In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, mRNA-Expressionsmuster auf zellulärer Ebene mit hoher Sensitivität und Spezifität zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst formale und fixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte durch eine Reihe von Lösungen genommen werden, um das Wachsperme des Gewebes zu entfernen und positiv geladene kleinere Gruppen im Gewebe zu blockieren, die ein Hintergrundsignal erzeugen können. Anschließend werden A-DIG-markierte RNA-Sonden, die spezifisch für das interessierende Gen sind, in die Gewebeschnitte infiltriert und die Objektträger über Nacht hybridisiert.

Als nächstes werden die Objektträger mit RNAs behandelt. A, um die unspezifisch gebundene Sonde aus den Schnitten zu entfernen und dann mit Anti-DIG-Antikörpern zu inkubieren. Dies ermöglicht die Visualisierung der hybridisierten Sonde durch eine farbmetrische chemische Reaktion.

Die Ergebnisse zeigen ein dunkelblaues Signal, das mit der Lichtmikroskopie spezifisch in den Zellen innerhalb des Gewebes nachweisbar ist, in denen das interessierende Gen exprimiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren anderen Expressionsanalysen, wie z.B. R-T-P-C-R, Mikrostrahlen- oder Next Generation Sequencing-Ansätzen, besteht darin, dass das hier gezeigte I-Hybridisierungsprotokoll das Expressionsmuster eines Gens von Interesse in seinem Gewebekontext aufzeigt. Diese Methoden umfassen viele Schritte, die am besten durch visuelle Demonstrationen erlernt werden.

Wir zeigen, wie Gewebe geschnitten und eingebettet wird, sowie die wichtigsten Schritte im Al-Hybridisierungs-Pro-Protokoll, die alleine nur schwer zu meistern sind. Die Methode zur Einbettung von paraldehydfixiertem Gewebe variiert je nach Art des zu analysierenden Gewebes. Hier kommt es vor allem darauf an, dass die Proben für die spätere Schnittung richtig ausgerichtet sind.

Eine Methode des Einbettens ist die Verwendung von Kunststoffformen und -ringen. Um diesen Vorgang zu starten, erwärmen Sie die Formen auf einer 60 Grad Celsius warmen Warmhalteplatte und gießen Sie dann geschmolzenes Paraffin in die Formen. Als nächstes wird mit einer erwärmten Pinzette eine Gewebeprobe in jede Form übertragen und in die gewünschte Position gebracht.

Bewegen Sie die Form vorsichtig von der Platte auf die Bank und setzen Sie den weißen Ring auf die Form. Fügen Sie zusätzliches Mol und Wachs hinzu. Lassen Sie das Wachs abkühlen und vor dem Schneiden allmählich aushärten.

Erwärmen Sie die Blöcke auf Raumtemperatur und schneiden Sie dann jeden Block in eine trapezförmige Form, wobei etwa ein Millimeter Wachs um die Probe herum verbleibt. Legen Sie den zugeschnittenen Block so auf das Mikrotom, dass die längere der beiden parallelen Flächen unten liegt. Bringen Sie den Block vorsichtig nach vorne zur Klinge und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Blocks parallel zum Klingenabschnitt ist.

Als Dicke von acht bis 10 Mikrometern. Richten Sie die Wachsbänder auf einer antihaftbeschichteten Oberfläche, z. B. Aluminiumfolie, aus und wählen Sie die gewünschten Abschnitte unter einem Präparierbereich aus. Markieren Sie anschließend Prob bon plus Folien mit einem Bleistift.

Verwenden Sie keine Stifte auf Markern, da diese während des INI-Zwei-Hybridisierungsprotokolls gelöscht werden. Verteilen Sie einen Milliliter sauberes Milli Q Wasser auf jeden Objektträger. Treiben Sie die interessierenden Abschnitte vorsichtig bei Raumtemperatur auf der Wasseroberfläche.

Achten Sie darauf, dass die glänzende Seite zum Wasser zeigt. Übertragen Sie die Folie langsam auf einen Folienwärmer. Auf 35 bis 37 Grad Celsius eingestellt.

Dieser Temperaturbereich verhindert im Gegensatz zu den üblichen 42 Grad Celsius die Bildung von Blasen unter den Sektionen. Gießen Sie das Wasser nach fünf Minuten vorsichtig, aber in einer gleichmäßigen Bewegung ab, so dass das Band auf die Rutsche abgesenkt wird. Lassen Sie die Objektträger mindestens mehrere Stunden oder über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen, damit das Gewebe an vorbereiteten Gewebeschnitten haftet.

Für die In-situ-Hybridisierung werden sie zunächst depa und für die Depa-Finalisierung rehydriert. Inkubieren Sie die Objektträger in zwei Wechseln der klaren Lösung für jeweils 10 Minuten. Um die Gewebeschnitte zu rehydrieren, führen Sie die Objektträger jeweils 30 Sekunden lang durch eine Reihe von abnehmenden Ethanolkonzentrationen.

Während der Proteasebehandlung, die in diesem Video nicht gezeigt wird, bereiten Sie eine Glasschale mit 0,1 molaren Triathlon-Aminlösung vor und stellen Sie diese auf einer Rührplatte in einem Abzug auf. Unmittelbar bevor Sie das Metallschiebegestell in die Lösung legen, geben Sie 1,25 Milliliter Essigsäureanhydrid in das Triathlon-Amin, den Puffer und das Treppenhaus. Richten Sie zusätzlich das Spannsystem und den Ständer zum Halten des Schlittens ein.

Reduzieren Sie die Geschwindigkeit des Starr, klemmen Sie das Schiebegestell auf den Ständer und senken Sie das Gestell in die Lösung, so dass es über dem Rührstab angehoben bleibt. Rühren Sie 10 Minuten lang langsam weiter, nachdem Sie in PBS gespült und erneut durch eine Ethanolserie dehydriert wurden. Die Gewebeschnitte sind bereit für die Hybridisierung.

Legen Sie die Objektträger auf eine saubere Oberfläche und lassen Sie die Luft fünf bis 10 Minuten lang vollständig trocknen. Bereiten Sie die Mischung aus Sonden-Hybridisierungspuffer vor, indem Sie die denaturierte Sonde zu 80 Mikrolitern Hybridisierungspuffer hinzufügen. Mischen Sie jeden Objektträger gut durch Pipettieren und vermeiden Sie Blasenbildung.

Pipettieren Sie den Sonden-Hybridisierungspuffer. Auf den rechten Rand der Folie mischen. Senken Sie ein Deckglas nach und nach auf den Objektträger ab und achten Sie darauf, dass die Hybridisierungslösung alle Abschnitte blasenfrei abdeckt.

Klopfen Sie mit dem Finger leicht mit dem Finger auf den Abdeckschnitt, wo sich Blasen bilden, um sie von allen Gewebeabschnitten zu verdrängen. Ziehen Sie den Deckelschnitt nicht ab, da dies die Abschnitte beschädigen kann. Legen Sie die Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer mit Watman-Papier, das mit UE-Wasser angefeuchtet und größtenteils mit Param bedeckt ist.

Verschließen Sie die Schachtel fest und inkubieren Sie die Objektträger bei der gewünschten Hybridisierungstemperatur, typischerweise 50 bis 55 Grad Celsius für 16 bis 20 Stunden. Entfernen Sie nach Abschluss des Hybridisierungsprotokolls vorsichtig die Deckgläser von den Objektträgern. Der Deckglas kann einfach abfallen, wenn die Rutsche aufrecht gestellt wird, aber wenn nicht, ziehen Sie den Deckglas nicht ab, da dies die Abschnitte beschädigen kann.

Tauchen Sie die Folie stattdessen für ein bis zwei Minuten in warme 0,2 mal SSC, um den Eindeckschoffer nach dem Entfernen der Eindeckschlüsse abzuwaschen, legen Sie die Dias in ein Gestell und waschen Sie sie mehrmals in 0,2 x SSC bei 55 Grad Celsius. Nach der RNA-Behandlung werden die Objektträger aus dem Gestell auf den Boden einer flachen Kunststoffbox übertragen und mit einer minimalen Menge an Blockierungslösung abgedeckt. Blockieren Sie die Rutschen für 45 Minuten bei Raumtemperatur auf einer langsam schüttelnden Plattform.

Tragen Sie anschließend ein minimales Volumen der Antikörperlösung direkt auf jeden Objektträger auf. Inkubieren Sie die Objektträger zwei bis drei Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, werden die Objektträger in eine saubere, flache Box umgefüllt und die Objektträger viermal mit einem minimalen Volumen Waschpuffer auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur gewaschen.

Spülen Sie die Objektträger einmal in TBS und zweimal in TN-Puffer aus, um die frisch zubereitete Färbelösung auf die Objektträger aufzutragen. Gießen Sie zuerst die Färbelösung in eine kleine Wägeschale aus Plastik. Platzieren Sie dann zwei Folien mit den gegenüberliegenden Abschnitten.

Tauchen Sie das Sandwich in die Lösung und lassen Sie die Kapillarwirkung nach oben. Lassen Sie die Objektträger mit einem Kim-Tuch abtropfen. Füllen Sie die Objektträger mit Färbelösung.

Auch hier muss es sein, dass die Objektträger beim Einfließen der Lösung angeklopft werden müssen, um Blasen zu vermeiden, die Objektträger in eine Plastikbox zu legen und die Raumtemperatur im Dunkeln zu lagern. Repräsentative Ergebnisse, die mit verschiedenen Sonden und Arabidopsis-Geweben erzielt wurden, sind hier dargestellt. Das violette Signal ermöglicht eine direkte Visualisierung des Expressionsmusters des interessierenden Gens mit zellulärer Auflösung.

Panel A zeigt die Lokalisation von Spross-Meli one-Transkripten in der vegetativen Sprossspitze. Beachten Sie das Vorhandensein eines violett-blauen Signals in der Unbestimmtheit des Meristems und das Fehlen eines Signals in den umgebenden Blättern. Die Tafeln B 2D sind Schnitte von Embryonen im Arabidopsis-Torpedostadium, wobei B in den wenigen embryonalen Stammzellen die Expression von Covata drei zeigt.

C zeigt eine T ML-Expression in der epidermalen Schicht und D zeigt das Fehlen eines Signals in Schnitten, die mit einer zufälligen negativen Kontroll-RNA untersucht wurden. Die nächsten Bilder zeigten Ergebnisse, die mit verschiedenen Sonden an Labyrinthgeweben erzielt wurden. Bild E zeigt die Lokalisation des STM Humalog verknoteten Embryos im sich entwickelnden Labyrinth-Embryo.

Beachten Sie, dass das starke Signal, spezifisch in den embryonalen mes-, Stamm- und Wurzellängsschnitten durch die vegetative Rutsche, zeigt, dass ARF drei A auf der axialen unteren Blattoberfläche in Feld F exprimiert wird und das A T ML ein homologes OCL vier spezifisch in der Epidermis exprimiert wird. In Panel G.As wurde erwartungsgemäß kein Hybridisierungssignal für die negative Kontrollsonde in Panel H beobachtet.Die erwarteten Ergebnisse der verschiedenen Checkpoints während der in vitro Transkription der Sonden sind hier dargestellt. Die In-situ-Hybridisierungssonden werden nach der In-vitro-Transkription nach der DNA-Behandlung und der anschließenden Aufreinigung der In-vitro-Transkriptionsreaktion an einem Standard-ARAZ-Gel überprüft. Nach der Karbonathydrolyse und wenn sie für Sonden mit einer Länge von mehr als 250 Basenpaaren, wie z. B. Sonde eins, verwendet werden kann, ergibt die Karbonathydrolyse eine Reihe kleinerer Sondenfragmente.

Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Farb- und metrischen Qualifizierung von Sonden durch Dot-Blot-Analyseverdünnungen von 10 bis minus eins bis 10 bis minus fünf einer Kontrollsonde von 100 Nanogramm pro Mikroliter und von drei neu markierten DIG-markierten Sonden werden auf einer Transfermembran gespottet, die mit Anti-DIG-Antikörper und Assay inkubiert ist. Die Analyse deutet auf eine geschätzte Konzentration von 100 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde zwei, 10 Nanogramm pro Mikroliter für Sonde drei und ein Nanogramm pro Mikroliter für Sonde vier hin, was darauf hindeutet, dass Sonde vier wahrscheinlich kein gutes Inea-zu-Hybridisierungssignal liefert. Schließlich ermöglichen diese Längsschnitte durch die Spitze der vegetativen Rutsche von Mace einen Vergleich zwischen einem unspezifischen Hintergrundsignal und einem gut funktionierenden Sondenpanel.

A zeigt ein unspezifisches Hintergrundsignal, während Panel B ein spezifisches in situ zwei Hybridisierungssignal für die OC fünf Sonde in der äußeren Zellschicht zeigt. Nachdem Sie dies gesehen haben, sollten Sie ein gutes Gespür dafür haben, wie Sie viele der kniffligen Schritte in den Init-Hybridisierungsprotokollen ausführen können, so dass Sie die genauen druckzeitlichen Expressionsmuster Ihrer Lieblingsteenager bestimmen können.