Isolierung von Zwischenfilamentproteinen aus mehreren Mausgeweben zur Untersuchung von altern-assoziierten posttranslationalen Modifikationen

Das übergeordnete Ziel dieses biochemischen Verfahrens ist es, mit intermediären Filamenten angereicherte Fraktionen aus mehreren Mausgeweben zu isolieren, um posttranslationale Modifikationen der verschiedenen gewebespezifischen intermediären Filamentproteine zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zwischenfilamente zu beantworten, z. B. wie die Funktion und Regulation dieser wichtigen stressschützenden Zytoskelettproteine während der Säugetieralterung beeinflusst wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der Benutzer durch die Integration eines automatisierten Gewebelyseschritts mehrere Gewebeproben schnell und effizient verarbeiten kann.

Geben Sie zunächst einen Milliliter eiskalten Triton X-100 Puffer, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt ist, in einen Glasröhrchen-Homogenisator und legen Sie ihn auf Eis. Nehmen Sie ein kleines Stück Gewebe aus dem Flüssigstickstofflager und legen Sie es direkt in den Glashomogenisator. Halten Sie dann den Homogenisator und die Probe immer auf Eis und verwenden Sie etwa 50 Hübe einer Polytetrafluorethylen-Pastille, um die Probe zu homogenisieren und gleichzeitig die Blasenbildung zu minimieren.

Übertragen Sie das Lysat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis und zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 20.000 Mal G in vier Grad Celsius. Sammeln Sie anschließend die lösliche Überstandsfraktion von Triton X in einem separaten Röhrchen. Diese Fraktion kann für die Immunfällung und die Analyse des detergenslöslichen Pools von IF-Proteinen verwendet werden.

Fügen Sie dann dem Gewebepellet einen Milliliter Puffer mit hohem Salzgehalt hinzu, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt ist. Übertragen Sie es in einen sauberen Homogenisator und machen Sie 100 Hübe. Übertragen Sie das Homogenat zurück in das Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie das Röhrchen für eine Stunde auf einen rotierenden Schüttler im Kühlraum.

Die Homogenate werden bei 20.000 mal G bei vier Grad Celsius 20 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Geben Sie einen Milliliter eiskalten PBS EDTA-Puffer zum Pellet und geben Sie es als letzten Reinigungsschritt in einen sauberen Homogenisator. Nach der Homogenisierung wird die Probe in ein neues Röhrchen umgefüllt und 10 Minuten lang bei 20.000 G in vier Grad Celsius zentrifugiert, um den IF-Protein-reichen High-Salt-Extrakt (HSC) zu erhalten.

Den Überstand verwerfen und das Pellet in 300 Mikrolitern vorgewärmtem, nicht reduzierendem SDS-Probenpuffer auflösen. Brechen Sie das Pellet zunächst durch Pipettieren und Vortexen auf. Und dann erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Vortexen und pipettieren Sie nach Bedarf, um sicherzustellen, dass das Pellet vollständig aufgelöst ist, was einige Minuten dauern kann. Lagern Sie alle Proben bis zur Analyse bei minus 20 Grad Celsius. Um die RNA-Extraktion durchzuführen, geben Sie den Lysepuffer in ein Röhrchen mit der Lysinmatrix D, geben Sie dann das Probengewebe in den Gewebelyser und pulsieren Sie zweimal für jeweils 25 Sekunden.

Trennen Sie das Lysat von der Matrix durch Zentrifugation bei 20.000 G. Für die Proteinextraktion fügen Sie Triton X-100 oder SDS-Probenpuffer hinzu, wenn Sie das Gesamtlysat vorbereiten. In ein Lysinröhrchen mit Lysinmatrix SS. Fügen Sie dann das Probengewebe hinzu. Pulsieren Sie die Probe kurz, um sie zu mischen.

Um HSC vorzubereiten, verwenden Sie einen Magneten, um die Edelstahlperle aus dem Röhrchen zu entfernen, und zentrifugieren Sie die Röhrchen 10 Minuten lang bei 20.000 mal G in vier Grad Celsius. Trennen Sie den Überstand und die Pelletfraktion und gehen Sie wie weiter oben im Video gezeigt vor. Bereiten Sie den PBST-Puffer vor, indem Sie 10 Mikroliter T20 bis 50 Milliliter PBS pH 7,4 hinzufügen.

Bereiten Sie dann die PTM-Antikörperlösung vor, indem Sie ein bis 10 Mikrogramm Antikörper zu 200 Mikrolitern PBST hinzufügen. Aliquotieren Sie 50 Mikroliter magnetischer Kügelchen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Setze sie auf den Magneten und sauge die Bead-Aufbewahrungslösung an.

Konjugieren Sie die Kügelchen mit dem Immunpräzipitationsantikörper, indem Sie die Kügelchen in der Antikörperlösung resuspendieren und die Probe auf einem Rotator bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubieren. Legen Sie die Röhrchen auf den Magneten und aspirieren Sie die Antikörperlösung. Verwenden Sie dann 200 Mikroliter PBST, um die konjugierten Antikörperkügelchen einmal zu spülen und die Lösung zu entfernen.

Geben Sie 0,6 bis einen Milliliter des Gewebelysats zu den Kügelchen. Mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren und inkubieren Sie die Lösung drei Stunden lang auf einem Rotator in einem kalten Raum. Legen Sie die Röhrchen auf den Magneten und entfernen Sie das Lysat, dann verwenden Sie 200 Mikroliter PBST, um die Kügelchen fünfmal zu waschen.

Nach dem letzten Waschschritt sammeln Sie die Kügelchen und 100 Mikroliter PBS und geben die Kügelchen in eine neue, saubere Tube. Setzen Sie das Rohr auf den Magneten und saugen Sie dann das PBS an. Nehmen Sie das Röhrchen vom Magneten und fügen Sie 100 Mikroliter nicht reduzierenden Probenpuffer hinzu.

Aliquotieren Sie 50 Mikroliter aus dem Röhrchen und kombinieren Sie es mit 5%2ME, um Reduktionsproben herzustellen. Erhitzen Sie die Proben fünf Minuten lang auf 95 Grad Celsius. Sammeln Sie mit dem Röhrchen auf dem Magneten die IP-Fraktion von den Kügelchen und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen.

Lagern Sie die Proben bis zur Analyse bei minus 20 Grad Celsius. Um eine Kontamination von Proteinproben für die massenspektrometrische Analyse zu vermeiden, verwenden Sie saubere Handschuhe, um alle Gele zu handhaben und sie in sauberen Behältern zu inkubieren, die nur mit DD H2O gewaschen wurden. Führen Sie 20 bis 50 Mikroliter der HSE-Probe auf einem SDS-Seitengel gemäß den Standardbedingungen durch.

Nachdem Sie das Gel gemäß dem Textprotokoll gefärbt haben, legen Sie das Gel zwischen Plastikfolienschutzfolien. Scannen und markieren Sie dann die Bänder, die herausgeschnitten werden sollen. Verwenden Sie einen neuen, sauberen Rasierer, um die IF-Proteinbanden zu entfernen, und legen Sie die Banden in saubere Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, bevor Sie sie zur Massenspektrometrie-Analyse einreichen.

Diese Abbildung zeigt ein typisches Ergebnis von HSEs aus neun Mausgeweben, die mit der Rapid-Methode isoliert wurden. Beachten Sie, dass diese Methode bei Bauchspeicheldrüse und Milz nicht gut funktioniert und in einer Dickdarmprobe zusätzliche Banden liefert. Diese Genexpressionsanalyse zeigt, dass das Keratin 8 während des Alterns hochreguliert wird.

Darüber hinaus zeigen Western Blots, dass Keratin 8 in der Leber alter Mäuse stark hochreguliert ist. Hier zeigt eine Leber-HSE, die mit dem automatisierten Protokoll gewonnen wurde, die starke Anreicherung der Keratine 8 und 18 auf dem Gel. Massenspektrometrische Analysen zeigen, dass K8 und K18 in der Leber einer alten Maus mehrere Phosphorylierungs- und Acetylierungsstellen aufweisen, die in der Leber der jungen Maus nicht vorhanden sind.

Ähnlich wie bei Keratinveränderungen in der Leber zeigt die Analyse des Hirngewebes mittels QPCR eine fünffache Induktion von GFAP-mRNA im Gehirn von 24 Monate alten Mäusen im Vergleich zu drei Monate alten Mäusen. Schließlich zeigt die Proteinanalyse der salzreichen Extrakte durch Coomassie-Färbung und Immun-Blots von Gesamt- und Acetyllysin-angereicherten Fraktionen, dass das GFAP-Protein im gealterten Mäusegehirn hochreguliert und acetyliert ist. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie z.B. der massenspektrometrische Proteo-Mix, verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. was die wichtigen posttranslationalen Modifikationen und Bindungspartner von intermediären Filamentproteinen unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intermediäre Filamentproteine aus verschiedenen Säugetiergeweben isoliert