Name: Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Induktion und Quantifizierung zellulärer Seneszenz in verschiedenen Zelltypen. Diese Techniken ermöglichen die Überwachung von Seneszenzmarkern und liefern Einblicke in biologische Faktoren des Alterns.

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Diese Studie wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Institute on Aging. Die Autoren möchten Myriam Gorospe und Kotb Abdelmohsen für viele hilfreiche Diskussionen über die Seneszenz und Kotb Abdelmohsen für auch kritisch Lesen des Manuskripts. Wir danken auch unser Labor Mitglieder, vor allem Douglas Dluzen für kritisch, das Manuskript zu lesen.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
<li>Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Transforming+Growth+Factor-%CE%B2+Signaling+Delays+Cellular+Senescence+and+Preserves+the+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+induces+senescence+in+hepatocellular+carcinoma+cells+and+inhibits+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth.</a> Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+approach+for+monitoring+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated approach for monitoring cell senescence.</a> Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).</li>
<li>Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+cellular+senescence%3A+implications+for+immortalization+of+normal+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).</li>
<li>Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase--an+indicator+of+the+maturational+stage+of+mouse+and+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes.</a> J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

unter Verwendung von humanen diploiden Fibroblasten Hier haben wir Methoden zur replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz beschrieben. Zusätzlich sind Techniken zum Protein- und mRNA-Mengen verschiedenen Seneszenz-assoziierte Proteine ​​Quantifizieren enthalten sind, sowie Färbung für SA-β-gal und für den DNA-Schädigung Marker γ-H2AX. Diese Protokolle können weit seneszenten Phänotypen verwendet werden , sowohl in vitro zu bewerten und in vivo, obwohl viele Einschränkungen bestehen für die C...

Mehr als vor einem halben Jahrhundert, Hayflick und Kollegen beschrieben , wie nicht - transformierten Zellen in Kultur vermehren, aber nur für einen begrenzten Zeitraum 1. Langzeitkultivierung von humanen Fibroblasten verursacht die Zellen vermehren zu stoppen; jedoch waren sie metabolisch aktiv, und wurde dieser zelluläre Seneszenz bezeichnet. Seneszenz können zur Hemmung der Tumorgenese von Vorteil sein, sie kann aber auch nachteilig sein, wie es angenommen wird , auf den Verlust der Regenerationsfähigkeit beizutragen , die mit dem Altern auftritt , 2, 3. Seneszenten Zellen wurden in Geweben akkumulieren gezeigt , wie Menschen im Alter von 4 und in einer Reihe von biologischen Prozessen, einschließlich der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Gewebereparatur und altersbedingte Entzündung 2 in Verbindung gebracht. Kontinuierliche Passagierung der Zellen in Kultur induziert replikative Seneszenz, die in Verbindung gebracht wurdezu der Telomere Abrieb und genomische Instabilität. Verschiedene Zellspannungen, einschließlich DNA - Schädigung und Onkogenen, können auch Seneszenz 3 verursachen. Seneszenz verursacht durch andere Faktoren als Telomer Abrieb wird oft spannungsinduzierte oder vorzeitige Seneszenz bezeichnet und hängt im Allgemeinen von der p16 INK4A / Rb - Weg 5. Obwohl proliferierenden, typischerweise nicht - transformierten Zellen spindelförmig erscheinen, können seneszenten Zellen mit bestimmten Merkmalen identifiziert werden, einschließlich einer flache, große Morphologie und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase - Aktivität (SA-β-gal) (Abbildungen 1 und 2). Seneszenten Zellen akkumulieren auch DNA - Schädigung Marker, einschließlich γ-H2AX (Abbildung 3) 6, und möglicherweise Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF) (4) 7. Seneszenten Zellen höhere Zellzyklusregulatoren, einschließlich p<html> 16 (p16 INK4A) und / oder p21 und p53 (Figur 5) 8, 9. Darüber hinaus haben jüngste Daten gezeigt , dass seneszenten Zellen nicht autonome Wirkungen durch eine Reihe von pro-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen sezer die Seneszenz-assoziierte sekretorischen Phänotyp (SASP) 10 genannt haben. Obwohl dieses Phänomen SASP von Zelltyp zu Zelltyp, im allgemeinen unterschiedlich sein kann, ist es durch eine Erhöhung der Interleukin-6 (IL-6), IL-8, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) gezeigt, wachstums- regulierter Onkogen α (GRO-α) und GRO-β, unter anderem (Abbildung 6). Die besondere Beanspruchung oder Schäden , die Seneszenz induziert können auch Einfluss auf die sekretorischen Phänotyp 11, 12, 13. SASP kann durch Messung der Mengen an sezernierten Proteinen unter Verwendung von ELISAs oder Zytokin / Protein-Arrays detektiert werdens = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Obwohl posttranskriptionale Mechanismen können SASP Proteinspiegel 11 regulieren, 15, 16, 17, Veränderungen in der mRNA - Spiegel können auch in vielen Fällen nachgewiesen werden. Diese Änderungen sind in der Regel empfindlicher und leichter zu quantifizieren als Proteinebene Messungen. Andere seneszenten Marker können auch beurteilt werden, einschließlich DNA - Schädigung persistent Kern Foci, genannt DNA - Segmente mit Chromatin Veränderungen Verstärkungs Seneszenz (DNA-SCARS) 18, und verschiedene andere Marker 3, 19, 20. Hier beschreiben wir gemeinsame Techniken für die Seneszenz in Zellen in Kultur zu induzieren und auch für mehrere Marker die Seneszenz zu messen, einschließlich SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, und das Protein und mRNA von alternNOA-assoziierte Moleküle.

<table><tbody><tr><td>16% Tris-Glycin-Gele</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Säure-Phenol ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td> 1<td>:300 Verdünnung</td></tr><tr><td>Zellheber</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>Zellschaber</td></tr><tr><td>ECL Anti-Maus HRP gebundener Antikörper</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting Substrat</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molekulare Sonden</td><td>MP01306</td><td>Lager 5 mg/ml in dH2O</td></tr><tr><td>GAPDH Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1.000 - 5.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Histon H3-Dimethyl K9 monoklonaler Antikörper</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>Humaner IL-6 Quantikine ELISA Assay</td><td>R& D systems</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 Quantikine ELISA-Assay für den Menschen</td><td>F& T D systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>Human GROa Quantikine ELISA Assay</td><td>R& D-Systeme</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-Dimethylformamid</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 monoklonaler Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 Verdünnung</td></tr><tr><td>p21 monoklonaler Antikörper</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 Verdünnung</td></tr><tr><td>p53 monoklonaler Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 Verdünnungsklon DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC-Konjugat-Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9719</td><td>1:2.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>POWER SYBR-grüner PCR-Mastermix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Vorgefärbte Molekulargewichtsmarker</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Seneszenz &beta;-Galactosidase-Färbekit</td> für <td>die Zellsignalisierung</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

techniken zur induktion und quantify zelluläre seneszenz

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In Reaktion auf zellulärem Stress oder Schädigung, proliferierenden Zellen kann ein spezifisches Programm induzieren, die einen Zustand der Langzeit-Zellzyklusarrest einleitet, zelluläre Seneszenz bezeichnet. Akkumulation von seneszenten Zellen erfolgt mit organismal Altern und durch kontinuierliche Kultivierung in vitro. Seneszenten Zellen beeinflussen zahlreiche biologische Prozesse, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Gewebereparatur und -regeneration, Tumorunterdrückung und Alterung. Kennzeichnend für seneszenten Zellen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal); p16 INK4A, p53, p21 und Ebene; höhere Niveaus von DNA-Schäden, einschließlich γ-H2AX; die Bildung der Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF); und der Erwerb eines Seneszenz-assoziierte Sekretorische Phenotype (PUSA), ein Phänomen, das durch die Sekretion einer Anzahl von pro-inflammatorischen Cytokinen und Signalmolekülen charakterisiert. Hier beschreiben wir Protokolle sowohl für replikativen undDNA Seneszenz in kultivierten Zellen-Schädigung induziert. Außerdem markieren Techniken, die wir den seneszenten Phänotyp mit mehreren Seneszenz-assoziierte Marker, einschließlich SA-β-gal, γ-H2AX und SAHF Färbung und zu quantifizieren Protein und mRNA-Spiegel von Zellzyklusregulatoren und SASP Faktoren zu überwachen. Diese Methoden können zur Beurteilung der Seneszenz in verschiedenen Modellen und Geweben angewandt werden.

Die Figuren 2 - 6 repräsentative Ergebnisse von SA-β-gal - Färbung zeigen; Anfärben für γ-H2AX und SAHF; Beurteilung der Proteinspiegel von p16 INK4A, p21 und p53; und mRNA und Protein-Ebene von seneszenten-assoziierte Moleküle. Erhöhter SA-β-gal-Färbung erfolgt mit replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz. Auch beachten Sie die morphologischen Veränderungen, die mit Seneszenz auftreten. Die Zellen werden vergrößert und flach im Vergleich zu den Sp...

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Das übergeordnete Ziel dieser Techniken ist es, einen Werkzeugkasten zur Verfügung zu stellen, der die Induktion, Überwachung und Quantifizierung der zellulären Seneszenz ermöglicht. Diese Methoden können dazu beitragen, wichtige Fragen zur Identifizierung und Quantifizierung der zellulären Seneszenz und der biologischen Faktoren, die das Altern von Zellen und Organismen regulieren, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie eine Vielzahl von Methoden zur Überwachung der zellulären Seneszenz in verschiedenen Modellen, Geweben und Zelltypen umfassen.Beginnen Sie damit, die proliferativen Zellen der frühen Passage von Interesse mit geringer Dichte in der geeigneten Schale für die Analyse zu plattieren. Und kultivieren Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator. Wenn die Zellen zu 50-60% konfluent sind, aspirieren Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.Nach der zweiten Wäsche bedecken Sie die Zellen mit einer dünnen Schicht PBS. Und setzen Sie die Zellen einer einzigen Dosis Gammabestrahlung der Stufe 10 aus. Ersetzen Sie das PBS durch Wachstumsmedium.Und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück. Wechsel des Mediums alle 48 bis 72 Stunden mit täglicher Überwachung auf morphologische Veränderungen unter einem Lichtmikroskop. Sieben bis 10 Tage nach der Bestrahlung tauen Sie alle Reagenzien aus einem kommerziellen Beta-Galactosidase-Assay-Kit in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.Wenn alle Reagenzien Raumtemperatur erreicht haben, bereiten Sie die Fixier- und Färbelösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Und waschen Sie jede Probe vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur. Achten Sie darauf, die Zellen sorgfältig zu spülen, da Seneszenzzellen nicht gut haften und beim Waschen leicht entfernt werden können.Fixieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einem Milliliter Fixierlösung pro Vertiefung für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von zwei Zwei-Milliliter-Wäschen mit PBS pro Vertiefung. Geben Sie anschließend einen Milliliter Beta-Galactosidase-Färbelösung in jede Vertiefung und decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um eine 24- bis 48-stündige Kultur in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator ohne Kohlendioxid zu erhalten.Überprüfen Sie die Zellen nach 24 Stunden. Wenn die Zellen ausreichend gefärbt sind, ersetzen Sie die Beta-Gal-Lösung durch frisches PBS und untersuchen Sie die Kulturen an einem Lichtmikroskop mit einer angebrachten Kamera bei einem 10-fachen oder höheren Objektiv. Die Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-Zellen erscheinen blau.Ermitteln Sie dann mindestens fünf nicht überlappende Bilder pro Well. Und zählen Sie manuell die Gesamtzahl der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-positiven Zellen und die Gesamtzahl der Zellen pro Bild, um den Prozentsatz der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-Zellen pro Vertiefung zu berechnen. Waschen Sie die Zellen 10 Tage nach der Gammabestrahlung dreimal mit PBS.Ersetzen Sie das PBS nach der letzten Wäsche durch 2,5 Milliliter serumfreies Medium, ergänzt mit Antibiotika pro Sechs-Zentimeter-Schale und stellen Sie die Zellen über Nacht wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein. Am nächsten Morgen füllen Sie das Medium in ein konisches Röhrchen auf Eis. Und waschen Sie die Zellen zweimal mit frischem PBS.Dann trypsinisieren und zählen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie anschließend den Überstand, der von der Zellkulturplatte geerntet wurde. Und dann filtrieren Sie es durch ein 0,45-Mikrometer-Spritzensieb und frieren das Medium in 500-Mikroliter-Aliquoten bei 80 Grad Celsius ein, bis es mit dem ELISA analysiert wird.Eine erhöhte Seneszenz-assoziierte Beta-Gal-Färbung tritt mit replikativer und DNA-Schadens-induzierter Seneszenz auf. Man beachte die vergrößerte flache Form der seneszenten Zellen im Vergleich zum spindelartigen Aussehen der proliferierenden Fibroblasten. In diesem Experiment wurden proliferierende junge oder replikative seneszente Zellen fixiert, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.Und gefärbt mit einem Antikörper gegen einen Biomarker für DNA-Doppelstrangbrüche und DAPI. Mit einer offensichtlichen Zunahme der Anzahl der DNA-Doppelstrangbruchfosi, die in den seneszenten Zellen beobachtet wurden. Die RT-qPCR-Analyse von Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotypfaktoren zeigt, dass zumindest einige Faktoren nach Gammastrahlen-induzierter Seneszenz in humanen diploiden Fibroblasten mit geringer Passage auf MRNA-Ebene hochreguliert sind.Dies wird auch durch den ELISA der gammabestrahlten Zellkulturüberstände bestätigt. Sobald die Beherrschung der Beherrschung ist, können die Induktion von DNA-Schäden und die Färbung von SA-Beta-Gal in etwa 30 Minuten Hands-on-Zeit abgeschlossen werden. Das Bedingungsmedium zur Quantifizierung des SASP-Proteingehalts kann in etwa 30 Minuten hergestellt werden.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sie bei morphologischen Veränderungen in den Zellkulturen zu überwachen, bevor Sie mit der Quantifizierung der seneszenten Marker fortfahren. Nach ihrer Entwicklung ebneten diese Techniken den Weg für Forscher in den Bereichen Altern und Krebs, um die Seneszenz in einer Vielzahl von Geweben, Zellkulturen und Modellorganismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre Seneszenz induziert, überwacht und quantifiziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Hier diskutieren wir eine Reihe von Protokollen für die Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in kultivierten Zellen. Wir konzentrieren uns auf unterschiedlichen Seneszenz-induzierende Stimuli und beschreiben die Quantifizierung der gemeinsamen Seneszenz-assoziierten Marker. Wir bieten technische Details mit Fibroblasten als Modell, aber die Protokolle können verschiedene zelluläre Modelle angepasst werden.

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.

Messung von Proteinumsatzraten in seneszenten und nicht teilenden kultivierten Zellen mit metabolischer Markierung und Massenspektrometrie

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Multiplexierte Immunfluoreszenz ermöglicht die sequentielle Markierung mehrerer Antikörpermarker innerhalb eines einzelnen Gewebeschnitts, um die räumliche Analyse der Gewebearchitektur und Zellpopulationen zu unterstützen. Hier wird ein Arbeitsablauf zur Multiplexerkennung von seneszenzassoziierten, strukturellen und immunen Markern präsentiert, einschließlich manueller und automatisierter Objektträgervorbereitung, iterativer Bildgebung und Einzelzellanalyse mit digitaler Pathologiesoftware.

Multiplexierter Immunfluoreszenz-Assay zur räumlichen Bewertung von Altersmarkern in vivo

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Diese Methode untersucht, wie seneszente Hautfibroblasten gesunde Fibroblasten beeinflussen. Die Seneszenz wird durch UVB-Exposition induziert, und das konditionierte Medium wird auf normale Fibroblasten angewendet. Sie hilft dabei, bioaktive Verbindungen zu bewerten, die auf veränderte Zell-zu-Zell-Kommunikation bei der Hautalterung abzielen.

Neue Kombination von Antioxidantien zur Wiederherstellung gesunder interzellulärer Kommunikation in einem in-vitro-Modell unter Verwendung eines konditionierten Mediums aus alter Zellen

Lernen Sie Methoden zur Induktion und Quantifizierung zellulärer Seneszenz in verschiedenen Zelltypen. Diese Techniken ermöglichen die Überwachung von Seneszenzmarkern und liefern Einblicke in biologische Faktoren des Alterns.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

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