Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die zelluläre Motilität über die Zeit mit Hilfe eines auf Goldnanopartikeln basierenden Zellmotilitätsassays quantitativ messen zu können. Dazu werden zunächst Glasdeckgläser für eine Beschichtung mit Goldnanopartikeln vorbereitet. Speziell endotoxinfreie Deckgläser werden mit Gelatine überzogen und anschließend eingebrannt.

Der zweite Schritt besteht darin, die Chlorsäure zu reduzieren, wodurch Goldnanopartikel entstehen, und die mit Gelatine beschichteten Deckgläser gleichmäßig mit der Lösung zu beschichten. Anschließend werden die Zellen für den gewünschten Zeitraum der Experimentzellen auf die Deckgläser der Goldnanopartikelbeschichtung gelegt. Im weiteren Verlauf verdrängt die Gelatine Goldnanopartikel und hinterlässt Spuren.

Der letzte Schritt ist die Überwachung und Quantifizierung der Zellmotilität mit Hilfe der Mikroskopie, um die von den sich bewegenden Zellen erzeugten Spuren abzubilden. Letztlich erfolgt die Flächenvermessung der Gleise mit frei verfügbarer Software. Einer der Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Zeitrafferbildgebung, besteht darin, dass dieser Assay nur ein Standardlichtmikroskop und eine Standardkamera benötigt und eine frei verfügbare Bildgebungssoftware verwendet.

Darüber hinaus ermöglicht der Assay auch die Analyse und den Vergleich mehrerer Proben mit einem Methodisten, der ein Hochdurchsatz-Screening durchführen kann. Obwohl diese Methode Aufschluss über den Einfluss verschiedener physiologischer Faktoren und der Zellbewegung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. die Studien über die Auswirkungen von Krankheitserregern auf die Beweglichkeit infizierter Zellen. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Methode erfordert, dass man die im Protokoll angegebenen Volumina und Temperaturen strikt befolgt.

In diesem Protokoll liegt der Schwerpunkt auf der Beurteilung der Farbe der endgültigen Lösung von gefällten Goldnanopartikeln, um den Erfolg sicherzustellen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung. Da der FGO kinetische Spur ist, sind die Schritte des Motilitätsassays schwer zu erlernen.

Sie enthalten mehrere Verfahren, die in zell- und molekularbiologischen Laboratorien nicht üblich sind. Um mit Gelatine beschichtete Deckgläser herzustellen, suspendieren Sie zuerst die Gelatine und das deionisierte Wasser, um die Lösung mit einer Endkonzentration von 0,5 Gramm pro 300 Milliliter herzustellen, und autoklavieren Sie die Mischung dann 15 bis 30 Minuten lang. Es ist wichtig, dies innerhalb von zwei Stunden nach der Zugabe der Gelatine in einer Gewebekulturhaube zu tun.

Bereiten Sie die Deckgläser für die Beschichtung vor, indem Sie zunächst acht bis neun säuregewaschene Deckgläser in eine 100-Millimeter-Kunststoffschale geben. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser nicht aneinander oder an den Seiten der Schüssel berühren. Pipettieren Sie vorsichtig zwei bis drei Tropfen Gelatine auf jeden Deckglas, um ein Überlaufen auf die Platte zu vermeiden.

Dann die Form mit den mit Gelatine überzogenen Deckfolien in einen Ofen schieben und bei 90 Grad Celsius 10 Minuten backen. Nach 10 Minuten die Form aus dem Ofen nehmen und wieder in das Tuch legen. Kulturhaube.

Überschüssige Gelatine vorsichtig abpipettieren. Stellen Sie das Gericht wieder in den Ofen und trocknen Sie die Deckgläser 45 Minuten lang bei 70 Grad Celsius. Sobald die Deckgläser trocken sind, nehmen Sie die Form aus dem Ofen und legen Sie sie wieder in die Tissue-Kulturhaube.

Heben Sie mit einer sterilen Nadel vorsichtig eine Seite des Deckglases an. Entfernen Sie dann mit einer sterilen Pinzette die mit Gelatine überzogenen Deckgläser von der Schale und legen Sie sie in separate Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Der nächste Schritt ist die Herstellung von kolloidal goldbeschichteten Deckgläsern.

Beginnen Sie mit der Zubereitung von 10 Millilitern 0,5%iger Natriumcitratlösung, die in einer Gewebekulturhaube verarbeitet wird, kombiniert 1,5 Milliliter der 14,5 Millimolaren Chlor-ORINSÄURE-Lösung und 13,5 Milliliter deionisiertes Wasser im Autoklaven in einem sterilen, endotoxinfreien Erlenmeyerkolben. Für alle acht bis neun Deckgläser sollte das Ergebnis eine schwache gelbe Lösung ergeben. ChlorORSÄURE ist giftig und sollte vorsichtig gehandhabt werden. Es ist auch lichtempfindlich, daher sollte der Kochschritt bei schwachem Licht durchgeführt werden.

Wenn die Lösung ihren Siedepunkt erreicht hat, nehmen Sie den Kolben von der heißen Platte und geben Sie ihn auf eine Rührplatte. Um die kolloidalen Goldpartikel in Lösung zu bilden, fügen Sie 0,7 Milliliter der 0,5%igen Natriumcitratlösung pro 15 Milliliter der ChlorORINSÄURE-Lösung unter Rühren hinzu und rühren Sie etwa zwei Minuten lang weiter. Während dieser Zeit wechselt die Lösung von einem schwachen Gelb zu einem klaren Grau zu einem violetten zu einem tiefvioletten Farbton.

Bevor Sie schließlich eine Rotwein- oder vorzugsweise Rostfarbe erreichen, ziehen Sie die kolloidale Goldlösung in einer 10-Milliliter-Pipette auf und lassen Sie die Lösung in der Pipette ein bis zwei Minuten abkühlen, bis sie Raumtemperatur erreicht. Geben Sie dann 0,5 bis einen Milliliter auf die mit Gelatine überzogenen Deckgläser in die 24-Well-Platte. Legen Sie die 24-Well-Platte mit den kolloidalen, goldbedeckten Deckgläsern in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Nachdem sich die Partikel auf den mit Gelatine beschichteten Deckgläsern abgesetzt haben, überprüfen Sie ihre Dichte unter einem Lichtmikroskop.

Die richtige Verteilung von Gold-Nanopartikeln hilft dabei, die Kanten von Solar-LKWs einfach und effizient zu unterscheiden. Die optimale Dichte variiert mit der Zellgröße. Eine zu hohe Konzentration von Goldpartikeln behindert die Bewegungsfähigkeit der Zellen, während eine zu niedrige Konzentration von Gold- und Goldpartikeln die Fähigkeit einschränkt, eine genaue Spur der Beweglichkeit zu zeichnen.

Aus diesem Grund sollten in Einzelversuchen nur Deckgläser verwendet werden, die in der gleichen Charge hergestellt wurden oder die gleiche Dichte aufweisen. Wenn die Konzentration der Goldpartikel nicht ausreicht, fügen Sie den mit Gelatine überzogenen Deckgläsern zusätzlich 0,5 bis einen Milliliter der kolloidalen Goldlösung hinzu. Ist die Konzentration der Goldpartikel jedoch zu hoch, wie im hier gezeigten Fall, besteht die einzige effektive Wahl darin, die kolloidale Goldlösung neu herzustellen und neue Deckgläser zu beschichten.

Wenn die Partikeldichte korrekt ist, stellen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius wieder in den Inkubator und inkubieren Sie eine Stunde lang, um ungebundene Goldpartikel über Nacht abzuspülen, indem Sie die Deckgläser dreimal in sterile, phosphatgepufferte Kochsalzlösung tauchen. Lagern Sie dann die kolloidalen, goldbeschichteten Deckgläser in PBS-gefüllten Vertiefungen einer sauberen 12-Well-Platte bei vier Grad Celsius, bis sie einsatzbereit sind. Deckgläser sollten nicht trocknen gelassen werden und innerhalb von zwei bis drei Monaten ab dem Datum ihrer Herstellung verwendet werden.

Der nächste Schritt ist die Vorbereitung der kolloidal goldbeschichteten Deckgläser für die Zellkultur. Beginnen Sie damit, sie in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu legen, denen vor dem Hinzufügen der Deckgläser etwa 0,3 Milliliter Nährmedium zugesetzt wurden. Mit den Deckgläsern werden etwa 5.000 bis 50.000 Zellen auf jeden kolloidal goldbeschichteten Deckglas übertragen. Die Zellzahl variiert je nach Zelltyp, aber die Zelldichte muss niedrig genug sein, um die Überlappung von Zellspuren von mehreren Zellen im selben Bereich zu verhindern.

Decken Sie die Platte ab und legen Sie sie sechs bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator Basierend auf der Beweglichkeit des Zelltyps sollte der optimale Zeitrahmen für jeden Zelltyp nach der Inkubation experimentell bestimmt werden. Befestigen Sie alle Deckgläser, die nicht sofort analysiert werden, indem Sie sie zuerst zweimal in PBS tauchen und anschließend 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit einem Licht nimmt Bilder der Spuren auf, die von einer einzigen beweglichen Zelle auf nicht fixierten oder festen Deckblättern erstellt werden. Die Vergrößerung, mit der Zellspuren aufgenommen werden, variiert je nach Zelltyp. Allerdings muss für jede Studie die gleiche Vergrößerung verwendet werden, um die Ergebnisse vergleichen zu können.

Bei Monozyten funktioniert die 40-fache Vergrößerung gut mit der frei verfügbaren Software wie image, JNIH image oder image tool. Bestimmen Sie die durchschnittliche Fläche von kolloidalem Gold, die von 10 bis 20 oder mehr Zellen für jede Probe aus den hier aufgenommenen Bildern entfernt wird, ist der gereinigte Weg kolloidaler Goldpartikel durch einen einzelnen unstimulierten Monozyten, der mit einem 40-fachen Objektiv aufgenommen wurde. Unbewegliche Zellen bilden charakteristische kleine ovale oder kreisförmige Bahnen um sich herum, was auf ein geringes Bewegungsniveau der Vasallen hinweist. Im Gegensatz dazu zeichnen sich hochbewegliche Zellen aufgrund ihrer unregelmäßigen Formen durch eine gerichtete Bewegung als längliche Bahnen und größere Gesamtflächen aus.

Zellspuren lassen sich am besten analysieren, indem Sie das Freihandwerkzeug in der Image J-Software verwenden, um ihr Volumen zu skizzieren. Quantitative Flächenmessungen können dann mit dem Messwerkzeug im Analysemenü von Image J durchgeführt werden.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die im Protokoll angegebenen Volumina und Temperaturen strikt einzuhalten, da Abweichungen das Endergebnis stark beeinflussen können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit Gelatine beschichtete Deckgläser erstellt, wie man Goldnanopartikel und mit Goldnanopartikeln beschichtete Deckgläser vorbereitet und wie man die Zellbewegung mit Hilfe einer Lichtmikroskopie überwacht und quantitativ bewertet.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit den Siedelösungen auf einer Heizplatte, insbesondere mit Dämpfen aus der Siedelösung von Fluor, AIC-Säure und Natriumcitrat, gefährliche Vorsichtsmaßnahmen sein können, wie z. B. das Arbeiten in der Haube und die Verwendung des gesunden Menschenverstands, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.