Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Das übergeordnete Ziel dieser Techniken ist es, einen Werkzeugkasten zur Verfügung zu stellen, der die Induktion, Überwachung und Quantifizierung der zellulären Seneszenz ermöglicht. Diese Methoden können dazu beitragen, wichtige Fragen zur Identifizierung und Quantifizierung der zellulären Seneszenz und der biologischen Faktoren, die das Altern von Zellen und Organismen regulieren, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie eine Vielzahl von Methoden zur Überwachung der zellulären Seneszenz in verschiedenen Modellen, Geweben und Zelltypen umfassen.

Beginnen Sie damit, die proliferativen Zellen der frühen Passage von Interesse mit geringer Dichte in der geeigneten Schale für die Analyse zu plattieren. Und kultivieren Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator. Wenn die Zellen zu 50-60% konfluent sind, aspirieren Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS.

Nach der zweiten Wäsche bedecken Sie die Zellen mit einer dünnen Schicht PBS. Und setzen Sie die Zellen einer einzigen Dosis Gammabestrahlung der Stufe 10 aus. Ersetzen Sie das PBS durch Wachstumsmedium.

Und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator zurück. Wechsel des Mediums alle 48 bis 72 Stunden mit täglicher Überwachung auf morphologische Veränderungen unter einem Lichtmikroskop. Sieben bis 10 Tage nach der Bestrahlung tauen Sie alle Reagenzien aus einem kommerziellen Beta-Galactosidase-Assay-Kit in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf.

Wenn alle Reagenzien Raumtemperatur erreicht haben, bereiten Sie die Fixier- und Färbelösungen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Und waschen Sie jede Probe vorsichtig mit PBS bei Raumtemperatur. Achten Sie darauf, die Zellen sorgfältig zu spülen, da Seneszenzzellen nicht gut haften und beim Waschen leicht entfernt werden können.

Fixieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit einem Milliliter Fixierlösung pro Vertiefung für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von zwei Zwei-Milliliter-Wäschen mit PBS pro Vertiefung. Geben Sie anschließend einen Milliliter Beta-Galactosidase-Färbelösung in jede Vertiefung und decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um eine 24- bis 48-stündige Kultur in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator ohne Kohlendioxid zu erhalten.

Überprüfen Sie die Zellen nach 24 Stunden. Wenn die Zellen ausreichend gefärbt sind, ersetzen Sie die Beta-Gal-Lösung durch frisches PBS und untersuchen Sie die Kulturen an einem Lichtmikroskop mit einer angebrachten Kamera bei einem 10-fachen oder höheren Objektiv. Die Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-Zellen erscheinen blau.

Ermitteln Sie dann mindestens fünf nicht überlappende Bilder pro Well. Und zählen Sie manuell die Gesamtzahl der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-positiven Zellen und die Gesamtzahl der Zellen pro Bild, um den Prozentsatz der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase-Zellen pro Vertiefung zu berechnen. Waschen Sie die Zellen 10 Tage nach der Gammabestrahlung dreimal mit PBS.

Ersetzen Sie das PBS nach der letzten Wäsche durch 2,5 Milliliter serumfreies Medium, ergänzt mit Antibiotika pro Sechs-Zentimeter-Schale und stellen Sie die Zellen über Nacht wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein. Am nächsten Morgen füllen Sie das Medium in ein konisches Röhrchen auf Eis. Und waschen Sie die Zellen zweimal mit frischem PBS.

Dann trypsinisieren und zählen Sie die Zellen. Zentrifugieren Sie anschließend den Überstand, der von der Zellkulturplatte geerntet wurde. Und dann filtrieren Sie es durch ein 0,45-Mikrometer-Spritzensieb und frieren das Medium in 500-Mikroliter-Aliquoten bei 80 Grad Celsius ein, bis es mit dem ELISA analysiert wird.

Eine erhöhte Seneszenz-assoziierte Beta-Gal-Färbung tritt mit replikativer und DNA-Schadens-induzierter Seneszenz auf. Man beachte die vergrößerte flache Form der seneszenten Zellen im Vergleich zum spindelartigen Aussehen der proliferierenden Fibroblasten. In diesem Experiment wurden proliferierende junge oder replikative seneszente Zellen fixiert, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben.

Und gefärbt mit einem Antikörper gegen einen Biomarker für DNA-Doppelstrangbrüche und DAPI. Mit einer offensichtlichen Zunahme der Anzahl der DNA-Doppelstrangbruchfosi, die in den seneszenten Zellen beobachtet wurden. Die RT-qPCR-Analyse von Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotypfaktoren zeigt, dass zumindest einige Faktoren nach Gammastrahlen-induzierter Seneszenz in humanen diploiden Fibroblasten mit geringer Passage auf MRNA-Ebene hochreguliert sind.

Dies wird auch durch den ELISA der gammabestrahlten Zellkulturüberstände bestätigt. Sobald die Beherrschung der Beherrschung ist, können die Induktion von DNA-Schäden und die Färbung von SA-Beta-Gal in etwa 30 Minuten Hands-on-Zeit abgeschlossen werden. Das Bedingungsmedium zur Quantifizierung des SASP-Proteingehalts kann in etwa 30 Minuten hergestellt werden.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sie bei morphologischen Veränderungen in den Zellkulturen zu überwachen, bevor Sie mit der Quantifizierung der seneszenten Marker fortfahren. Nach ihrer Entwicklung ebneten diese Techniken den Weg für Forscher in den Bereichen Altern und Krebs, um die Seneszenz in einer Vielzahl von Geweben, Zellkulturen und Modellorganismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man zelluläre Seneszenz induziert, überwacht und quantifiziert.