In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mRNA-Expressionsmuster auf zellulärer Ebene mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem man formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte zunächst durch eine Reihe von Lösungen führt, um das Wachs zu entfernen, das Gewebe zu permeabilisieren und positiv geladene Aminogruppen im Gewebe zu blockieren, die ein Hintergrundsignal erzeugen können. Anschließend werden DIG-markierte RNA-Sonden, die spezifisch für das Gen von Interesse sind, in die Gewebeschnitte eingebracht, und die Objektträger werden über Nacht hybridisiert.

Anschließend werden die Objektträger mit RNAs behandelt. A, um unspezifisch gebundene Sonden von den Schnitten zu entfernen, und danach mit einem Anti-DIG-Antikörper inkubiert. Dies ermöglicht die Visualisierung der hybridisierten Sonde durch eine farbmetrische chemische Reaktion.

Die Ergebnisse zeigen ein dunkelblaues Signal, das mittels Lichtmikroskopie spezifisch in jenen Zellen des Gewebes nachweisbar ist, in denen das Gen der Untersuchung exprimiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Expressionsanalysen, wie R-T-P-C-R, Mikroarray- oder Next-Generation-Sequencing-Verfahren, besteht darin, dass das hier dargestellte I-Hybridisierungsprotokoll das Expressionsmuster eines Gens der Untersuchung im Gewebekontext offenlegt. Diese Methoden umfassen viele Schritte, die am besten durch visuelle Demonstrationen erlernt werden können.

Wir zeigen, wie man Gewebe schneidet und einbettet, sowie wichtige Schritte im Al-Hybridisierungs-Protokoll, die allein schwer zu beherrschen sind. Die Methode zum Einbetten von mit Paraldehyd fixierten Geweben variiert je nach Art des zu analysierenden Gewebes. Der wichtigste Punkt hierbei ist, sicherzustellen, dass die Proben später korrekt für den Schnitt ausgerichtet sind.

Eine Methode zum Einbetten besteht in der Verwendung von Kunststoffformen und -ringen. Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie die Formen auf einer Heizplatte auf 60 Grad Celsius und gießen anschließend geschmolzenes Paraffin in die Formen. Danach übertragen Sie mit vorgewärmten Pinzetten eine Gewebeprobe in jede Form und positionieren sie in der gewünschten Orientierung.

Bewegen Sie die Form vorsichtig von der Platte auf den Arbeitstisch und setzen Sie den weißen Ring auf die Form. Fügen Sie zusätzlichen Mol und Wachs hinzu. Lassen Sie das Wachs vor dem Schneiden allmählich abkühlen und aushärten.

Wärmen Sie die Blöcke auf Raumtemperatur auf und schneiden Sie jeden Block trapezförmig zurecht, wobei etwa ein Millimeter Wachs um die Probe herum verbleibt. Stellen Sie den zugeschnittenen Block so auf den Mikrotom, dass die längere der beiden parallelen Flächen unten ist. Führen Sie den Block vorsichtig zur Klinge und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Blocks parallel zum Klingenquerschnitt ist.

Mit einer Dicke von acht bis 10 Mikrometern. Richten Sie die Wachsbänder auf einer antihaftbeschichteten Oberfläche, wie beispielsweise Aluminiumfolie, aus und wählen Sie unter einem Zerlege-Mikroskop die gewünschten Schnittabschnitte aus. Markieren Sie anschließend die Prob-Bon-Plus-Objektträger mit einem Bleistift.

Verwenden Sie keine Stifte für die Markierung, da diese während des INI-Zwei-Hybridisierungsprotokolls entfernt werden. Geben Sie je einen Milliliter sauberes Milli-Q-Wasser auf jeden Objektträger. Legen Sie die gewünschten Schnitte vorsichtig bei Raumtemperatur auf die Wasseroberfläche.

Stellen Sie sicher, dass die glänzende Seite dem Wasser zugewandt ist. Überführen Sie den Objektträger langsam auf eine Objektträgererwärmung. Stellen Sie eine Temperatur von 35 bis 37 Grad Celsius ein.

Dieser Temperaturbereich verhindert im Vergleich zu der üblicherweise verwendeten Temperatur von 42 Grad Celsius die Bildung von Blasen unter den Schnitten. Nach fünf Minuten das Wasser vorsichtig, aber in einer fließenden Bewegung abgießen, sodass das Band auf den Objektträger abgesenkt wird. Die Objektträger mindestens mehrere Stunden oder über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen lassen, damit das Gewebe haftet und Gewebeschnitte vorbereitet werden können.

Für die In-situ-Hybridisierung werden sie zunächst entparaffiniert und zur Abschlussentparaffinierung rehydriert. Inkubieren Sie die Objektträger in zwei Wechseln der histischen Klärungslösung je 10 Minuten. Um die Gewebeschnitte zu rehydrieren, führen Sie die Objektträger jeweils 30 Sekunden durch eine Serie abnehmender Ethanol-Konzentrationen.

Während der Proteasebehandlung, die in diesem Video nicht gezeigt wird, bereiten Sie eine Glasschale mit einer 0,1-molaren Triathlonamin-Lösung vor und stellen diese auf einem Rührer in einer Abzugshaube auf. Unmittelbar vor dem Eintauchen des Metallpräparatgestells in die Lösung geben Sie 1,25 Milliliter Essigsäureanhydrid in das Triathlonamin, Puffer und den Abzug. Zusätzlich richten Sie das Klemmsystem und Stativ zur Halterung des Präparatgestells ein.

Verringern Sie die Geschwindigkeit des Rührwerks, befestigen Sie den Objektträgerhalter am Stativ und senken Sie den Halter in die Lösung ab, wobei er über dem Rührstab angehoben bleibt. Fahren Sie mit dem langsamen Rühren für 10 Minuten fort, nachdem die Probe in PBS gespült und erneut durch eine Ethanolreihe dehydriert wurde. Die Gewebeschnitte sind nun bereit für die Hybridisierung.

Legen Sie die Objektträger auf eine saubere Oberfläche und lassen Sie sie vollständig fünf bis zehn Minuten lang an der Luft trocknen. Bereiten Sie die Hybridisierungspuffermischung für die Sonde vor, indem Sie die denaturierte Sonde zu 80 Mikrolitern Hybridisierungspuffer hinzufügen. Für jeden Objektträger gut durch Pipettieren mischen, wobei Blasenbildung vermieden werden sollte.

Pipettieren Sie den Hybridisierungspuffer für die Sonde. Verteilen Sie ihn am rechten Rand des Objektträgers. Senken Sie langsam ein Deckglas auf den Objektträger, und stellen Sie sicher, dass die Hybridisierungslösung alle Schnitte vollständig bedeckt und keine Luftblasen enthalten ist.

Tippen Sie leicht mit dem Finger auf die Abdeckung an den Stellen, an denen sich Blasen bilden, um diese von allen Gewebeschnitten zu verdrängen. Ziehen Sie die Abdeckung nicht ab, da dies die Schnitte beschädigen würde. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtkammer, die mit Watman-Papier ausgelegt ist, das mit UE-Wasser angefeuchtet und größtenteils mit Param bedeckt ist.

Die Box fest verschließen und die Objektträger bei der gewünschten Hybridisierungstemperatur, typischerweise 50 bis 55 Grad Celsius, für 16 bis 20 Stunden inkubieren. Am Ende des Hybridisierungsprotokolls die Deckgläser vorsichtig von den Objektträgern entfernen. Das Deckglas kann einfach abfallen, wenn der Objektträger aufrecht gestellt wird; falls dies nicht der Fall ist, darf das Deckglas nicht abgezogen werden, da dies die Schnitte beschädigen würde.

Stattdessen tauchen Sie den Objektträger nach dem Entfernen der Deckgläser für eine oder zwei Minuten in warme 0,2-fache SSC-Lösung, um das Deckglas abzuwaschen, stellen Sie die Objektträger in einen Halter und waschen Sie sie mehrmals in 0,2-facher SSC-Lösung bei 55 Grad Celsius. Nach der RNase-Behandlung überführen Sie die Objektträger aus dem Halter auf den Boden einer flachen Kunststoffbox und bedecken Sie sie mit einem minimalen Volumen an Blockierungslösung. Blockieren Sie die Objektträger 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem langsam schwingenden Plattformshaker.

Als Nächstes geben Sie ein minimales Volumen der Antikörperlösung direkt auf jeden Objektträger. Inkubieren Sie die Objektträger zwei bis drei Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur. Nach Beendigung der Inkubation überführen Sie die Objektträger in eine saubere flache Box und waschen Sie viermal mit einem minimalen Volumen Waschpuffer auf einer schwingenden Plattform bei Raumtemperatur.

Spülen Sie die Objektträger einmal in TBS und zweimal in TN-Puffer, um die Anwendung der frisch zubereiteten Färbungslösung auf die Objektträger vorzubereiten. Gießen Sie zunächst die Färbungslösung in eine kleine Kunststoff-Wiegeschale. Anschließend befestigen Sie zwei Objektträger miteinander, wobei die Schnittflächen aufeinander zeigen.

Tauchen Sie das Präparat in die Lösung, wobei die Kapillarwirkung die Lösung aufziehen lässt. Lassen Sie die Objektträger auf einem Kim-Tuch abtropfen. Füllen Sie die Objektträger mit der Färbelösung auf.

Auch hier müssen die Objektträger möglicherweise angeklopft werden, während die Lösung zugegeben wird, um Blasenbildung zu vermeiden; stellen Sie die Objektträger in eine Plastikbox und lagern Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln. Hier werden repräsentative Ergebnisse mit verschiedenen Sonden und Geweben von Arabidopsis dargestellt. Das violette Signal ermöglicht eine direkte Visualisierung des Expressionsmusters des interessierenden Gens mit zellulärer Auflösung.

Abbildung A zeigt die Lokalisation der Spross-Meli-eins-Transkripte in der vegetativen Sprossspitze. Beachten Sie das Vorhandensein eines violett-blauen Signals im unbestimmten Bereich des Meristems und das Fehlen eines Signals in den umgebenden Blättern. Die Abbildungen B–2D zeigen Schnitte von Arabidopsis-Torpedo-Embryonen, wobei B die Expression von Covata-drei in den wenigen embryonalen Stammzellen darstellt.

C zeigt eine T ML-Eine-Expression in der epidermalen Schicht, und D zeigt das Fehlen eines Signals in Schnitten, die mit einer zufälligen negativen Kontroll-RNA untersucht wurden. Diese nächsten Bilder zeigen Ergebnisse, die mit verschiedenen Sonden an Maisgeweben erhalten wurden. Panel E zeigt die Lokalisation von STM Humalog knotted one im sich entwickelnden Maisembryo.

Beachten Sie das starke Signal spezifisch im embryonalen Mes und in Längsschnitten durch die Wurzel durch die vegetative Scheide, die zeigen, dass ARF three A auf der axialen Unterseite der Blattoberfläche in Panel F exprimiert wird, und das A T ML one Homolog OCL four spezifisch in der Epidermis exprimiert ist. In Panel G. Wie erwartet, wurde für die negative Kontrollsonde in Panel H kein Hybridisierungssignal beobachtet. Die erwarteten Ergebnisse der verschiedenen Kontrollpunkte während der In-vitro-Transkription von Sonden werden hier gezeigt. Die In-situ-Hybridisierungs-Sonden werden nach der In-vitro-Transkription, nach der DNA-Behandlung und anschließender Reinigung der In-vitro-Transkriptionsreaktion auf einem standardmäßigen ARAZ-Gel überprüft, nach Carbonathydrolyse und wenn sie für Sonden mit einer Länge von über 250 Basenpaaren, wie beispielsweise Sonde eins, gebrauchsfertig sind. Die Carbonathydrolyse ergibt dann eine Bandbreite kleinerer Sondenfragmente.

Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Farb- und Metrikqualifizierung von Sonden mittels Dot-Blot-Analyse mit Verdünnungen im Bereich von 10 hoch minus eins bis 10 hoch minus fünf einer 100 Nanogramm pro Mikroliter Kontrollsonde sowie von drei neu markierten DIG-markierten Sonden, die auf eine Transfermembran aufgetragen, mit anti-DIG-Antikörper inkubiert und im Assay detektiert wurden. Die Analyse legt eine geschätzte Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde zwei, 10 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde drei und 1 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde vier nahe, was darauf hindeutet, dass Sonde vier voraussichtlich kein gutes Hybridisierungssignal liefern wird. Schließlich bieten diese Längsschnitte durch die vegetative Keimspitze von Mace einen Vergleich zwischen einem unspezifischen Hintergrundsignal und einem gut funktionierenden Sondenset.

A zeigt ein unspezifisches Hintergrundsignal, während Feld B ein spezifisches in-situ-Hybridisierungssignal für die OC-fünf-Sonde in der äußeren Zellschicht darstellt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie viele der schwierigen Schritte in den In-situ-Hybridisierungsprotokollen durchgeführt werden, sodass Sie die präzisen räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster Ihres Lieblingsgens bestimmen können.