Name: In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von mRNA-Expressionsmustern in Pflanzengeweben mit hoher Sensitivität. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisierung von Genexpression im Gewebekontext.

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Forschung im Labor von MT wird durch Zuschüsse aus dem National Science Foundation (DBI-0820610 und IOS-1022102) und der NY Department of Health (NYSTEM-C024308) unterstützt. CM erhielten Postdoc-Stipendien des spanischen Ministeriums für Erziehung und Wissenschaft (2007-0937) und die Stiftung Rafael del Pino, Spanien.

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<li>Kramer, E. M., Irish, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+genetic+mechanisms+controlling+petal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of genetic mechanisms controlling petal development.</a> Nature. 399, 144-148 (1999).</li>
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<li>Blilou, I., Xu, J., Wildwater, M., Willemsen, V., Paponov, I., Friml, J., Heidstra, R., Aida, M., Palme, K., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PIN+auxin+efflux+facilitator+network+controls+growth+and+patterning+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsis roots.</a> Nature. 433, 39-44 (2005).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die in situ Hybridisierung hier skizzierten erlaubt die direkte Visualisierung der räumlich-zeitlichen Expressionsmuster von jedem Gen von Interesse mit großer zellulärer Auflösung, hohe Sensitivität und Spezifität. Das Protokoll erlaubt keine quantitativen Vergleich der Expression von Genen. Allerdings kann die Methode eine hohe Empfindlichkeit und Auflösung Gradienten der Genexpression innerhalb eines Gewebes 8, 18, ​​die nicht mit den meisten anderen Methoden zur Analyse der Genexpression möglich aufzudecken. Das Protokoll umfasst viele Schritte, die machen die Fehlersuche problematisch sein kann. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind die Fixierung des Gewebes sowie die Auswahl und Markierung der Sonde. Schlecht infiltrierten Gewebe und Sonden mit geringen DIG Einbau wird Ausbeute sehr schwachen Signalen, die schwer zu obigen Hintergrund erkennen kann. Für jedes neue Gen von Interesse, ist es ratsam, ein paar verschiedene Sonden, die aus verschie abgeleitet versuchenmieten Regionen der Niederschrift. Gelegentlich können auch zwei oder drei Sonden gezielt verschiedene kleinere Regionen des Gens müssen kombiniert werden, um eine starke und spezifische Hybridisierung Signal zu erhalten. Darüber hinaus sind die Hybridisierungsbedingungen, wie die Temperatur und die Zusammensetzung der Hybridisierungspuffer, kann für jedes Gen oder Gewebe zu senken oder erhöhen Sie die Hybridisierungsstringenz optimiert werden. Auch die Protease-Behandlung Schritt ist eine Variable und kann geändert werden, um das Protokoll für die verschiedenen Pflanzenarten oder für die Detektion von Transkripten mit sehr geringer Menge anzupassen. Die Einbeziehung sowohl positive als auch negative Kontrolle Sonden wird hilfreich sein bei der Identifizierung von problematischen Punkte des Protokolls. Das Verfahren ist für Paraffin eingebettete Gewebeschnitte Anlage optimiert, sondern mit geringfügigen Modifikationen auch für Ganzkörper-Mount verwendet werden in-situ-Hybridisierung. Obwohl häufig in Tierversuchen 19, whole mount in situ Hybridisierung verwendet werden l werdenimited zu pflanzlichen Geweben, die leicht infiltriert werden können, wie Embryonen, Wurzeln oder jungen meristematischen Gewebe 20,21. Das Protokoll kann auch leicht modifiziert werden, um gleichzeitig zu erkennen zwei verschiedene mRNAs oder lokalisieren Transkripte neben Proteinen 15,22,23. Schließlich ist es möglich, die Anwendung dieser Methode auf die Visualisierung von kleinen RNA-Expression in Pflanzen zu erweitern. miRNA-Expressionsmuster wurden anhand dieses Protokoll in beide Mais und Arabidopsis 8,14. In jüngerer Zeit haben die in vitro transkribiert Sonden ersetzt worden handelsüblichen DIG-markierten Locked Nucleic Acid (LNA) Oligo Probes mit Zunahme Signalempfindlichkeit 18, 24.

<table border="1"><tbody><tr><th> Produkt </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Bemerkungen </th></tr><tr><td> Cytoseal 60 4 Unzen </td><td> Fischer </td><td> 23-244-256 </td><td> Toluol-based 8310-4 </td></tr><tr><td> Histoclear </td><td> Fischer </td><td> 50-899-90147 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Pfad Paraplast Plus- </td><td> Fischer </td><td> 23-021-400 </td><td></td></tr><tr><td> N + Nylonmembran Hybond-N + </td><td> GE Healthcare </td><td> RPN203B </td><td></td></tr><tr><td> RNase OUT; 40 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 10777019 </td><td></td></tr><tr><td> RQ1 RNase-Free DNase; 1 U / ul </td><td> Promega </td><td> M6101 </td><td></td></tr><tr><td> DIG-markierten Kontroll-RNA </td><td> Roche </td><td> 11585746910 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Labeling Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> SP6 RNA-Polymerase 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10810274001 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> T3-RNA-Polymerase 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 11031163001 </td><td></td></tr><tr><td> T7-RNA-Polymerase 1.000 U </td><td> Roche </td><td> 10881767001 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-A </td><td> Roche </td><td> 109142 </td><td> lösen sich in Glycerin 50% Tris 100 mM pH 8,0 </td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche </td><td> 1 096 176 </td><td> Hitze bis 70 ° C in TBS-Puffer </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente aus Schaf-150 U </td><td> Roche </td><td> 1 093 274 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP-Stammlösung </td><td> Roche </td><td> 1 681 451 </td><td></td></tr><tr><td> Mini Quick Spin RNA Columns </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA aus E. coli </td><td> Roche </td><td> 109541 </td><td></td></tr><tr><td> Triton ® X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20</td><td> Sigma </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> Deionisiertes Formamid </td><td> Sigma </td><td> F9037 </td><td></td></tr><tr><td> Protease aus Streptomyces griseus Typ XIV </td><td> Sigma </td><td> P5147 </td><td> Verdünnen Sie in milliQ Wasser-und pre-Digest 4 Stunden bei 37 ° C </td></tr><tr><td> Triethanolamine </td><td> Sigma </td><td> 90279 </td><td> Verdünnen in Wasser, pH 8,0 mit HCl bringen </td></tr><tr><td> Essigsäureanhydrid </td><td> Sigma </td><td> A6404 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat Natriumsalz aus Leuconostoc spp. </td><td> Sigma </td><td> D8906-5G </td><td> Dextransulfat sollte auf 80 ° C erhitzt werden, sich aufzulösen. </td></tr><tr><td> Denhardt Lösung 50x Konzentrat </td><td> Sigma </td><td> D2532 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum - ≥ 98% </td><td> Sigma </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> Eosin Y Dinatriumsalz </td><td> Sigma </td><td> E4382 </td><td> Lösen Sie in 96-100% Ethanol bis zur Sättigung </td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol absolut 200 Proof </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phenol / Chloroform </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bodenformen </td><td> Elektronische Microsocpy Wissenschaft </td><td> 62352-15 </td><td></td></tr><tr><td> Embedding Ringe </td><td> Fischer </td><td> 22-038-197 </td><td></td></tr><tr><td> 20ml Einweg Szintillationsgefäße, mit Kappen </td><td> VWR </td><td> 66020-326 </td><td></td></tr><tr><td> Probe-on-plus-Objektträger </td><td> Fischer </td><td> 22-230-900 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Deckgläser 24x50 mm </td><td> VWR </td><td> 48404-452 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman-Papier 3mm </td><td> VWR </td><td> 89022-360 </td><td></td></tr><tr><td> Drei Glasschalen und einem stainless Stahlschlitten Rack </td><td> Elektronische Microsocpy Wissenschaft </td><td> 71420-25 </td><td> Zwei Glas gewölbt sind für histoclear Behandlung notwendig ist und die letzte ist für den Essigsäureanhydrid Behandlung verwendet </td></tr><tr><td> 18 saubere Kunststoff-Behälter </td><td> Elektronische Microsocpy Wissenschaft </td><td> 71402 </td><td></td></tr><tr><td> 2 oder 3 große, flache Kunststoffboxen mit verschließbaren Deckeln </td><td></td><td></td><td> erforderlich für die Hybridisierung und Antikörper-Schritte </td></tr><tr><td> Feine Pinsel </td><td></td><td></td><td> Hilfe Übergabe Wachsbänder </td></tr><tr><td> Mikrotom </td><td></td><td></td><td> Leica </td></tr><tr><td> Selbstreinigende Trockensauger System </td><td> Welch </td><td> 2025 </td><td></td></tr><tr><td> Slide wärmer </td><td> Fischer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Heizblock </td><td></td><td></td><td> benötigt bei 60 ° C und 85 ° C</td></tr><tr><td> Brutschrank bei 58-60 ° C </td><td> Fischer </td><td></td><td> Für die Schritte mit geschmolzenem Paraplast </td></tr><tr><td> Backöfen oder Wasserbäder für 55 ° C und 37 ° C </td><td> Fischer </td><td></td><td> Müssen zwei durch die schnellen Wechsel zwischen den Temperaturen </td></tr><tr><td> Zentrifuge (4 ° C - 20 ° C) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laborabzugsregelung </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in-situ-hybridisierung für die genaue lokalisierung der transkripte in pflanzen

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

Mit den Fortschritten in der Genomforschung der letzten zehn Jahre hat Pflanzenbiologie zahlreiche Studien präsentiert großflächige quantitative Analysen der Genexpression zu sehen. Microarray und Sequenzierung der nächsten Generation Ansätze werden verwendet, um entwicklungsbedingten, physiologischen und Stress-Antwort-Prozesse zu erforschen, zu sezieren epigenetischen und kleine RNA Wege und bauen große Genregulationsnetzwerken 1-3. Während diese Techniken die gleichzeitige Analyse von großen Gen-Sets zu erleichtern, sie bieten in der Regel eine sehr begrenzte raum-zeitlichen Auflösung von Veränderungen der Genexpression. Diese Beschränkung kann teilweise entweder mit Profiling-Methode in Verbindung mit lasermicrodissection oder Fluoreszenz-activated cell sorting 4-7 überwunden werden. Doch das Verständnis der biologischen Rolle eines Gens, ist das Wissen um seine raum-zeitliche Muster der Expression auf zellulärer Auflösung von wesentlicher Bedeutung. Insbesondere bei der Untersuchung der Entwicklung oder die Auswirkungen von Umwelt-stimuli und Mutanten können die detaillierte Analyse eines Gens Expressionsmuster unverzichtbar geworden. Zum Beispiel können subtile quantitative Unterschiede in der Expression von wichtigen regulatorischen Genen zu dramatischen Phänotypen führen, wenn mit dem Verlust oder Gewinn des Ausdrucks in bestimmten Zelltypen assoziiert. Verschiedene Methoden werden routinemäßig für die detaillierte Untersuchung der Genexpression verwendet. Man ist durch die Analyse von transgenen Reporter Linien. Eine solche Analyse kann jedoch zu zeitaufwändig bei der Analyse mehrerer Gene oder arbeiten in Pflanzen widerspenstigen zur Transformation. Darüber hinaus ist eine unabhängige Validierung, um sicherzustellen, dass die Transgenexpression Muster, das aus dem endogenen Gen imitiert in der Regel erforderlich. Immunhistochemische Proteinlokalisierung oder mRNA in situ Hybridisierung Gegenwart relativ schnell Alternativen für die direkte Visualisierung der Genexpression in Zellen und Geweben. Letzteres hat den entscheidenden Vorteil, dass es leicht sein kann used auf jedem Gen von Interesse. In-situ-Hybridisierung ermöglicht den Nachweis von Ziel-mRNAs in den Zellen durch Hybridisierung mit einer markierten anti-sense RNA-Sonde durch in vitro Transkription des Gens von Interesse erzielt. Hier skizzieren wir ein Protokoll für die in situ-Lokalisierung der Genexpression in den Pflanzen, die hoch Sensitivität und Spezifität wird. Es ist für die Verwendung mit Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebetteten Abschnitte, die hervorragende Erhaltung der Histologie zu geben, und DIG-markierten Sonden, visualisiert durch Immun-Detektion und alkalischer Phosphatase kolorimetrische Reaktion optimiert werden. Dieses Protokoll wurde erfolgreich an einer Reihe von Geweben aus einer breiten Palette von Pflanzenarten angewendet wird, und kann verwendet werden, um die Expression von mRNAs sowie kleine RNAs 8-14 analysieren.

Die<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine direkte Lokalisierung von mRNA und kleinen RNA-Expression auf zellulärer Ebene mit hoher Sensitivität und Spezifität. Das Verfahren ist für Paraffin eingebettete Gewebeschnitte Anlage optimiert, ist für eine breite Palette von Pflanzen und Gewebe und kann innerhalb von zehn Tagen abgeschlossen sein.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

Mit den Fortschritten in der Genomforschung des letzten Jahrzehnts gab es in der Pflanzenbiologie zahlreiche Studien, die groß angelegte quantitative Analysen von Genen präsentierten ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mRNA-Expressionsmuster auf zellulärer Ebene mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem man formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte zunächst durch eine Reihe von Lösungen führt, um das Wachs zu entfernen, das Gewebe zu permeabilisieren und positiv geladene Aminogruppen im Gewebe zu blockieren, die ein Hintergrundsignal erzeugen können. Anschließend werden DIG-markierte RNA-Sonden, die spezifisch für das Gen von Interesse sind, in die Gewebeschnitte eingebracht, und die Objektträger werden über Nacht hybridisiert.Anschließend werden die Objektträger mit RNAs behandelt. A, um unspezifisch gebundene Sonden von den Schnitten zu entfernen, und danach mit einem Anti-DIG-Antikörper inkubiert. Dies ermöglicht die Visualisierung der hybridisierten Sonde durch eine farbmetrische chemische Reaktion.Die Ergebnisse zeigen ein dunkelblaues Signal, das mittels Lichtmikroskopie spezifisch in jenen Zellen des Gewebes nachweisbar ist, in denen das Gen der Untersuchung exprimiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Expressionsanalysen, wie R-T-P-C-R, Mikroarray- oder Next-Generation-Sequencing-Verfahren, besteht darin, dass das hier dargestellte I-Hybridisierungsprotokoll das Expressionsmuster eines Gens der Untersuchung im Gewebekontext offenlegt. Diese Methoden umfassen viele Schritte, die am besten durch visuelle Demonstrationen erlernt werden können.Wir zeigen, wie man Gewebe schneidet und einbettet, sowie wichtige Schritte im Al-Hybridisierungs-Protokoll, die allein schwer zu beherrschen sind. Die Methode zum Einbetten von mit Paraldehyd fixierten Geweben variiert je nach Art des zu analysierenden Gewebes. Der wichtigste Punkt hierbei ist, sicherzustellen, dass die Proben später korrekt für den Schnitt ausgerichtet sind.Eine Methode zum Einbetten besteht in der Verwendung von Kunststoffformen und -ringen. Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie die Formen auf einer Heizplatte auf 60 Grad Celsius und gießen anschließend geschmolzenes Paraffin in die Formen. Danach übertragen Sie mit vorgewärmten Pinzetten eine Gewebeprobe in jede Form und positionieren sie in der gewünschten Orientierung. Bewegen Sie die Form vorsichtig von der Platte auf den Arbeitstisch und setzen Sie den weißen Ring auf die Form. Fügen Sie zusätzlichen Mol und Wachs hinzu. Lassen Sie das Wachs vor dem Schneiden allmählich abkühlen und aushärten.Wärmen Sie die Blöcke auf Raumtemperatur auf und schneiden Sie jeden Block trapezförmig zurecht, wobei etwa ein Millimeter Wachs um die Probe herum verbleibt. Stellen Sie den zugeschnittenen Block so auf den Mikrotom, dass die längere der beiden parallelen Flächen unten ist. Führen Sie den Block vorsichtig zur Klinge und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Blocks parallel zum Klingenquerschnitt ist.Mit einer Dicke von acht bis 10 Mikrometern. Richten Sie die Wachsbänder auf einer antihaftbeschichteten Oberfläche, wie beispielsweise Aluminiumfolie, aus und wählen Sie unter einem Zerlege-Mikroskop die gewünschten Schnittabschnitte aus. Markieren Sie anschließend die Prob-Bon-Plus-Objektträger mit einem Bleistift.Verwenden Sie keine Stifte für die Markierung, da diese während des INI-Zwei-Hybridisierungsprotokolls entfernt werden. Geben Sie je einen Milliliter sauberes Milli-Q-Wasser auf jeden Objektträger. Legen Sie die gewünschten Schnitte vorsichtig bei Raumtemperatur auf die Wasseroberfläche. Stellen Sie sicher, dass die glänzende Seite dem Wasser zugewandt ist. Überführen Sie den Objektträger langsam auf eine Objektträgererwärmung. Stellen Sie eine Temperatur von 35 bis 37 Grad Celsius ein. Dieser Temperaturbereich verhindert im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten Temperatur von 42 Grad Celsius die Bildung von Blasen unter den Schnitten. Nach fünf Minuten das Wasser vorsichtig, aber in einer fließenden Bewegung abgießen, sodass das Band auf den Objektträger abgesenkt wird. Die Objektträger mindestens mehrere Stunden oder über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen lassen, damit das Gewebe haftet und Gewebeschnitte vorbereitet werden können.Für die In-situ-Hybridisierung werden sie zunächst entparaffiniert und zur Abschlussentparaffinierung rehydriert. Inkubieren Sie die Objektträger in zwei Wechseln der histischen Klärungslösung je 10 Minuten. Um die Gewebeschnitte zu rehydrieren, führen Sie die Objektträger jeweils 30 Sekunden durch eine Serie abnehmender Ethanol-Konzentrationen.Während der Proteasebehandlung, die in diesem Video nicht gezeigt wird, bereiten Sie eine Glasschale mit einer 0,1-molaren Triathlonamin-Lösung vor und stellen diese auf einem Rührer in einer Abzugshaube auf. Unmittelbar vor dem Eintauchen des Metallpräparatgestells in die Lösung geben Sie 1,25 Milliliter Essigsäureanhydrid in das Triathlonamin, Puffer und den Abzug. Zusätzlich richten Sie das Klemmsystem und Stativ zur Halterung des Präparatgestells ein.Verringern Sie die Geschwindigkeit des Rührwerks, befestigen Sie den Objektträgerhalter am Stativ und senken Sie den Halter in die Lösung ab, wobei er über dem Rührstab angehoben bleibt. Fahren Sie mit dem langsamen Rühren für 10 Minuten fort, nachdem die Probe in PBS gespült und erneut durch eine Ethanolreihe dehydriert wurde. Die Gewebeschnitte sind nun bereit für die Hybridisierung.Legen Sie die Objektträger auf eine saubere Oberfläche und lassen Sie sie vollständig fünf bis zehn Minuten lang an der Luft trocknen. Bereiten Sie die Hybridisierungspuffermischung für die Sonde vor, indem Sie die denaturierte Sonde zu 80 Mikrolitern Hybridisierungspuffer hinzufügen. Für jeden Objektträger gut durch Pipettieren mischen, wobei Blasenbildung vermieden werden sollte.Pipettieren Sie den Hybridisierungspuffer für die Sonde. Verteilen Sie ihn am rechten Rand des Objektträgers. Senken Sie langsam ein Deckglas auf den Objektträger, und stellen Sie sicher, dass die Hybridisierungslösung alle Schnitte vollständig bedeckt und keine Luftblasen enthalten ist.Tippen Sie leicht mit dem Finger auf die Abdeckung an den Stellen, an denen sich Blasen bilden, um diese von allen Gewebeschnitten zu verdrängen. Ziehen Sie die Abdeckung nicht ab, da dies die Schnitte beschädigen würde. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtkammer, die mit Watman-Papier ausgelegt ist, das mit UE-Wasser angefeuchtet und größtenteils mit Param bedeckt ist.Die Box fest verschließen und die Objektträger bei der gewünschten Hybridisierungstemperatur, typischerweise 50 bis 55 Grad Celsius, für 16 bis 20 Stunden inkubieren. Am Ende des Hybridisierungsprotokolls die Deckgläser vorsichtig von den Objektträgern entfernen. Das Deckglas kann einfach abfallen, wenn der Objektträger aufrecht gestellt wird; falls dies nicht der Fall ist, darf das Deckglas nicht abgezogen werden, da dies die Schnitte beschädigen würde.Stattdessen tauchen Sie den Objektträger nach dem Entfernen der Deckgläser für eine oder zwei Minuten in warme 0,2-fache SSC-Lösung, um das Deckglas abzuwaschen, stellen Sie die Objektträger in einen Halter und waschen Sie sie mehrmals in 0,2-facher SSC-Lösung bei 55 Grad Celsius. Nach der RNase-Behandlung überführen Sie die Objektträger aus dem Halter auf den Boden einer flachen Kunststoffbox und bedecken Sie sie mit einem minimalen Volumen an Blockierungslösung. Blockieren Sie die Objektträger 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem langsam schwingenden Plattformshaker. Als Nächstes geben Sie ein minimales Volumen der Antikörperlösung direkt auf jeden Objektträger. Inkubieren Sie die Objektträger zwei bis drei Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Inkubation überführen Sie die Objektträger in eine saubere flache Box und waschen Sie viermal mit einem minimalen Volumen Waschpuffer auf einer schwingenden Plattform bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Objektträger einmal in TBS und zweimal in TN-Puffer, um die Anwendung der frisch zubereiteten Färbungslösung auf die Objektträger vorzubereiten. Gießen Sie zunächst die Färbungslösung in eine kleine Kunststoff-Wiegeschale. Anschließend befestigen Sie zwei Objektträger miteinander, wobei die Schnittflächen aufeinander zeigen.Tauchen Sie das Präparat in die Lösung, wobei die Kapillarwirkung die Lösung aufziehen lässt. Lassen Sie die Objektträger auf einem Kim-Tuch abtropfen. Füllen Sie die Objektträger mit der Färbelösung auf.Auch hier müssen die Objektträger möglicherweise angeklopft werden, während die Lösung zugegeben wird, um Blasenbildung zu vermeiden; stellen Sie die Objektträger in eine Plastikbox und lagern Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln. Hier werden repräsentative Ergebnisse mit verschiedenen Sonden und Geweben von Arabidopsis dargestellt. Das violette Signal ermöglicht eine direkte Visualisierung des Expressionsmusters des interessierenden Gens mit zellulärer Auflösung.Abbildung A zeigt die Lokalisation der Spross-Meli-eins-Transkripte in der vegetativen Sprossspitze. Beachten Sie das Vorhandensein eines violett-blauen Signals im unbestimmten Bereich des Meristems und das Fehlen eines Signals in den umgebenden Blättern. Die Abbildungen B–2D zeigen Schnitte von Arabidopsis-Torpedo-Embryonen, wobei B die Expression von Covata-drei in den wenigen embryonalen Stammzellen darstellt.C zeigt eine T ML-Eine-Expression in der epidermalen Schicht, und D zeigt das Fehlen eines Signals in Schnitten, die mit einer zufälligen negativen Kontroll-RNA untersucht wurden. Diese nächsten Bilder zeigen Ergebnisse, die mit verschiedenen Sonden an Maisgeweben erhalten wurden. Panel E zeigt die Lokalisation von STM Humalog knotted one im sich entwickelnden Maisembryo.Beachten Sie das starke Signal spezifisch im embryonalen Mes und in Längsschnitten durch die Wurzel durch die vegetative Scheide, die zeigen, dass ARF three A auf der axialen Unterseite der Blattoberfläche in Panel F exprimiert wird, und das A T ML one Homolog OCL four spezifisch in der Epidermis exprimiert ist. In Panel G. Wie erwartet, wurde für die negative Kontrollsonde in Panel H kein Hybridisierungssignal beobachtet. Die erwarteten Ergebnisse der verschiedenen Kontrollpunkte während der In-vitro-Transkription von Sonden werden hier gezeigt. Die In-situ-Hybridisierungs-Sonden werden nach der In-vitro-Transkription, nach der DNA-Behandlung und anschließender Reinigung der In-vitro-Transkriptionsreaktion auf einem standardmäßigen ARAZ-Gel überprüft, nach Carbonathydrolyse und wenn sie für Sonden mit einer Länge von über 250 Basenpaaren, wie beispielsweise Sonde eins, gebrauchsfertig sind. Die Carbonathydrolyse ergibt dann eine Bandbreite kleinerer Sondenfragmente.Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Farb- und Metrikqualifizierung von Sonden mittels Dot-Blot-Analyse mit Verdünnungen im Bereich von 10 hoch minus eins bis 10 hoch minus fünf einer 100 Nanogramm pro Mikroliter Kontrollsonde sowie von drei neu markierten DIG-markierten Sonden, die auf eine Transfermembran aufgetragen, mit anti-DIG-Antikörper inkubiert und im Assay detektiert wurden. Die Analyse legt eine geschätzte Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde zwei, 10 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde drei und 1 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde vier nahe, was darauf hindeutet, dass Sonde vier voraussichtlich kein gutes Hybridisierungssignal liefern wird. Schließlich bieten diese Längsschnitte durch die vegetative Keimspitze von Mace einen Vergleich zwischen einem unspezifischen Hintergrundsignal und einem gut funktionierenden Sondenset.A zeigt ein unspezifisches Hintergrundsignal, während Feld B ein spezifisches in-situ-Hybridisierungssignal für die OC-fünf-Sonde in der äußeren Zellschicht darstellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie viele der schwierigen Schritte in den In-situ-Hybridisierungsprotokollen durchgeführt werden, sodass Sie die präzisen räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster Ihres Lieblingsgens bestimmen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nicht radioaktiv In situ Hybridisierung Protocol Einsetzbar für Fichte und einer Reihe von Pflanzenarten

Dieses Protokoll wird erfolgreich eingesetzt, um quantitativ zu detektieren Ebenen und räumliche Muster der mRNA-Expression in mehreren Gewebetypen über Wirbeltierarten. Das Verfahren lässt sich erkennen geringer Menge Transkripte und ermöglicht die Verarbeitung von Hunderten von Dias gleichzeitig. Wir präsentieren dieses Protokoll mit Expression Profiling der aviären embryonalen Gehirn Bildung als Beispiel.

Radioaktiv In-situ- Hybridisierung zum Nachweis Diverse Genexpressionsmuster in Tissue

Whole Berg RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen

Der Zebrafisch, einem kleinen tropischen Fischen, hat sich zu einem beliebten Modell zum Studium der Genfunktion während Wirbeltiere Entwicklung und Krankheit. Die zeitliche und räumliche Expression von Zielgenen kann bestimmt werden...

Hohe Auflösung Ganze Berge<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung innerhalb Zebrafischembryonen Gene Expression und Funktion zu untersuchen

Wir beschreiben hier ein einfaches Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren zur Lokalisierung von Viren und Bakterien in Insekten-und Pflanzengeweben. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung von mRNA in ganze Berg und mikroskopische Abschnitte erweitert werden.

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Hybrid-Cut-Gewebeschnittmethode, die für widerspenstiges Pflanzengewebe nützlich ist. Gewebeschnitte von guter Qualität ermöglichen anatomische Studien und andere biologische Studien, einschließlich der In-situ-Hybridisierung (ISH).

Hybrid-Cut: Ein verbesserter Schnittverfahren für widerspenstige Pflanzengewebeproben

Die beschriebenen RNA in Situ Hybridisierung Protokoll ermöglicht die Erkennung von RNA in ganze Drosophila Embryos oder seziert Gewebe. Mit 96-Well-Mikrotiterplatten und Tyramide Signalverstärkung, können Protokolle mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Durchsatz und bei relativ geringen Kosten erkannt werden.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren zur Kennzeichnung einzelner Boten-RNA (mRNA) Abschriften mit Fluoreszent-markierten DNA-Sonden für den Einsatz in Einzelmolekül-Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (SmFISH) Experimente in E. Coli. SmFISH ist eine Visualisierungsmethode, die erlaubt die simultane Detektion, Lokalisierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Moleküle in festen Einzelzellen.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Lernen Sie die In-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von mRNA-Expressionsmustern in Pflanzengeweben mit hoher Sensitivität. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisierung von Genexpression im Gewebekontext.

In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

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