Reagens in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 4 Stunden. </li><li> Nehmen Sie Absorptionsmessungen bei 490 nm einen Plattenleser. die absorbance Messungen entsprechen der Anzahl der metabolisch aktiven Zellen in jeder Vertiefung. HINWEIS: Ziehen Sie den Hintergrundwerten, wenn nötig. Die Hintergrundabsorptionswerte sind abhängig von der Art des Kulturmedium, Serum, externe pH und die Dauer der MTS-Reagens Belichtung. MTS-basierte Reagenzien sind lichtempfindlich, und die Belichtung für mehrere Stunden Licht kann in höheren Hintergrund Absorptionswerte zur Folge haben. </li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier beschreiben wir eine Technik zum schnellen Nachweis und zur Quantifizierung von T-Zell-blastogenen Transformation eines automatisierten Zellzähler verwendet wird. Unter unseren Bedingungen (250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin-Stimulation) wurde die Zellfläche zweifach und das Volumen dreifache nach 48 Stunden der Aktivierung erhöht. Der Test ist ausreichend sensitiv Strahlen während der ersten 12 Stunden der Aktivierung zu erkennen, wo das Zellenvolumen 1,25-fache im Vergleich zu ruhenden (2D) nur erhöht. Eine physiologisch relevanten Mechanismus der T-Zell - Aktivierung mit Anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen eine signifikante blastogenen Reaktion mit durchschnittlich 2,3-fachen Anstieg im Volumen (72 h nach der Aktivierung, Figur 3D). Menschliche mononukleäre Zellen zeigten eine 2,6-fache Volumenänderung auf PMA / Ionomycin - Stimulation für 48 Stunden (Abbildung 4). Die ICR-Maus Milz-T-Zellen mittleren Durchmesser und Volumen bestimmt werden6,9 &amp; mgr; m und 1,9 x 10 -4 nl, respectively. Menschlichen PBMCs (von einem gesunden Spender) hatten einen mittleren Durchmesser von 7,7 um und ein durchschnittliches Volumen von 2,7 x 10 -4 nl. Unter Verwendung dieses Protokolls, testeten wir auch Konzentrationen von PMA auf ihre Fähigkeit hin zunehmende T-Zellen zu aktivieren. Diese Single-Cell-Ergebnisse waren konsistent mit Proliferationsassays bei ähnlichen PMA-Konzentrationen durchgeführt. Mehrere Verbindungen wurden zu beeinflussen Zellproliferation berichtet getestet: FTY720 31,32; die Immunsuppressiva Cyclosporin A, FK506 und Rapamycin 27,28; und TRAM-34, ein Blocker des Kalzium-aktivierten KCa3.1 Kanäle 33,35. Wir fanden heraus, dass bei den getesteten Konzentrationen, die potentesten Inhibitoren der Blastogenese waren CsA und FK506. Rapamycin hatte eine kleinere, aber statistisch signifikante unterdrückende Wirkung auf blastogenesis. TRAM-34, auf der anderen Seite, hatte keinen Einfluss auf blastogenesis. CsA unterdrückt sowohl blastogenesis und proliferation, aber nicht vollständig (2B und 2C), dass die automatisierte Zellzähler Messung demonstriert ist eine gute Korrelat der Arzneimitteleffizienz in T-Zell - Proliferation. In Gegenwart von Rapamycin mit CsA wurde Blastogenese vollständig gehemmt, was darauf hindeutet , dass NFAT- und mTOR-vermittelte Wege in Kombination vollständig für die Erweiterung T-Zelle auf mitogene Stimulation mit PMA / Ionomycin (3C) erklären kann. Der Dynamikbereich von einigen Proliferationsassays ist begrenzt (siehe Abbildung 2). Proliferationsassays, wie das, was wir (2C) verwendet haben, berichten von einem Signal , das Beiträge von apoptotischen und nekrotischen Zellen enthält. Automatisierte Durchmesser Änderungsmessungen haben nicht diese Beschränkung, da die Messungen an lebenden Zellen beziehen sich nur. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch den Ausschluss von Trypanblau-Färbung von gesunden, lebenden Zellen untersucht. In Größenmessungen, mit nach vornLichtstreuung in der Durchflusszytometrie Diskriminierung Dublette Zelle kann 22 problematisch sein. Bei der automatisierten Zellzähler Messungen wurde keine Dublette Population gefunden (Abbildung 1). Außerdem war die Messung hinreichend genau zwischen den Wirkungen von 100 und 200 nM Cyclosporin (Tabelle 1) und zur Erkennung Blastogenese innerhalb von 12 h von mitogener Stimulation (2D) zu unterscheiden. Dieser neue Test ist besonders nützlich für eine kleine Anzahl von Proben. Bis zu 15 Proben in 1 Stunde gemessen werden. Jedoch hat der Test seine Grenzen, von denen die meisten gemildert werden kann. Auch wenn es effektiv klein (&lt;1 &amp; mgr; m) Unterschied in der Zelldurchmesser lösen können, wir das Maschinenmodell verwendet wird, hat eine untere Nachweisgrenze von 5 um. Diese Grenze kann die Überschätzung von sehr kleinen Zellgrößen verursachen, da es effektiv alle Zellen mit kleinerem Durchmesser ausschließt. Doch neuere Modelle der Zellzähler haben Erkennung dreschenolds von ~ 2 um, die dieses Problem lindern soll. Wenn es in der Probe zu viel Schmutz ist, behandelt das Instrument sie als lebensfähige Zellen. Darüber hinaus können Luftblasen erhalten gelegentlich in die Flußzelle und verursachen eine Verzerrung der Zellbildern von der Maschine erfasst. Die Verzerrung scheint nicht die Lebensfähigkeit zu beeinflussen, aber es kann die gemessenen Durchmesser beeinflussen. Daher wird empfohlen, dass alle Bilder vom Experimentator für Luftblasen überprüft werden, bevor die Daten aus jeder Studie zur Analyse angenommen. Da nur die Software Kreise um die Zellen zieht, Durchmesser von nicht kugelförmigen Zellen können in Richtung der Längsachse versetzt sein, so dass der Test weniger geeignet für nicht-sphärische Zellen. Dieser Test ist schnell, ca. 4 min pro Probe nehmen, im Vergleich zu Proliferationsassays, die ein paar Stunden benötigen. Die Datenerfassung ist auch ziemlich einfach, die Software mit dem Gerät enthalten werden. Die Software kann Messdaten zu einem sp exportierenreadsheet für die Analyse. Schließlich ist es eine Einzelzelle, als eine Population, die Messung gegenüberliegt; sowohl Blastogenese und Proliferation gemessen werden; und es unterscheidet zwischen lebensfähigen und toten Zellen gleichzeitig. Es kann eine Immunantwort zu verwendet werden, um verschiedene Mausstämme für ihre Fähigkeit zu bewerten. Der Assay kann auch erfolgreich für die Messung der Blastogenese in T - Zellen aus menschlichen Spendern (Abbildung 4), und es kann auch in anderen Zelltypen verwendet werden , verwendet werden. Zellvolumen erhöht sich bekannt sind für die Regulierung des Metabolismus beitragen: Zellschwellung stimuliert die Synthese und Lipogenese in 36,37 Hepatozyten Glutamin-induzierte Glykogen. Neutrophile zeigen Migration assoziierte Volumensteigerungen von 35 bis 60%, während die chemotaktische Mittel 10-15% Schwellung 38-40 induzieren. Der aktuelle Assay kann möglicherweise diese Prozesse zu untersuchen verwendet werden.

T-Lymphozyten sind die primären Zellen verantwortlich für die adaptive Immunität bei Säugetieren. Es ist bekannt, dass sie auf spezifische antigene Peptide präsentiert durch MHC-Moleküle auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen reagieren. Bei Aktivierung eines kognaten T-Zell-Rezeptor (TCR), vergrößert sich die Zelle in einem Prozess blastogenen Transformation bezeichnet, oder Blastogenese. Dieser Prozess ist in der ersten ~ 6 Stunden nachweisbar nach dem Stimulus 1 angewendet wird. Während blastogenesis erhöhen sich die Volumina der einzelnen T - Zellen 2- bis 4-fach 2-6. Lymphocyten beginnen, in einem Verfahren zur Proliferation eine klonale Expansion genannt, deren Zweck es ist, so viele Klone der Antigen-spezifischen TCR-tragenden Zellen wie möglich zu erzeugen. Die Nachkommenzellen ausüben dann ihre immunologische Funktion durch Differenzierung in zytotoxische (CD8 +) oder Helfer (CD4 +) Effektor - T - Lymphozyten. Somit sind naive T - Lymphozyten in menschlichem oder Maus Blut in der G 0 (Ruhe) Phase des ZellZyklus und Unterstützung minimale metabolische Aktivität. Bei Einwirkung von Antigenen oder Mitogenen, erneut eingeben T - Zellen in den Zellzyklus, mit einer gleichzeitigen Stimulation der Transkription und Proteinsynthese 7-10. Mitogene, wie Phorbol - 12-Myristat - 13-acetat (PMA) und Ionomycin die Lymphozyten durch die Aktivierung von Proteinkinase C (PKC) und Ca 2+ -abhängigen Signalwege 1 stimulieren. Die Aktivierung von T-Zellen mit PMA / Ionomycin umgeht die TCR Signalisierungsschritte. In - vitro - Proliferationsassays sind zum Zweck der Bewertung der Lymphozytenfunktion und die Reaktion auf Reize verwendet. Proliferation Ablesungen werden typischerweise ein bis drei Tage nach dem Beginn der T-Zell-Stimulation und reflektieren den kollektiven Zustand von Hunderten oder Tausenden von Zellen aufgenommen. Die Wirksamkeit von verschiedenen Mitogenen und immunmodulatorische Arzneimittel in vitro kann durch einfaches Messen Proliferationsraten in Gegenwart dieser Verbindungen beurteilt werden. Einige dieser assays und ihre Grenzen werden nachstehend erörtert. Für die direkte Zellzahl Zählen ist das Verfahren zeitaufwendig, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit von Bedienungsfehlern. Für die DNA-Synthese mißt der 3H-Thymidin-Einbau-Assay der DNA-Synthese, aber die Hauptbeschränkung ist die Radiotoxizität. Eine nicht-radioaktive Alternative ist BrdU, aber der Bereich der Linearantwort für das Zellwachstum ist begrenzt, und die Antikörperbehandlung erforderlich, was die Anzahl der Schritte in dem Verfahren 11,12 erhöht. Für die Stoffwechselaktivität, Tetrazoliumsalze (MTT, MTS, XTT und WST-1) und Resazurin farbstoffbasierte kolorimetrische Assays berichten die allgemeine Stoffwechselzustand von Zellpopulationen unterteilen. Jedoch ist MTT in dem Kulturmedium nicht löslich ist, zusätzliche Waschschritte erforderlich sind, wodurch Fehler bei der Messung enthält; XTT benötigt zusätzliche Komponenten effizient zu reduzieren; MTS-, WST-1- und Resazurin-basierten Messungen beeinflussened von dem Kulturmedium pH - Wert und seine Komponenten Serum, Albumin oder Phenol - Rot 13-16. Diese Assays messen nicht die tatsächliche Anzahl von lebensfähigen Zellen, sondern schätzen die kombinierten Enzymaktivitäten. Daher kann nicht der Proliferationsrate genau durch metabolische Assays bestimmt werden , da der nicht-lineare Korrelation zwischen der Zellzahl und Farbstoffreduktion 12,17. Zur Messung der ATP-Konzentration, T-Zell-Aktivierung induzierte Erhöhungen der ATP korrelieren mit Proliferation. Jedoch Erhöhung der intrazellulären ATP ist einer der ersten Schritte der T-Zell-Aktivierung; viele Schritte hinter die tatsächliche Verbreitung 17,18. Für Farbstoffdilution Assay Farbstoff CFSE Fluoreszenzfarbstoffen Zellen durch intrazelluläre Proteine ​​kovalent zu binden. Der Farbstoff zeigt einen Proliferation abhängige Abnahme der Fluoreszenzintensität, welche die Anzahl der Zellteilungen verfolgen können. Aufgrund der kovalenten Proteinmarkierung, die Funktionen dieserProteine ​​können beeinträchtigt werden. Der Farbstoff ist toxisch für die Zellen bei höheren Konzentrationen. Bei niedrigeren Farbstoffkonzentrationen jedoch die anfängliche Fluoreszenzintensität verringert wird, die Anzahl der Zellteilungen abnimmt, die verfolgt werden können. Außerdem nach Markierung mit CFSE, gibt es eine proliferations unabhängige ~ 50% Verlust der anfänglichen Fluoreszenz während der ersten 24 bis 48 Stunden - Zeitraum, der den dynamischen Bereich des Assays 19,20 begrenzt. Die meisten dieser Assays spiegeln den kollektiven Zustand einer großen Anzahl von Zellen und erfordern die Behandlung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen. Nekrotische und apoptotische Zellen dieser Messungen könnte auch dazu beitragen, sofern sie nicht aus der Analyse entfernt werden, indem sie mit Chemikalien oder Antikörpern Anfärbung. Lymphozytenblastogenese kann durch eine Vielzahl von Verfahren, wie beispielsweise optische Mikroskopie oder Durchflußzytometrie 4,21,22 ausgewertet werden. Hier haben wir ein schnelles Verfahren zur Messung von T-Zellengrößen beschreiben eine Verwendungn automatisierten Zellzähler, der Echtzeit-Zell Bilder sammelt, die gespeichert und können zu einem späteren Zeitpunkt erneut analysiert werden. Neben Größenmessungen liefert diese Vorrichtung präzise Zellzahlen und den Prozentsatz von lebensfähigen Zellen, bestimmt durch Trypan-Blau-Färbung Ausgrenzung. Das Gerät in diesem Protokoll verwendet wird, ist im Handel erhältlich, und der Hersteller getestet, um die Genauigkeit des Instruments mit drei verschiedenen Instrumenten und mehrere Konzentrations und Lebensfähigkeit Kontrollen. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten einen Variationskoeffizient, der im allgemeinen unter 6% liegt. Wie im Protokoll erwähnt, wird das Gerät mit 6 &amp; mgr; m auf einer regelmäßigen Basis geeicht und 8 um Durchmesser Polystyrolkügelchen. Die Vorteile der Verwendung eines Zellzählers unter Verwendung von ruhenden T-Zellen und T-Lymphoblasten basierend auf Zelldurchmesser zu unterscheiden, ist die einfache Bedienung und das automatische Art der Analyse. Die Software ist in der Lage einen Kreis um jede Zelle Zeichnung und der Zelldurchmesser zu berechnen. Zusätzlich kann die imAlter sind für den Bediener sichtbar, die die Zellen zu identifizieren und richtig Zeichnen eines Kreises um sie herum die Genauigkeit des Geräts überprüfen können. In Bezug auf die Einschränkungen, kann das Gerät nicht per se unterscheiden zwischen Schutt und Zellen; Daher ist es wichtig, daß die Bedienungsperson jedes Bild betrachtet, wie es verarbeitet wird. Es gibt ein Potential für Luftblasen enthält, die die Anzahl von verwendbaren Felder zur Analyse abnimmt; dies ist jedoch selten, wenn die regelmäßige Spülung Wartung durchgeführt wird. In dieser Studie wurden Gruppen von Milz-T-Lymphozyten wurden mit Ionomycin stimuliert und Konzentrationen von PMA für 12-48 h erhöht. PMA Konzentrationen so niedrig wie 2 ng / ml induziert sowohl eine robuste blastogenen Reaktion und eine signifikante Proliferation. Messungen der Wirkungen mehrerer Drogen, wie beispielsweise die Immunsuppressiva Cyclosporin A (CsA), FK506 (Tacrolimus) und Rapamycin (Sirolimus), sowie Ionenkanalblockern TRAM-34 und FTY720 (fingolimod), auf blastogenesis zeigten eine gute Übereinstimmung mit berichteten Auswirkungen auf die Proliferation. Die blastogenen Reaktion menschlicher PBMCs zu PMA / Ionomycin und murine T-Zell-Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper-beschichteten magnetischen Perlen wurden ebenfalls gemessen. Der Zellenzähler Assay sowohl Blastogenese und die Proliferationsrate (Zelldichte) gleichzeitig aber separat, im Gegensatz zu den oben genannten Verfahren quantifiziert, die in einer Kombination dieser Effekte aus. Das vorgestellte Protokoll stellt eine schnelle und robuste Technik für die Wirksamkeit von mitogenen und immunmodulatorischer Wirkstoffe zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M Nylon-Zellsiebe&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Säulen aus Nylonwolle</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td>21759-1</td><td></td></tr><tr><td>konische Röhrchen mit 50 ml&nbsp;</td><td>Das Labordepot</td><td>TLD431697</td><td></td></tr><tr><td>mit 6-Well-Zellkulturen behandelte Platten</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Zellkulturplatten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Zellproliferationsassay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS-basierter Assay</td></tr><tr><td>Cyclosporin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>104987-11-3</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3504</td><td></td></tr><tr><td>TRAM-34</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6700</td><td></td></tr><tr><td>FTY720</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0700</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Maus T-Aktivator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA)&nbsp;</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>356150010</tr><tr><td>Ionomycin-Calciumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN1670049</td><td>100x Aktien</td></tr><tr><td>Dulbecco' s phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30378.02</td><td>10x Stamm</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>12/3/3483</td><td>Reduktionsmittel</td></tr><tr><td>8 & Mikro; M Mikropartikelgröße Standard&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84192-5ML-F</td><td>Tatsächlich&nbsp; 8.02 &Mikro; M</td></tr><tr><td>6 & Mikro; M Mikropartikelgröße Standard&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89756-5ML-F</td><td>Aktuell 6.084 &micro; m</td></tr><tr><td>Einzelner magnetischer Trennständer für 1,5 - 2 ml Röhrchen</td><td>V& P Scientific, Inc.</td><td></td><td></td>VP772F5</tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Hybrid-Lesegerät&nbsp;</td><td>Bio Tek</td><td>BTH1M</td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL Analysator für die Zellviabilität&nbsp;</td><td>Beckman Schar</td><td>731050</td><td></td></tr></tbody></table>

schnelle quantifizierung von mitogen-induzierte blastogenese in t-lymphozyten zur identifizierung von immunmodulatorische drogen

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocytenvermehrung als Reaktion auf antigen oder mitogene Stimulation ist ein leicht quantifizierbare Phänomen nützlich zum Testen von immunmodulatorischen (dh immunsuppressive oder immunstimulatorischen) chemischen Verbindungen und Biologika. Einer der ersten Schritte bei der Mitogenese ist Zellvergrößerung oder blastogenen Transformation, wobei das Zellvolumen erhöht sich vor der Teilung. Es ist normalerweise nachweisbar in den ersten Stunden der T-Lymphozyten-Stimulation. Hier beschreiben wir ein schnelles Verfahren Blastogenese in T-Lymphozyten von Mäusen die Milzen und menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines automatischen Zellzählers isoliert zu quantifizieren. Verschiedene üblicherweise verwendete Proliferationsassays zum größten Teil sind aufwendig und beziehen sich nur die Gesamtpopulation Wirkung anstatt einzelne zelluläre Effekte innerhalb einer Population. Im Gegensatz dazu liefert die präsentierte automatische Zellzähler Assay eine schnelle, direkte und präzise Messungen der Zelldurchmesser, die sein kannzur Bewertung der Wirksamkeit der verschiedenen Mitogenen und immunmodulatorische Arzneimittel in vitro eingesetzt.

Wir haben diesen Test Lymphozyten Explosion Bildung während der Stimulation mit PMA, einem Phorbolester und Ionomycin, einem Calciumionophor zu vergleichen. Figur 1A zeigt die Häufigkeitsverteilung von Durchmessern von Rast- und pharmakologisch aktivierten Milz - T - Zellen. Die Behandlung von Zellen mit PMA / Ionomycin für ~ 2 Tage führte zu einer deutlichen Verschiebung der Median der Verteilung zu größeren Durchmessern (siehe zum Beispiel Referenz 4). Die Anzahl von Zellen mit kleineren Durchmessern wurde entsprechend reduziert. Um festzustellen , dass unser Gerät die richtigen Durchmesser berichtet, führten wir zwei Kalibrierungen mit Polystyrolkügelchen von 6 &amp; mgr; m und 8 &amp; mgr; m Durchmesser (siehe Materialien Tabelle). 1B und 1C zeigen Messungen von aktivierten T - Zellen überlagert mit einem 8 &amp; mgr; m - Standard und ruht mit einem 6 &amp; mgr; m - Standard überlagert T - Zellen. Zahl1D zeigt die Größen Kontrollbead vom Hersteller angegeben , gegen die mittlere Durchmesser aufgetragen mit unseren automatisierten Zellzähler gemessen. Es zeigte sich, daß die 6 &amp; mgr; m Grße leicht in unseren Messungen überschätzt wurde, wahrscheinlich aufgrund der Messschwelle des Instrumentes mit einer unteren Grenze von 5 um. Allerdings war die Standardabweichung der Wulstdurchmessern von den Zellenzähler Messungen berechnet in Übereinstimmung mit der Standardabweichung vom Hersteller angegeben. Wir schließen aus diesen Experimenten, daß diese Vorrichtung zuverlässig Rast- und Mitogen-stimulierten Maus-T-Zellgrößen zu vergleichen, verwendet werden kann und dass die Vorrichtung die tatsächliche Zelldurchmesser genau messen kann. Wir gingen dann auf PMA-Konzentration, die die Abhängigkeit des mittleren Durchmesserzunahme zu testen und festgestellt, dass bei einer festen Ionomycin Konzentration von 250 nM wurde die PMA-Effekt nicht signifikant durch Erhöhen der Konzentration f geändertROM 2 bis 250 ng / ml (Abbildung 2A). Mit dem MTS-basierten Assays, gemessen wir T-Zell - Proliferation bei 50 und 250 ng / ml PMA und fand keinen nennenswerten Unterschied (2C), in Übereinstimmung mit unseren Zelldurchmesser Daten. Die Calcineurin - Inhibitor Arzneimittel Cyclosporin A (300 nm) und FK506 (1 nM) unterdrückt sowohl Blastogenese (2B) und die Proliferation (Figur 2C). Die Hemmung wurde nicht komplett in beiden Fällen jedoch. Messungen durchgeführt 12 h nach der PMA / Ionomycin Zugabe einer 7,2% und 6,8% Zunahme des Durchmessers für 50 ng / ml und 250 ng / ml PMA zeigte, bzw. (2D). Größe erhöht sich bei diesen beiden Konzentrationen waren nicht signifikant unterschiedlich, wie es der Fall für 48 Stunden Stimulation war (vergleiche 2A). Die Zelldurchmesser von Daten aus ruhenden und aktivierten T-Zellen nach 48 Stunden von PMA / Ionomycin Stimulation gesammelt werden zusammengefasst in <strong&gt; Tabelle 1. Die mittlere Oberfläche und Volumen von ruhenden ICR - Maus Milz - T - Zellen wurden 151,4 &amp; mgr; m 2 und 1,9 x 10 -4 nl, respectively. Die mittlere Oberfläche und Volumen von aktivierten T - Zellen wurden 300,6 &amp; mgr; m 2 und 5,9 x 10 -4 nl, respectively. Die durchschnittliche Gesamtdurchmesserzunahme für alle aktivierten Zellen war 40,92% (Tabelle 1). Wir testeten auch andere chemische Verbindungen berichtet immunsuppressiv sein: CsA, FK506, Rapamycin, FTY720 und TRAM-34. In 3 wird in ruhenden und aktivierten T - Zellen in Abwesenheit und Gegenwart dieser Medikamente Zellgrößenmessungen gezeigt werden erhalten. CsA und FK506, die die Calcineurin-abhängigen Kernfaktor von aktivierten T - Zellen (NFAT) 27,28 Target, waren die wirksamsten, die blastogenen Antwort um nahezu 72% (3A und 3B) verhindert wird . Interessanterweise miterhöht PMA Konzentrationen, sank die Wirksamkeit von CsA und FK506 leicht, obwohl es keine zusätzlichen Zelldurchmesserzunahme in der Abwesenheit dieser Medikamente (2A und 2B) war. Rapamycin, ein Immunsuppressivum , das 29,30 mammalian target of rapamycin (mTOR) hemmt, hatte eine moderate , aber statistisch signifikante Wirkung (3A, 3B und 3C). FTY720 ist ein Sphingosin - 1-Phosphat - Rezeptor - Agonist, der 31 - Lymphozyten - Austritt in den Verkehr hemmt und wurde vor kurzem in T - Lymphozyten 32 zu hemmen TRPM7, einen Kationenkanal stark exprimiert gefunden. Sowohl FTY720 und Rapamycin hatte eine vergleichbare Wirkung auf die Blastogenese, es aus dem Durchschnitt einer 52% Zunahme des Durchmessers auf ungefähr 34% zu reduzieren (3A und 3B). TRAM-34 ist ein Blocker des Kalzium-aktivierten Kaliumkanal KCa3.1 33. Getestet bei 700 nM, TRAM-34 war in Maus-T-Zellen unwirksam, in gemäß einer aktuellen menschlichen T-Zellproliferationsstudie; seine Wirksamkeit kann von der Art und Stärke der mitogenen Stimulation 34 (3A und 3B) abhängen. 700 nM TRAM-34 wirksam war in KCa3.1 Kanäle in unserer Patch-Clamp-Elektro Experimente blockiert (Daten nicht gezeigt). Dieser Vergleich wurde zwischen Ruhe- und Drogen-exponierten Zellen in mehreren Studien im selben Experiment bei 48 Stunden hergestellt. Wenn Rapamycin und CsA zusammen verwendet wurden, war Blastogenese vollständig inhibiert (Abbildung 3C). Aktivierung von Maus - T - Zellen mit anti-CD3 / anti-CD28-beschichteten magnetischen Kügelchen für 72 Stunden erzeugte eine 27% Erhöhung des durchschnittlichen Durchmessers, der bis zu 5% in Gegenwart von CsA (Abbildung 3D) reduziert wurde. Menschliche mononukleäre Zellen auf PMA / Ionomycin-Aktivierung für 48 Stunden erhöht im Durchmesser um 33%, und die Aktivierung in Gegenwart von CsA verringert, um die Reaktion auf 23% ( <strong&gt; 4). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig1.jpg" /> Abbildung 1: Häufigkeitsverteilungen von murinen Milz - T-Zellen - Durchmesser. (A) Schwarz Spalten zeigen Ruhe- und roten Säulen zeigen PMA / Ionomycin-aktivierten (48 h) Zellen. (B) Verteilungen von aktivierten T - Zellen der Milz überlagert auf einer 8 &amp; mgr; m Partikelgröße Kalibrierungsstandard. (C) Ausschüttungen eines 6 um Kalibrierungsstandard überlagert ruhenden T - Zellen. Die Zahl der Zellen und Kügelchen verwendet werden in Boxen angezeigt. (D) Mediandurchmesser durch den Zellenzähler gemessen aufgetragen gegen den Wulstdurchmesser vom Hersteller angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> innerhalb-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig2.jpg" /> Abbildung 2: Abhängigkeit der murine T-Zell - Aktivierung auf PMA - Konzentration. (A) mittleren Durchmessern von T - Zellen entweder unbehandelt oder behandelt mit 2, 50 und 250 ng / ml PMA zu einem festen Ionomycin Konzentration (250 nM). (B) Zellzähler Messungen von ruhenden und aktivierten (2, 50, 250 ng / ml PMA) T - Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von 300 nM CsA oder 1 nM FK506. (C) MTS - Proliferationstest bei 50 und 250 ng / ml PMA mit 250 nM Ionomycin in Abwesenheit und Gegenwart von 300 nM CsA. Signifikante Unterschiede (p &lt;0,001) werden mit einem Sternchen gekennzeichnet. n ist die Gesamtzahl der Prüfungen. Daten sind aus Zellen isoliert aus 3 Mäusen. (D) Zelldurchmesser von ruhenden und aktivierten T - Zellen (250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin) 12 Stunden nach der Aktivierung in der Abwesenheit und Anwesenheit von 300 nM CsA.<html> pload / 55212 / 55212fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig3.jpg" /> Abbildung 3: Wirkungen von CsA, FK506, FTY720, Rapamycin und TRAM-34 auf die Zellgröße. (A und C) mittlere Durchmesser von Rast- und PMA / Ionomycin-aktivierten murinen T - Zellen in Abwesenheit und Anwesenheit von Drogen. Die Konzentrationen werden in der Box gezeigt. (B) Daten von A ausgedrückt als die prozentuale Steigerung gegenüber dem ruhenden T-Zellen - Durchmesser. Lymphozyten-Aktivierung wurde mit 250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin durchgeführt, und die Messungen wurden nach 48 Stunden entnommen. (D) Zellzähler Messungen der Rast- und anti-CD3 / CD28-aktivierten T - Zellen, 72 Stunden nach der Aktivierung in der Abwesenheit und Anwesenheit von 300 nM CsA.rge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig4.jpg" /> Abbildung 4: Blastogenese in humanen PBMCs auf Mitogenstimulation. (A) Schwarz Spalten zeigen Ruhe- und roten Säulen zeigen aktivierte PBMCs. (B) mittlere Durchmesser von ruhenden und aktivierten PBMCs in Abwesenheit und Gegenwart von 300 nM CsA. Zellen wurden mit 250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin aktiviert, und die Messungen wurden nach 48 Stunden der Aktivierung genommen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> column1 </td><td> ruhend </td><td> Aktiviert </td><td> CsA 100 nM </td><td> CsA 200 nM </td></tr><tr><td> Durchschnittliche Durchmesser </td><td> 6,94 &amp; mgr; m </td><td> 9,78 &amp; mgr; m </td><td> 8,19 &amp; mgr; m </td><td> 7,92 &amp; mgr; m </td></tr><tr><td> Durchschnittliche Zunahme des Durchmessers </td><td></td><td> 40.92% </td><td> 17.88% </td><td> 14.09% </td></tr><tr><td> Durchschnittliche Fläche </td><td> 151,37 um² </td><td> 300,61 um² </td><td> 210,56 um² </td><td> 197,22 um² </td></tr><tr><td> Durchschnittliche Zunahme der Oberfläche </td><td></td><td> 98.59% </td><td> 39.00% </td><td> 30.16% </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung der mittleren Zelldurchmesser und der relativen Zunahme der Oberfläche. Die Messungen wurden mit 250 ng / ml PMA und 250 nM Ionomycin 48 Stunden nach der Aktivierung durchgeführt.

T-Lymphozyten-Mitogenese geht mit einer blastogenen Transformation einher, woraufhin sich das Zellvolumen vor der Zellteilung vergrößert. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Blastogenese in T-Lymphozyten unter Verwendung eines automatisierten Zellzählers, der in der Lage ist, Zelldurchmesser zu messen.

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wirksamkeit immunmodulatorischer Wirkstoffe mithilfe eines automatischen Zellzählgeräts zu bewerten, indem die Blastogenese oder Blastentransformation von T-Lymphozyten gemessen wird. Dieser Test bietet eine schnelle Methode zur Quantifizierung der Aktivierung von T-Lymphozyten unter Verwendung eines automatischen Zellzählgeräts, das zur Messung von Zelldurchmessern geeignet ist. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie – im Gegensatz zu gängigen Proliferationstests an T-Lymphozyten – eine schnelle, einfache und direkte Messung an Einzelzellen ermöglicht.Die Behandlung von Lymphozyten mit immunmodulatorischen Wirkstoffen erhöht oder verringert die Rate und das Ausmaß der zellulären Blastogenese. Mithilfe des Zellzählassays kann das Ausmaß dieser Blastogenese innerhalb von etwa vier Minuten pro Probe gemessen werden. Innerhalb von zehn Minuten nach der Tötung des Tieres den Bauch der Maus mit 70 Prozentigem Ethanol besprühen und mit einer Schere einen Schnitt im Fell und in der Haut auf der linken Seite des Tieres anlegen.Die Haut auseinander- und zurückgehalten, um das Peritoneum freizulegen. Anschließend wird eine vierprozentige Chlorhexidinlösung auf die Schnittstelle aufgetragen. Mit einem zweiten Satz an Scheren und Pinzetten erfolgt ein zwei bis drei Zentimeter langer Schnitt entlang des mittleren Abdomens, um das Peritoneum zu öffnen.Entfernen Sie anschließend die viszeralen Anhänge und das überschüssige Fettgewebe um die Milz herum und überführen Sie das Gewebe in einen Behälter mit DPBS. Geben Sie danach zehn Milliliter vollständiges RPMI 1640-Medium in eine zehn Zentimeter große Kulturschale und zerdrücken Sie die Milzen zwischen zwei sterilisierten rauen Glasobjektträgern. Filtern Sie die gewebliche Suspension durch einen sterilen 40-Mikron-Nylon-Zellfilter in eine neue zehn Zentimeter große Kulturschale, um Bindegewebe und Zelltrümmer zu entfernen, und überführen Sie die Einzelzell-Suspension in ein 50-Milliliter-Konischrohr zur Zentrifugation.Suspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Nach zehn Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schwenken sammeln Sie die Zellen durch eine weitere Zentrifugation ein und suspendieren das Pellet in zehn Milliliter frischem Medium. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen erneut, um sie in zwei Milliliter komplettem Medium bei 37 Grad Celsius zu resuspendieren.Um die T-Zellen zu reinigen, spülen Sie zunächst ein bis zwei Nylonwoll-Säulen pro Milz zwei Mal mit je fünf Millilitern vollständigem RPMI und stellen die Säulen eine Stunde lang in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid. Am Ende der Inkubation geben Sie zwei Milliliter der isolierten Milzzell-Suspension auf das obere Ende jeder Säule und lassen die Zellen durch die Säule fließen, bis die Flüssigkeit den oberen Rand der Wolle erreicht. Fügen Sie danach zwei Milliliter frisches, auf 37 Grad Celsius erwärmtes vollständiges Medium auf das obere Ende der Säulen hinzu und lassen Sie das Medium durch die Nylonwolle fließen, bis die Flüssigkeit an der Säulenspitze den oberen Rand der Wolle erreicht.Decken Sie die Wolle nun mit drei Milliliter vollständigem Medium bei 37 Grad Celsius ab und stellen Sie die Säule zurück in den Zellkulturinkubator, damit alle B-Zellen, Fibroblasten und Begleitzellen an den Wollfasern haften können. Nach einer Stunde waschen Sie die Säule in einem neuen 50-Milliliter-Konischglas zweimal mit je fünf Milliliter frischem vollständigem Medium, um die nicht haftenden T-Zellen auszuwaschen. Sammeln Sie anschließend die Zellen durch Zentrifugation.Nachdem die T-Zellen einmal mit zehn Milliliter komplettem Medium gewaschen wurden, das Pellet in zwei Milliliter frischem komplettem Medium resuspendieren. Anschließend die Zellen zählen und die Suspension auf eine Konzentration von 0,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in frischem komplettem Medium verdünnen, um sie je nach experimentellen Anforderungen in eine 6- oder 24-Loch-Zellkulturplatte auszusäen. Innerhalb von 24 Stunden nach ihrer Isolierung die mittels Nylonwollsäule isolierten T-Zellen mit dem geeigneten Stimulus und dem experimentellen Wirkstoff der Wahl aktivieren.Nach 12 bis 72 Stunden die aktivierten behandelten Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette vorsichtig mischen, um eventuelle Klumpen aufzulösen. Um die Zelldurchmesser mittels automatischem Zellzähler zu messen, eine Milliliter der behandelten Zellen aus jedem Wells in separate Probenbecher überführen und die Probenbecher in das Probencarousel des automatischen Zellzählgeräts stellen. Die Proben-ID und Informationen zum Zelltyp eingeben, um die Proben zu erfassen und mit der Analyse zu beginnen.Nachdem Trypanblau mit der Zellsuspension vermischt wurde, werden die Zellen über ein Bildgebungs-Feld geleitet, bis etwa 100 Zellbilder von jeder Probe gesammelt wurden. Die Software zeichnet einen Kreis um jede erfasste, mit Trypanblau angefärbte und ungefärbte Zelle, um den Zelldurchmesser zu bestimmen. Sobald alle Zellen gemessen wurden, werden die Daten in eine Tabellenkalkulation exportiert, die die Ergebnisse als Gesamt- und lebensfähige Zellzahlen für jeden gemessenen Durchmesser anzeigt.Die Daten können anschließend als Histogramme dargestellt werden. Nach zwei Tagen Stimulation mit PMA und Ionomycin wird eine signifikante Verschiebung des Medians der Häufigkeitsverteilung hin zu größeren Zelldurchmessern beobachtet, wobei die Anzahl der T-Zellen mit kleineren Durchmessern entsprechend abnimmt. Bei einer festen Ionomycin-Konzentration von 250 Nanomolar ändert sich der PMA-Effekt nicht signifikant, wenn die Konzentration des Aktivierungsreizes von zwei auf 250 Nanogramm pro Milliliter erhöht wird.Auch gibt es keinen nennenswerten Unterschied in der beobachteten T-Zell-Proliferation. Calcineurin-Inhibitor-Medikamente hemmen sowohl die T-Zell-Blastogenese als auch die Proliferation teilweise. Die Behandlung von T-Zellen mit immunsuppressiven Verbindungen, die auf den Calcineurin-Kernfaktor aktivierter T-Zellen abzielen, inhibiert die blastogene Antwort um nahezu 72 Prozent.Rapamycin und FTY720 zeigen moderate, aber statistisch signifikante Effekte auf die Blastogenese. Während TRAM34 offensichtlich die Proliferation muriner T-Zellen selbst bei Konzentrationen von 700 Nanomolar nicht beeinflusst. Wenn Rapamycin und Cyclosporin A zusammen verwendet werden, ist die Blastogenese vollständig inhibiert.Ähnliche Ergebnisse werden bei murinen T-Zellen beobachtet, die mit anti-CD3- und anti-CD28-gebundenen magnetischen Mikrokügelchen aktiviert wurden. Dieser Test kann erfolgreich zur Quantifizierung der Wirkungen verschiedener immunmodulatorischer Arzneimittel eingesetzt werden und ermöglicht eine genauere Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit im Vergleich zu typischen Proliferationsassays, die auch Beiträge von apoptotischen und nekrotischen Zellen enthalten. Mit dieser Methode können bis zu 15 Proben ein- und ausgeschaltet gemessen werden, wodurch gleichzeitige und anschließende Quantifizierungen sowohl der Blastogenese- als auch der Proliferationsraten möglich sind.Gelegentlich können Luftblasen in die Durchflusszelle gelangen und die Messung unbrauchbar machen. Daher sollten alle Bilder auf Luftblasen überprüft werden, bevor die Daten aus jedem Versuch zur Analyse akzeptiert werden. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass die Messung bei zu viel Verunreinigung in der Probe die Partikel als lebensfähige Zellen interpretieren kann. Mit geeigneten Modifikationen besteht das Potenzial, diesen Assay für die Untersuchung der Zellgrößenänderung in Neutrophilen und Hepatozyten anzupassen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Screening von immunmodulatorischen Verbindungen mittels fluoreszenzbasiertem Assay. Transgene T-Lymphozyten aus der Maus mit grün fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten werden mit diesen Verbindungen behandelt. Die verstärkten und reduzierten GFP-Signale ermöglichen die Identifizierung der stimulierenden bzw. hemmenden Wirkungen der Verbindungen.

Ein fluoreszenzbasierter Assay mit gentechnisch veränderten Lymphozyten zum Screening immunmodulatorischer Verbindungen

Das Video zeigt eine immunologische Methode zur Überwachung der in vivo adjuvansinduzierten zytotoxischen T-Lymphozyten- oder CTL-Produktion. Einer Maus werden gentechnisch veränderte, proliferative Farbstoff-gefärbte CD8+ T-Spender-Lymphozyten vorinjiziert. Die subkutane Injektion von Ovalbumin mit Adjuvantien erzeugt zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die nach der Entnahme durch Immunfärbung und Durchflusszytometrie identifiziert werden.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Lymphozyten sind die Hauptakteure bei adaptiven Immunantworten. Hier stellen wir ein Lymphozytenreinigungsprotokoll vor, um die physiologischen Funktionen der gewünschten Moleküle bei der Lymphozytenaktivierung in vitro und in vivo zu bestimmen. Die beschriebenen experimentellen Verfahren eignen sich zum Vergleich der Funktionsfähigkeit von Kontroll- und genetisch veränderten Lymphozyten.

Isolation und Aktivierung von murinen Lymphozyten

Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.

Ein Fluoreszenz-basierte Lymphocyte Assay geeignet für Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur in Vivo Bestimmung der naiven CD4-T Zellaktivierung (T Cell), Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch GM-CSF Knochenmark (BM)-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs). Darüber hinaus beschreibt dieses Protokolls BM und T-Zellen isoliert, DC-Generation und DC und T-Zell-Adoptiv-Transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

Hier wird ein Protokoll zur Messung von vermehrenden CD4+ T-Zellen als Reaktion auf antigene Proteine oder Peptide mittels Farbstoffverdünnung vorgestellt. Dieser Assay ist besonders empfindlich gegenüber seltenen antigenspezifischen T-Zellen und kann modifiziert werden, um das Klonen von antigenspezifischen Zellen zu erleichtern.

Quantifizierung von proliferierenden humanen Antigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester

Die Bioenergetik der CD8-T-Zellen kann mit dem Mito Stresstest abgefragt werden. Diese Methodik kann verwendet werden, um die akute und chronische metabolische Programmierung zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt Ansätze zur Untersuchung der Beziehungen zwischen der Biologie von T-Zell-Rezeptoren und der bioenergetischen Analyse.

Messung der mitochondrialen Funktion von naiven und Effektor-CD8-T-Zellen

Wir beschreiben ein Verfahren zur Bewertung der Fähigkeit pharmakologischer Wirkstoffe, tolerogene dendritische Zellen aus naiven Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro zu generieren und ihre Wirksamkeit durch autologe regulatorische T-Zell-Generierung zu validieren.

Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14+ -Monozyten

Lernen Sie die schnelle Quantifizierung von T-Lymphozyten-Blastogenese mit einem automatisierten Zellzähler zur Bewertung immunmodulatorischer Wirkstoffe. Diese Methode ermöglicht direkte Einzelzellmessungen.

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen (Video) | JoVE Journal

Schnelle Quantifizierung von Mitogen-induzierte Blastogenese in T-Lymphozyten zur Identifizierung von immunmodulatorische Drogen

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