Eine einfache Methode zur Isolierung der Sojabohne Protoplasten und Anwendung auf vorübergehende Genexpressionsanalysen

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, qualitativ hochwertige Protoplastenzellen aus Sojabohnen zu gewinnen, um Regulations- und Signalmechanismen in lebenden Sojabohnenzellen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in regulativen Netzwerken zu beantworten, z. B. was ihr unmittelbares Zielgen ist, der Transfusionsfaktor öffnet, und was ihr Interaktionspartner ist, ein Protein zu öffnen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kunst.

Es produziert große Mengen an einheitlichen Sojabohnen-Protoplastenzellen, und es ist einfach und leicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es sehr schwierig ist, schöne Protoplasten aus Sojabohnenblättern zu erhalten, es sei denn, Sie machen in einem bestimmten Stadium ein Einblatt. Die Auswahl der Blätter in einem geeigneten Entwicklungsstadium ist der Schlüssel zu einem erfolgreichen Protoplastenpräparat aus Sojabohnen.

Schneiden Sie neu expandierte, einblättrige Blätter von 10 Tage alten Sojakeimlingen ab. Um sicherzustellen, dass, wenn eine Probe einen hohen Protoplastenertrag ergibt, sammeln Sie mindestens drei Proben von einblättrigen Blättern in leicht unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Entfernen Sie mit einer frischen Rasierklinge die Mittelrippe von jedem einblättrigen Blatt und schneiden Sie dann die Reste in 0,5 bis einen Millimeter große Streifen.

Übertragen Sie die Blattstreifen mit einer Pinzette sofort vorsichtig in 10 Milliliter frisch zubereitete Enzymlösung in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Vakuuminfiltrieren Sie die Blattstreifen für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Blattstreifen in der Enzymlösung unter leichtem Rühren bei schwachem Licht für vier bis sechs Stunden bei Raumtemperatur.

Wenn Protoplasten freigesetzt werden, färbt sich die Enzymlösung gelbgrün. Überprüfen Sie die Enzym-Protoplasten-Lösung unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung, um die Probe mit dem besten Protoplastenaufschluss auszuwählen. Die freigesetzten Protoplasten haben eine kugelförmige Form, während die unverdauten Zellen unregelmäßige oder ovale Formen haben.

Um den Aufschluss zu stoppen, gießen Sie die 10 Milliliter Enzym-Protoplastenlösung mit dem besten Protoplastenaufschluss vorsichtig in ein 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 10 Milliliter W5-Lösung bei Raumtemperatur hinzu. Drehen Sie das Rohr einige Male vorsichtig um. Gießen Sie dann die Enzym-Protoplastenlösung vorsichtig in ein sauberes 75-Mikron-Nylonnetz, das auf ein 50-Milliliter-Röhrchen gelegt wird, um das unverdaute Blattgewebe zu entfernen.

Als nächstes zentrifugieren Sie den Durchfluss durch die Enzym-Protoplastenlösung bei 100-facher G-Temperatur für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Serologiepipette, um den Überstand vorsichtig zu entfernen, ohne das Protoplastenpellet zu stören. Suspendieren Sie den Protoplasten in gekühlter W5-Lösung und halten Sie das 50-Milliliter-Röhrchen auf Eis.

Nach dem Zählen der Protoplastenzahl auf einem Hämozytometer unter dem Mikroskop auf eine Konzentration von zweimal 10 bis zum fünften Protoplasten pro Milliliter in gekühlter W5-Lösung verdünnen. Lassen Sie den Protoplasten 30 Minuten auf Eis. Die Suspension wird bei 100 mal G für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Pipette, um die W5-Lösung vorsichtig zu entfernen, ohne das Protoplasten-Pellet zu stören. Resuspendieren Sie den Protoplasten in MMG-Lösung bei Raumtemperatur in einer Konzentration von zweimal 10 bis zum fünften Protoplasten pro Milliliter. Um den Protoplasten für die Umwandlung vorzubereiten, verwenden Sie ungeschnittene 200-Mikroliter-Pipettenspitzen, um 100-Mikroliter-Aliquots von Protoplasten in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Haftung herzustellen.

Ein Aliquot wird als Negativkontrolle beiseite gelegt. Zu dem verbleibenden Aliquot der Protoplasten fügen Sie 10 Mikroliter Plasmid-DNA hinzu. Geben Sie langsam 110 Mikroliter frisch zubereitete Stiftlösung auf die Innenwand des 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens.

Dann das Röhrchen vorsichtig umdrehen und drehen, bis die Lösung homogen wird. Die Transformationsmischungen werden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Um die Umwandlung zu stoppen, geben Sie langsam 400 Mikroliter W5-Lösung zu jedem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei Raumtemperatur und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, bis die Lösung homogen wird.

Die Röhrchen werden bei 100 mal G für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand. Geben Sie einen Milliliter WI-Lösung in jedes Röhrchen.

Beschichten Sie die Well-Oberfläche einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte, um zu verhindern, dass die Protoplasten an der Platte kleben. Geben Sie einen Milliliter fünf Prozent steriles Kälberserum in jede Vertiefung und entfernen Sie das Kälberserum nach einigen Sekunden mit einer Pipette. Übertragen Sie die resuspendierten Protoplasten in die Vertiefungen der Kulturplatte und decken Sie die Platte mit einem Deckel ab.

Vor der Ernte inkubieren Sie die Protoplasten zwei Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Übertragen Sie die Protoplastenlösung nach zwei Tagen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion. Die Röhrchen werden bei 100 mal G für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Übertragen Sie 10 Mikroliter Protoplasten auf einen Objektträger. Beobachten Sie Fluoreszenzsignale unter Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskopie mit nicht-transformierten Protoplasten als Negativkontrolle.

Protoplastenzellen wurden aus verschiedenen Organen von 10 Tage alten Sojabohnen hergestellt und unter dem Mikroskop betrachtet. Zellwände aus hypokaudaler und epikaudaler Form wurden kaum verdaut. Und einige Zellen blieben aneinander gebunden.

Bei kaudalem Blei und Wurzel wurden die Zellwände nur in einem kleinen Teil der Zellen entfernt. Im Gegensatz dazu wurde eine große Anzahl von Protoplasten beobachtet, wenn Unifoliat verwendet wurde. Die Sämlinge auf diesem Foto von links nach rechts zeigen einblättrige Blätter, die nicht expandiert, nur expandiert oder vollständig ausgestreckt sind.

Während sowohl die unexpandierten als auch die gerade expandierten einblättrigen Blätter zu hohen Erträgen an Protoplasten führten, war die Größe der Protoplasten des gerade expandierten Einblattblatts gleichmäßiger als die des nicht expandierten Einblattblatts. Bei dem vollständig expandierten Unifoliat waren die Zellwände in den meisten Zellen noch intakt. Die Untersuchung einer Reihe unterschiedlicher Mengen an Plasmid-DNA deutete darauf hin, dass größere Mengen an DNA zu einer höheren Transformationseffizienz führten.

Konfokale Bilder von Sojabohnen-Protoplasten, die mit dem Konstrukt transformiert wurden, das GFP exprimiert, das mit dem hülsenfruchtspezifischen E1-Gen fusioniert ist, zeigten eine nukleare Lokalisierung des E1-GFP-Fusionsproteins, die mit der vorherigen Studie unter Verwendung des Arabidopsis-Protoplastensystems übereinstimmt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jede experimentelle Bedingung empirisch zu optimieren, wie z. B. die Auswahl des richtigen Stadiums des Blattmaterials, die Länge der Zellwandverdauungszeit, das Konzentrationsalter und die Menge der Plasmid-DNA für die Transformation. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie RNA- und Proteinreplikation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welche Gene oder welche Proteine sind reguliert oder nicht reguliert

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie qualitativ hochwertige Soja-Protoplastenzellen erhalten können.