Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochpräzise molekulare Modelle von Viren oder makromolekularen Komplexen zu erstellen, indem die Einzelpartikelanalyse auf hochauflösende Bilder von Strukturen mit fluoreszenzmarkierten Komponenten angewendet wird. Diese Methode kann zentrale Fragen der Virologie beantworten, unter anderem zur Proteinarchitektur komplexer Viren und wie sich diese im Verlauf der Infektion verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass durch das Sammeln mehrerer Bilder derselben Struktur eine hochpräzise Karte ihrer Komponenten erstellt werden kann.

Diese Methode kann zwar Einblicke in die Struktur von Viren geben, aber auch auf andere Systeme wie andere Krankheitserreger und makromolekulare Komplexe in Säugetierzellen angewendet werden. Zuerst wird die Probe mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Erfassen Sie Bilder von mehreren Sichtfeldern, die Hunderte bis Tausende von gut getrennten Partikeln ohne unerwünschte fluoreszierende Strukturen enthalten.

Nachdem die Bilder abgerufen und verarbeitet wurden, importieren und verketten Sie die Bilder in einen Stapel mit interkalierten Kanälen. Konvertieren Sie bei Bedarf das verkettete Bild von einem Hyper-Stack in einen Stack. Wählen Sie anschließend im Untermenü "VirusMapper die Option "Virale Strukturen extrahieren" und legen Sie den Dateipfad für die extrahierten Partikel fest.

Geben Sie die Anzahl der abgebildeten Fluoreszenzkanäle ein. Legen Sie den Referenzkanal auf den Fluoreszenzkanal fest, in dem die Partikel am gleichmäßigsten dargestellt werden. Wenn diesen Partikeln ein zentrales Maximum fehlt, wenden Sie die Gaußsche Unschärfe vor der Detektion an, um das Erscheinungsbild eines Partikels zu induzieren.

Schätzen Sie als Nächstes den Durchmesser der größten Partikel in Pixeln. Legen Sie den ROI-Radius auf etwas mehr als die Hälfte dieses Werts fest. Schätzen Sie die Anzahl der pro Frame erforderlichen ROIs.

Verwenden Sie zunächst nicht mehr als hundert ROIs. Legen Sie die maximale ROI-Überlappung basierend auf der Partikeltrennung fest. Zeigen Sie eine Vorschau der ROIs für diesen Frame an.

Passen Sie den Radius, die Anzahl der ROIs und die maximale Überlappung so an, dass jedes Partikel im Frame in einem einzigen ROI eingeschlossen ist. Stellen Sie sicher, dass die ROIs mindestens einige Pixel breiter sind als die der größten Partikel. Klicken Sie dann auf "OK", um die Segmentierung auszuführen.

Schließen Sie das Beispielbild nach der Extraktion im ROI-Manager. Benennen Sie die extrahierten Partikelsätze nicht um. Wählen Sie "Generate Seeds" und öffnen Sie den Ordner mit den extrahierten Partikeldaten.

Legen Sie den Referenzkanal fest und wählen Sie alle Kanäle aus, für die ein Seed generiert werden soll. Falls erforderlich, um den Vorgängermodellen zu entsprechen, drehen Sie die Samen um neunzig Grad. Bei Kanälen, in denen den Partikeln ein zentrales Maximum fehlt, erhöhen Sie den Wert für die Gaußsche Unschärfe vor der Ausrichtung wie zuvor.

Wenn die Kanäle nicht eng ausgerichtet sind, aktivieren Sie die Shift-Korrektur für die Nicht-Referenzkanäle. Durchsuchen Sie die Partikelsequenz nach einer konsistent erscheinenden Struktur. Identifizieren Sie ein repräsentatives Partikel und geben Sie die entsprechende Frame-Nummer in das Feld "Zu verwendende Frames" ein.

Überprüfen Sie die resultierenden Samen. Die Saatgutauswahl ist eine kritische Phase dieses Verfahrens. Betrachten Sie die Rohdaten sorgfältig, um eine oder mehrere zu modellierende Strukturen zu identifizieren.

Die Qualität des Modells hängt stark von der Auswahl des Saatguts ab, das diese Strukturen genau widerspiegelt. Passen Sie den Referenzkanal, den Gaußschen Weichzeichnungsradius und die Verschiebungskorrektur nach Bedarf an, um die Identifizierung zusätzlicher Frames mit ähnlichen Ausgangswerten zu optimieren. Fügen Sie weitere Rahmen hinzu und passen Sie die Generierungsparameter an, bis die durchschnittliche Struktur eine beobachtete Struktur in den Daten am besten darstellt.

Geben Sie den Ordnernamen und das Dateipräfix für die Seeds ein. Klicken Sie auf "OK", um die Seed-Bilder für die spätere Modellierung zu speichern. Wählen Sie "Modelle basierend auf Ausgangswerten generieren" und öffnen Sie den extrahierten Partikelordner.

Laden Sie die Seed-Durchschnitte für jeden Kanal. Wenn Sie eine referenzbasierte Strukturermittlung durchführen, wählen Sie einen Referenzkanal für die Ausrichtung aus. Die bekannte Partikelstruktur in einem Kanal kann als Referenz verwendet werden, um einen zweiten unbekannten Kanal auszurichten.

Dies ermöglicht eine unvoreingenommene Kartierung der unbekannten Struktur. Beachten Sie, dass die chromatische Verschiebung zwischen den Kanälen im Voraus korrigiert werden muss. Wenn bei der Analyse nach kleinen Unterschieden oder subtilen Merkmalen im Modell gesucht wird, wählen Sie Quadratische Bildintensität während des Vorlagenabgleichs aus.

Legen Sie die minimale Ähnlichkeit auf sechzig bis achtzig Prozent und die Anzahl der Iterationen auf eins fest. Wählen Sie Modelle und Partikel aus, die während der Berechnung angezeigt werden sollen, und generieren Sie die Vorschaumodelle. Überprüfen Sie die Vorschaumodelle.

Erhöhen Sie die minimale Ähnlichkeit, um nur Partikel mit der gewünschten Morphologie einzubeziehen. Optimieren Sie bei Bedarf weitere Parameter der Modellberechnung und wählen Sie bei der Modellerstellung zusätzliche Elemente aus, die bei Bedarf angezeigt werden sollen. Sobald die Vorschaumodelle zufriedenstellend sind, erhöhen Sie die Anzahl der Iterationen auf zehn.

Legen Sie den Ordnernamen und das Dateipräfix fest. Klicken Sie auf "OK", um die Modellentwicklungsstapel zu speichern, die alle Iterationen des endgültigen Modells enthalten. Ein rekombinantes Vaccinia-Virus mit zwei Proteinen, die mit grün und rot fluoreszierenden Proteinen markiert sind, wurde mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie abgebildet und mit dem VirusMapper-Plug-in modelliert.

Die Seeds wurden getrennt für die frontale und sagittale Orientierung generiert, die jeweils aus fünf repräsentativen Partikeln gemittelt wurden. Je nach Ausrichtung des Virus können ein oder zwei Seitenkörper unterschieden werden. Daher können für die beiden Orientierungen separate Modelle generiert werden.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der Modelle weitgehend von der Qualität der erfassten Rohdaten abhängt. Die Einzelpartikelanalyse kann zwar die Präzision erhöhen, aber keine schlechte Bildqualität ausgleichen. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine weitere Quantifizierung oder Modellanpassung an diesen Modellen durchgeführt werden.

Dies kann helfen, zusätzliche Fragen zu beantworten, insbesondere zu Veränderungen der Virusarchitektur im Nanomaßstab während einer Infektion. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Einzelpartikelanalysesoftware VirusMapper verwenden, um Modelle der molekularen Architektur aus hochauflösenden Bildern zu generieren.