Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochpräzise molekulare Modelle von Viren oder makromolekularen Komplexen zu erstellen, indem die Einzelteilchenanalyse auf Super-Auflösungs-Bilder von Strukturen mit fluoreszenzmarkierten Komponenten angewandt wird. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Virologie beantworten, beispielsweise zur Proteinarchitektur komplexer Viren und deren Veränderungen im Verlauf einer Infektion. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch die Aufnahme mehrerer Bilder derselben Struktur eine hochpräzise Karte ihrer Komponenten erstellt werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Struktur von Viren ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, wie beispielsweise andere Pathogene und makromolekulare Komplexe in Säugetierzellen. Bilden Sie zunächst die Probe mittels Super-Resolution-Fluoreszenzmikroskopie ab. Nehmen Sie Bilder mehrerer Bildfelder auf, die Hunderte bis Tausende gut getrennter Partikel ohne unerwünschte fluoreszierende Strukturen enthalten.

Nachdem die Bilder gewonnen und verarbeitet wurden, importieren und verketten Sie die Bilder zu einem Stapel mit interkalierten Kanälen. Falls erforderlich, konvertieren Sie das verkettete Bild von einem Hyper-Stapel in einen Stapel. Wählen Sie anschließend im VirusMapper-Untermenü „Extrahieren viraler Strukturen“ aus und legen Sie den Dateipfad für die extrahierten Partikel fest.

Geben Sie die Anzahl der aufgenommenen Fluoreszenzkanäle ein. Legen Sie den Referenzkanal auf den Fluoreszenzkanal fest, in dem die Partikel das konsistenteste Erscheinungsbild aufweisen. Falls diese Partikel kein zentrales Maximum aufweisen, wenden Sie eine Gauss’sche Weichzeichnung vor der Detektion an, um ein solches zu erzeugen.

Als Nächstes schätzen Sie den Durchmesser der größten Partikel in Pixeln. Legen Sie den ROI-Radius etwas größer als die Hälfte dieses Wertes fest. Schätzen Sie die Anzahl der pro Bild benötigten ROIs.

Verwenden Sie zunächst nicht mehr als hundert ROI. Legen Sie die maximale ROI-Überlappung basierend auf der Teilchenabtrennung fest. Zeigen Sie eine Vorschau der ROI für diesen Frame an.

Passen Sie den Radius, die Anzahl der ROIs und die maximale Überlappung so an, dass jedes Teilchen im Bild von einem einzelnen ROI umschlossen wird. Stellen Sie sicher, dass die ROIs mindestens um einige Pixel breiter sind als die größten Teilchen. Klicken Sie dann auf „OK“, um die Segmentierung durchzuführen.

Schließen Sie das Beispielbild im ROI-Manager nach der Extraktion. Benennen Sie die extrahierten Partikelsätze nicht um. Wählen Sie „Generiere Keime“ und öffnen Sie den Ordner mit den extrahierten Partikeldaten.

Legen Sie den Referenzkanal fest und wählen Sie alle Kanäle aus, für die ein Seed generiert werden soll. Falls erforderlich, um mit früheren Modellen übereinzustimmen, drehen Sie die Seeds um neunzig Grad. Erhöhen Sie bei Kanälen, in denen die Partikel kein zentrales Maximum aufweisen, den Wert der vorgeschalteten Gaußschen Weichzeichnung wie zuvor.

Wenn die Kanäle nicht genau ausgerichtet sind, aktivieren Sie die Verschiebungskorrektur für die Nicht-Referenzkanäle. Suchen Sie in der Partikelsequenz nach einer durchgängig sichtbaren Struktur. Identifizieren Sie ein repräsentatives Partikel und geben Sie die entsprechende Bildnummer im Feld „Frames to use“ ein.

Überprüfen Sie die resultierenden Samen. Die Samenauswahl ist eine entscheidende Phase dieses Verfahrens. Untersuchen Sie die Rohdaten sorgfältig, um eine oder mehrere Strukturen zu identifizieren, die modelliert werden sollen.

Die Modellqualität hängt stark von der Wahl der Samen ab, die diese Strukturen genau widerspiegeln. Passen Sie den Referenzkanal, den Radius der Gaußschen Weichzeichnung und die Schiebekorrektur nach Bedarf an, um die Identifizierung zusätzlicher Bilder mit ähnlichen Samen zu optimieren. Fügen Sie weiterhin Bilder hinzu und justieren Sie die Generierungsparameter, bis die durchschnittliche Struktur eine beobachtete Struktur in den Daten bestmöglich darstellt.

Geben Sie den Ordnernamen und die Dateibenennung für die Samen ein. Klicken Sie auf „OK“, um die Bilddaten der Samen für spätere Modellierungen zu speichern. Wählen Sie „Modelle basierend auf Samen generieren“ und öffnen Sie den Ordner mit den extrahierten Partikeln.

Laden Sie die Seed-Durchschnittswerte für jeden Kanal. Wenn eine referenzbasierte Strukturbestimmung durchgeführt wird, wählen Sie einen Referenzkanal zur Ausrichtung. Eine bekannte Partikelstruktur in einem Kanal kann als Referenz verwendet werden, um einen zweiten unbekannten Kanal auszurichten.

Dies ermöglicht eine unvoreingenommene Abbildung der unbekannten Struktur. Beachten Sie, dass die chromatische Verschiebung zwischen den Kanälen zuvor korrigiert werden muss. Wenn die Analyse nach kleinen Unterschieden oder subtilen Merkmalen im Modell sucht, wählen Sie während der Vorlagenübereinstimmung die quadratische Bildintensität.

Stellen Sie die minimale Ähnlichkeit zwischen sechzig und achtzig Prozent ein und die Anzahl der Iterationen auf eins. Wählen Sie Modelle und Partikel aus, die während der Berechnung angezeigt werden sollen, und generieren Sie die Vorschau-Modelle. Überprüfen Sie die Vorschau-Modelle.

Erhöhen Sie die minimale Ähnlichkeit, um nur Partikel mit der gewünschten Morphologie einzuschließen. Optimieren Sie bei Bedarf weitere Parameter der Modellberechnung und wählen Sie zusätzliche Elemente während des Modellerzeugungsprozesses aus, die angezeigt werden sollen, falls gewünscht. Sobald die Vorschaumodelle zufriedenstellend sind, erhöhen Sie die Anzahl der Iterationen auf zehn.

Legen Sie den Ordnernamen und die Dateibenennung fest. Klicken Sie auf „OK“, um die Modell-Evolutions-Stapel zu speichern, die alle Iterationen des endgültigen Modells enthalten. Ein rekombinanter Vaccinia-Virus, bei dem zwei Proteine mit grünen und roten fluoreszierenden Proteinen markiert waren, wurde mittels strukturierter Beleuchtungsmikroskopie abgebildet und mit dem VirusMapper-Plug-in modelliert.

Die Samen wurden separat für die frontale und sagittale Ausrichtung generiert, jeweils gemittelt aus fünf repräsentativen Partikeln. Abhängig von der Orientierung des Virus können ein oder zwei laterale Körper unterschieden werden. Daher können separate Modelle für die beiden Ausrichtungen erstellt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Qualität der Modelle weitgehend von der Qualität der gewonnenen Rohdaten abhängt. Obwohl die Einzelteilchenanalyse die Präzision erhöhen kann, kann sie keine schlechte Bildqualität ausgleichen. Nach diesem Verfahren können weitere Quantifizierungen oder Modellanpassungen an diesen Modellen durchgeführt werden.

Dies kann helfen, zusätzliche Fragen insbesondere zu nanoskaligen Veränderungen an der viralen Architektur während einer Infektion zu beantworten. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Software für die Einzelpartikelanalyse VirusMapper verwendet, um Modelle der molekularen Architektur aus Super-Resolution-Bildern zu erstellen.