Name: Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Erfahren Sie die optische Quantifizierung des intrazellulären pH in Drosophila-Malpighi-Röhrchen mit dem genetisch codierten Indikator pHerry. Diese Methode ermöglicht die Analyse basolateralen Protonentransports in intakten Epithelzellen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH DK092408 und DK100227, Herst AJR wurde von T32-DK007013 unterstützt. Möchten die Autoren danken Dr. Julian A.T. Dow für die CapaR-GAL4 und c724-GAL4 Drosophila Bestände. Wir danken auch Jacob B. Anderson für die Unterstützung, die Aufrechterhaltung der experimenteller fliegen Kreuzungen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Erfolg der Quantifizierung der pH-Wertich in Drosophila MTs hängt ganz von der Gesundheit der extrahierten MTs und die Qualität der Montage und Zerlegung (Abbildung A – C). So ist der sorgsame Umgang mit Gewebe wie beschrieben zwingend. Folien, die frisch in PLL beschichtet Folien wesentlich Hilfe MT Montage, wie sie neigen dazu, viel mehr Kleber als die zuvor ausgesetzt waren auf Lösung. Sorgfältige Montage hilft auch bei der Identifizierung de...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Quantifizierung von intrazellulären pH (pHi) mit einer genetisch codierte pH-Indikator (GEpHI) zu beschreiben und zeigen, wie diese Methode zur basolateralen H+ Transport in einem Modell Insekt (D. Beurteilung herangezogen werden können Melanogaster) renal Struktur, Malpighian Röhrchen (MT). MTs dienen als die Ausscheidungsorgane der Fruchtfliege und sind funktionell ähnlich der Säugetier-Nephron in einigen wesentlichen Punkten1. MTs sind als 2 Paare der Tubuli (Front- und Seitenzahnbereich) in den Thorax und Abdomen der Fliege angeordnet. Die einzelligen epitheliale Röhre von jeder MT besteht aus metabolisch aktiven wichtigsten Zellen mit deutlichen apikalen (luminalen) sowie basolateralen (Salzhaushalts) Polarität und eingefügten Ganglion Zellen. Vorderen MTs bestehen aus 3 morphologisch, funktionell und entwicklungsgeschichtlich verschiedene Segmente, vor allem die anfängliche geweitet, Segment, Übergangs-Segment und sekretorischen Hauptsegment, verbindet die Harnleiter-2. Auf der zellulären Ebene Trans-epithelialen Ionentransport in das Lumen wird erreicht, indem eine apikale Plasmamembran V-ATPase3 sowie eine Alkali-Metall/H+ -Wärmetauscher und einen basolateralen Na+-K+-ATPase4, nach innen-Gleichrichter-K+ Kanäle5, Na+-getrieben Cl−/HCO3− Wärmetauscher (NDAE1)6und Na+-K+-2 Cl− Cotransporter (NKCC; Ncc69)7, während Ganglion Zellen Cl– vermitteln und Wassertransport8,9. Dieses komplexe, aber zugänglich physiologische System bietet hervorragende Möglichkeiten zur Untersuchung der endogenen Ion Transportmechanismen in Kombination mit den vielfältigen genetischen und Verhaltensstörungen Toolsets von Drosophila.
Die Gründe für dieses Protokoll war ein genetisch formbar System für das Studium der epithelialen Ionentransport mit Potenzial für die Integration von Zelle zu Verhalten und Export von Werkzeugen zu Fremdsystemen Modell zu beschreiben. Ausdruck von pHerry10, erlaubt ein GEpHI abgeleitet aus einer Fusion von grünen pH-Sensitive Super-Ekliptik pHluorin11,12 (SEpH) und rote pH-unempfindliche mCherry13, in MTs Quantifizierung der H+ Transport in MT-Einzelzellen durch die hohe K+/nigericin Kalibrierung Technik14. Wie viele Ionen-Transporter H+ äquivalente bewegen, dient Quantifizierung der intrazellulären pHich als eine funktionelle Darstellung der Ionenbewegung über eine Vielzahl von Transportern. Die Drosophila MT-Modell-System bietet auch genetische Werkzeuge in gewebespezifischen Transgene15 und RNA-Interferenz (RNAi)16 Ausdruck, die zelluläre Bildgebung mit ganz-Orgel-Assays17 kombiniert werden können , 18 , 19 der Röhrchen-Funktion, erstellen Sie eine robusteste Toolset mit vertikalen Integration von Molekülen zu Verhalten. Dies steht im Gegensatz zu vielen anderen Protokollen zur Beurteilung epithelialen Biologie, wie historisch solche Messungen auf komplizierte verlassen haben und erschreckend, Mikro-Dissektion, anspruchsvolle ionenselektive Elektroden20,21, und teure pH-sensitiven Farbstoffen22 mit restriktiven laden Anforderungen und schlechte zelluläre Spezifität in heterogenen Geweben. GEpHIs wurden verwendet, um ausgiebig pHich in einer Vielzahl der Zelle Arten23messen. Frühwerk ausgenutzt die inhärente pH-Empfindlichkeit von Green Fluorescent Protein (GFP) pH-Wertich in kultivierten Epithelzellen24 überwachen, aber zwei Jahrzehnte habe GEpHIs verwendet in Neuronen25, Glia26, Pilze27 , und Pflanzenzellen28. Die Kombination des Potenzials für zelluläre targeting der genetischen Konstrukte durch die GAL4/UAS Ausdruck System15 und die physiologische Zugänglichkeit der Drosophila MT machen dies eine ideale Vorbereitung für Untersuchungen von pHich Regulierung und epithelialen Ionentransport.
pH-Wertesich wurde seit Jahrzehnten untersucht und ist lebenswichtig. Die MT-Vorbereitung bietet ein stabiles Modell zur Physiologie des pH-Wertesich Lehren aber auch anspruchsvolle Untersuchungen von pHi Verordnung ex-Vivo - und in Vivo. Dieses Protokoll beschreibt Quantifizierung der H+ -Bewegung in der basolateralen Membran der Epithelzellen der Drosophila MT mit NH4Cl Puls Säure laden Technik21, aber als pH-Indikator ist genetisch codiert, können diese Methoden und ihre theoretischen Rahmen zur Vorbereitung zu Transgenese und live-Imaging angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin (PLL) Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C, kann wiederverwendet werden.</td></tr><tr><td>Nigericin Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>ACHTUNG: Mit Handschuhen anfassen. Als Aliquote von 20 mM Stammlösung in DMSO bei 4 μC lagern.</td></tr><tr><td>Selbstklebende Perfusionskammerabdeckungen, Klebegröße 1 mm, Kammerdurchmesser und -dicke 9 mm und 0,9 mm, Anschlussdurchmesser 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>Kann je nach Bedarf ausgetauscht werden, um dem Perfusionssystem gerecht zu werden.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Helping Hands Lötständer</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>60501</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Offenes Schwerkraft-Perfusionssystem mit Ventilsteuerung, 8-zu-1-Verteiler und Reserviors</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>Jedes vergleichbare Perfusionssystem kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Durchflussregler</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Kann bei Bedarf ausgetauscht werden, um es an das Perfusionssystem anzupassen.</td></tr><tr><td>Schneider's Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td>Store bei 4 &deg; C in sterilen Aliquoten.</td></tr><tr><td>#5 Inox-Stahl-Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Kann je nach Komfort des Experimentators ersetzt werden.</td></tr><tr><td>35 x 10 mm Polystyrol Petrischale</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>Genaue Marke und Größe sind unwichtig.</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Objektträger</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>Die genaue Marke und Größe können variieren, solange die Perfusionsvertiefungen kompatibel sind.</td></tr><tr><td>Filimentiertes Borosilikat-Kapillarglas, ID 1,5 mm, AD 0,86 mm, Dicke 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Filiment nicht erforderlich, Glas kann ersetzt werden, um Perfusionsschläuchen und Perfusionsvertiefungen zu entsprechen.</td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch, ID 1/16", OD 1/8", Dicke 1/32"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern, kann ersetzt werden, um dem Perfusionssystem zu entsprechen.</td></tr><tr><td>Vakuum-Silikonfett</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Kunststoff-Durchflussmessklemme</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Von mehreren Anbietern erhältlich, Sterilität nicht erforderlich</td></tr><tr><td>Glasstäbe, 5 mm Durchmesser</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>Genaue Größe ist persönliche Vorliebe, mehrere Hersteller verfügbar</td></tr><tr><td>PAP Hydrophober Stift</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Von mehreren Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>Siegelfolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Erhältlich bei mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>MES; 4-Morpholineethansulfonsäure-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Hähne; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropansulfonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Erhältlich bei mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>10X/0,45 Air Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Vergleichbare Objektive können ersetzt werden. 40X Objektive können für die Einzelzellbildgebung verwendet werden.</td></tr><tr><td>Präparierstereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td> Es <td>kann jedes Präparierstereoskop verwendet werden.</td></tr><tr><td>UAS-pHerry transgene Drosophila melagnogaster</td><td>Verfügbar bei Romero Lab</td><td></td><td>Erstveröffentlichung: Citation 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Erhältlich bei Romero Lab</td><td></td><td>Erstveröffentlichung: Citation 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Erhältlich bei Romero Lab</td><td></td><td>Erstveröffentlichung: Zitat 2</td></tr><tr><td>monochromatische Digitalkamera mit hoher Empfindlichkeit</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>Genaue Marke und Modell können variieren, kann durch jede monochromatische hochempfindliche Kamera ersetzt werden, die für die zelluläre Live-Bildgebung geeignet ist.</td></tr><tr><td>GFP/FITC-Filterset, 470/40 nm ex., 515 nm Longpass em., 500 nm dichroitisches</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>Jedes GFP/FITC-Filterset kann ersetzt werden.</td></tr><tr><td>RFP/TRITC-Filtersatz, 546/10 nm ex., 590 nm Langpass em., 565 nm dichroitisches</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>Jedes GFP/FITC-Filterset kann ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Inverses Epifluoszierendes Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Es kann jedes vergleichbare Mikroskop mit motorischer Filterschaltung verwendet werden. Aufrechte Mikroskope können mit offenen Perfusionsbädern und Wasserimmersionsobjektiven verwendet werden.</td></tr><tr><td>Statistische Analysesoftware</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Jede Software mit vergleichbarer Funktionalität kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Jede Software mit vergleichbarer Funktionalität kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Jede Software mit vergleichbarer Funktionalität kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklinge aus Kohlenstoffstahl</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71960</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Objektträgermappe für Mikroskopie</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Von mehreren Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>Polystrene Drosophila Aufzuchtfläschchen mit Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Vergleichbare Artikel können ersetzt werden.</td></tr><tr><td>2,5 L Labor-Eiskübel</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>Erhältlich bei mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>NMDG; N-Methyl-D-glukamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>200 μl Barriere-Pipettenspitzen</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>200 &#956; L Pipette mit variablem Volumen</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr></tbody></table>

optische quantifizierung der intrazellulären ph in drosophila melanogaster malpighian röhrchen epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte ph indikator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epitheliale Ionentransport unbedingt systemische Ion Homöostase sowie Wartung von wesentliche zelluläre elektrochemischen Gradienten. Intrazelluläre pH-Wert (pHich) wird von vielen Ionen-Transporter beeinflusst und somit pHich Überwachung ist ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung der Transporter Aktivität. Moderne genetisch codierte pH-Indikatoren (GEpHIs) bieten optische Quantifizierung der pH-Wertich in intakten Zellen auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dieses Protokoll beschreibt in Echtzeit Quantifizierung der zellulärenich pH-Wertes in Malpighian Tubuli (MTs) von Drosophila Melanogaster durch ex-Vivo Leben-Bildgebung von pHerry, ein Pseudo-ratiometrischen GEpHI mit einem p-Kein gut geeignet zum Nachverfolgen von Änderungen der pH-Wert in der Zellflüssigkeit. Extrahierten Erwachsenen Fliege MTs bestehen aus morphologisch und funktionell unterschiedliche Abschnitte der einzellige Schicht Epithelien und dient als Modell für die Untersuchung von epithelialen Transport zugänglich und genetisch gefügig. GEpHIs bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen pH-Sensitive fluoreszierende Farbstoffe und ionenselektive Elektroden. GEpHIs können unterschiedliche Zellpopulationen beschriften, sofern entsprechende Promotor Elemente verfügbar sind. Diese Kennzeichnung ist besonders nützlich in ex Vivo, in Vivound in Situ Präparate, die von Natur aus heterogen sind. GEpHIs erlauben auch die Quantifizierung der pHi im intakten Gewebe im Laufe der Zeit ohne Notwendigkeit einer Behandlung oder Gewebe Externalisierung wiederholte Farbstoff. Der Hauptnachteil des aktuellen GEpHIs ist die Tendenz zu aggregieren in cytosolischen Einschlüssen in Reaktion auf Gewebeschäden und Überexpression zu konstruieren. Diese Mängel, Lösungen und die Vorteile des GEpHIs werden in diesem Protokoll durch Bewertung der basolateralen (H+) Protonentransport in funktionell unterschiedliche Haupt- und Ganglion Zellen der extrahierten Fliege MTs demonstriert. Die Techniken und Analyse beschrieben sind leicht anpassbar an eine Vielzahl von Wirbeltieren und Wirbellosen Vorbereitungen und die Raffinesse des Assays kann von der Lehre Labs, um komplizierte Bestimmung der Ionen-Fluss über spezifische Transporter skaliert werden.

Gesundes Gewebe und korrekte Kennzeichnung der vorderen MTs sind entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Während der Dissektion sollte darauf geachtet werden, nicht direkt berühren die MTs und einzige Griff führt sie durch den Harnleiter als greifen die MTs direkt zum Bruch (– Abbildung 4A B). Wenn MTs flach auf der Folie gekehrt werden, die Tubuli darf so wenig wie möglich berührt werden und überflüssige Bewegung verm...

Zelluläre Ionentransport durch die Überwachung der intrazellulären pH-Wert oft beurteilt werden kann (pHich(). Genetisch bieten codiert pH-Indikatoren (GEpHIs) optische Quantifizierung von intrazellulären pH in intakten Zellen. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von intrazellulären pH durch zelluläre ex Vivo Leben-Bildgebung von Malpighian Tubuli von Drosophila Melanogaster mit pHerry, ein Pseudo-ratiometrischen genetisch codiert pH-Indikator.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Das übergeordnete Ziel dieses Bildgebungsprotokolls besteht darin, die Quantifizierung des intrazellulären pH-Werts mithilfe eines genetisch kodierten pH-Indikators zu beschreiben und zu demonstrieren, wie diese Methode zur Beurteilung des basolateralen Protonentransports in einem Modell einer insektenspezifischen Niere, dem Malpighian-Rohr, eingesetzt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des zellulären Transports zu beantworten, beispielsweise wie spezifische Transportproteine zur epithelialen Protonenbewegung bei der Regulation des intrazellulären pH-Werts beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der zelluläre Transport schnell und einfach über mehrere funktionell unterschiedliche Zonen eines intakten Epithels hinweg bewertet werden kann.Obwohl diese Methode Einblicke in die pH-Regulation und das Insektenepithel ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise das Säugetiernephron und epitheliale Zellen in Kultur. Um dieses Verfahren zu beginnen, positionieren Sie zwei Sätze von Löthelfer-Klemmen auf dem Objekttisch des Mikroskops, wobei sich jeweils eine Klammer auf jeder Seite befindet. Danach bringen Sie die jeweils gebogenen Glas-Kapillaren ein, sowie die Zulaufleitung und die mit Vakuum verbundene Ablaufleitung.Danach in der Haltevorrichtung befestigen und mit dem Abbildungsstadium des Mikroskops ausrichten. Vakuumfett auf das Deckband auftragen und den klebenden Perfusionskammer-Teiler fest auf das Band drücken, um dessen Unterseite mit Fett zu beschichten. Den klebenden Perfusionskammer-Teiler abziehen und mit der befetteten Seite nach unten auf einen mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger legen.Danach entfernen Sie den Perfusionskammereinsatz, sodass einzelne, mit hydrophober Fettsubstanz umrandete Kammern übrig bleiben. Anschließend geben Sie 200 Mikroliter IPBS oder Insect Phosphate Buffered Saline (PBS) bei Raumtemperatur in die mit Fettsubstanz umrandete und markierte Kammer auf dem mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger. Danach stellen Sie den Objektträger unter das Stereomikroskop, füllen die Schnittschale mit kaltem Schneider-Medium und übertragen eine einzelne betäubte weibliche Fliege hinein.Halten Sie die Fliege mit einer Pinzette am Thorax fest und greifen Sie mit der anderen vorsichtig das hintere Abdomen. Öffnen Sie das hintere Ende der Fliege durch kurze, gezielte Bewegungen. Sobald die Afterklappe sichtbar ist, greifen Sie das distale Ende an und lösen Sie den Darm und die Antes von den darunterliegenden Tracheen, indem Sie die Afterklappe durch wiederholte kurze Züge vom Körper wegzurren.Pinzieren Sie dann mit feinen Pinzetten die vorderen Anteile des Harnleiters ab, sobald der zweite Satz der Anteile aus dem Bauchraum befreit ist. Nehmen Sie die freien vorderen Anteile mit dem Glasstab auf, indem Sie den Stab unter den Harnleiter schieben, sodass die Tubuli zu beiden Seiten herunterhängen. Heben Sie danach die Anteile senkrecht nach oben aus der Lösung heraus und drehen Sie anschließend den Glasstab, sodass die Anteile und der Harnleiter an der Unterseite des Stabs haften bleiben.Senken Sie den Harnleiter gerade nach unten auf den Objektträger und befestigen Sie ihn, indem Sie die distalen Enden der Ante fixieren, indem Sie den Harnleiter weiter auf den Glasobjektträger drücken. Verwenden Sie das feine Ende des Glasstabes, um jedes Tubulus vorsichtig über die Oberfläche des Objektträgers zu führen. Führen Sie den Stab leicht an der Objektträgeroberfläche entlang, um das Tubulus nicht zu zerquetschen, und schieben Sie den Stab über die Oberseite des Tubulus, wobei Sie sich von distal nach proximal bewegen, um die gesamte Länge jedes Tubulus an der Oberfläche des mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgers zu befestigen.Der Erfolg dieser Technik hängt vollständig von der genauen Identifizierung und sorgfältigen Handhabung der vorderen Malpighischen Tubuli ab. Beschädigte Tubuli führen zu inkonsistenten Ergebnissen. Als Nächstes setzen Sie den klebenden Kammerverteiler wieder auf den Objektträger, um eine kleine, mit Flüssigkeit gefüllte Kammer über dem montierten Tubulus zu bilden.Danach das Präparat auf den Mikroskoptisch stellen. Positionieren Sie die Ein- und Ausflusskapillaren jeweils über die Einlass- und Auslassöffnung des Perfusionsbrunnens. Schalten Sie in diesem Verfahren das Mikroskop, die Lichtquelle und das Abbildungssystem ein und öffnen Sie anschließend die Bildgebungssoftware.Sehen Sie durch die Okulare und stellen Sie den Fokus manuell ein, bis das Lumen der Antes unter Durchlicht klar sichtbar ist. Klicken Sie dann auf den Reiter „Acquisition“ und wählen Sie im Abschnitt „Acquisition Load“ im Ausblendmenü die Option „2x2“. Fügen Sie einen 5%-Neutraldichtefilter in den Lichtweg ein, um die Beleuchtungsintensität zu verringern und Photobleichen zu minimieren.Klicken Sie im Kanalmenü auf den GFP-Kanal und anschließend auf „Live“, um das fluoreszierende Signal über die Kamera zu beobachten. Danach stellen Sie mithilfe des Zeitschiebereglers die Belichtungszeit so ein, dass die Werte der hellsten Pixel im Intensitätshistogramm etwa 40 % des Maximalwerts betragen. Klicken Sie dann auf „Stop“, um die Beleuchtung zu beenden.Wiederholen Sie die Verfahren im RFP-Kanal und bestätigen Sie das Vorhandensein des dilatierten Anfangsabschnitts der vorderen Ante und das Fehlen von Cytosolid-mCherry-Aggregaten, was auf Gewebeschäden oder eine Überexpression hinweist. Aktivieren Sie danach ein Zeitrafferaufnahmeprotokoll, indem Sie das Kontrollkästchen für die Zeitschaltreihe aktivieren. Stellen Sie die Dauer im Dropdown-Menü im Bereich Zeitschaltreihe auf 10 Minuten und den Intervallregler auf null, um die Gesamtaufnahmezeit mit der maximalen Bildaufnahmegeschwindigkeit festzulegen.Dann aktivieren Sie im Kanalabschnitt sowohl das GFP- als auch das RFP-Kästchen. Öffnen Sie die IPBS-Leitung des Perfusionsystems, indem Sie den entsprechenden Ventilcontroller aktivieren, und starten Sie das Bildgebungsprotokoll, indem Sie auf „Experiment starten“ klicken. Nach einer Minute wechseln Sie für 20 Sekunden zur Ammoniumchlorid-Nachbehandlungslösung, indem Sie das entsprechende Ventil öffnen und die IPBS-Leitung schließen.Danach kehren Sie zu IPBS zurück, indem Sie die Ammoniumchlorid-Leitung schließen und das IPBS-Ventil erneut öffnen. Um eine Zweipunktkalibrierung durchzuführen, entfernen Sie den Kammerzwischenwände, indem Sie sie vorsichtig von dem darunterliegenden Objektträger ablösen, und nehmen Sie die Perfusionskapillaren in Klammern aus der Bildgebungsvertiefung heraus. Anschließend geben Sie 200 µL Kalibrierpuffer in IPBS mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu.Entfernen Sie dann die Lösung aus der Bildgebungsvertiefung und ersetzen Sie sie durch weitere 200 Mikroliter Kalibrierlösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal, um einen vollständigen Lösungsaustausch sicherzustellen. Inkubieren Sie anschließend die Probe gemeinsam mit der Kalibrierlösung 30 Minuten vor der Bildaufnahme.Wiederholen Sie das Bildgebungsprotokoll mit denselben zuvor bestimmten Parametern, wobei nur eine Minute Aufnahmezeit verwendet wird. Geben Sie dann 200 Mikroliter Kalibrierpuffer IPBS hinzu, um den pH-Wert auf neun einzustellen. Entfernen Sie die Lösung aus der Bildgebungsvertiefung und ersetzen Sie sie durch weitere 200 Mikroliter Kalibrierlösung.Anschließend die Probe 10 Minuten in der zweiten Kalibrierungslösung inkubieren, bevor die Bildaufnahme durchgeführt wird, und das Bildaufnahmeprotokoll wiederholen. Danach die aufgenommenen Bildstapel in der Bildanalyse-Software überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Pixel in einem der Kanäle gesättigt sind, indem MeanROI angeklickt wird, und dass keine Werte im Intensitätshistogramm den maximal detektierbaren Wert erreichen, während durch den Bildstapel mit dem Frame-Schieberegler gescrollt wird. Als Nächstes den Bildstapel analysieren, indem die fluoreszierende Intensität und das Fluoreszenzverhältnis als Funktion der Zeit dargestellt werden; hier sehen wir die erwartete fluoreszierende Antwort auf den Ammoniumchlorid-Puls in den pH-sensitiven und pH-insensitiven Kanälen des Indikators.Das Verhältnis dieser Signale zeigt die transiente intrazelluläre pH-Änderung an. Um diese Analyse durchzuführen, klicken Sie zuerst auf „meanROI“ und wählen Sie das Freihand-Werkzeug aus. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt, um einen 50 Mikrometer langen MT nachzuzeichnen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Zeichnung des ROI abzuschließen.Danach denselben Schritt in einem Bereich neben dem MT wiederholen, um die Hintergrund-ROI zu definieren. Anschließend unter Messungen „Mittlere Intensität“ anklicken und durch Klicken auf „Exportieren“, „Daten-Tabelle“, „Erstellen“ eine Tabelle mit Intensitätswerten erstellen. Das Konfigurations-Symbol (Zahnradsymbol) anklicken und alle Parameter außer „Zeit“ und „Mittlere Intensität“ abwählen.Rechtsklicken Sie auf die Registerkarte für die neu erstellte Datentabelle, wählen Sie „Speichern unter“ und exportieren Sie die Daten als CSV-Datei. Gezeigt ist hier ein Weitfeldbild, eine superelliptische Fluoreszenz von Fluorescein in Prinzipalzellen des vorderen Antes sowie Sternzellen des vorderen Antes. Beachten Sie, dass die Sternzellen im Anfangsabschnitt stabförmig, im Übergangsabschnitt variabel und im Hauptabschnitt durch deutliche zelluläre Fortsätze gekennzeichnet sind.Dieses Diagramm zeigt die kalibrierten intrazellulären pH-Änderungen als Reaktion auf einen 20 Sekunden langen, 40 Millimolar starken Ammoniumchlorid-Puls in interessierenden Regionen. Gestrichelte Kurven bezeichnen einfache exponentielle Anpassungen, die auf die saure Erholungsphase nach dem Entzug von Ammoniumchlorid angewendet wurden. Daraus werden die Abklingkonstanten abgeleitet.Dieses Diagramm zeigt die Säureausscheidungsrate in Abhängigkeit vom intrazellulären pH-Wert, und dieses Diagramm zeigt den Säurefluss in Abhängigkeit vom intrazellulären pH-Wert, abgeleitet aus den exponentiellen Anpassungen der vorherigen Abbildung. Wenn man die Extraktion der Malpighianischen Tubuli einmal beherrscht, kann sie innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Erfolg vollständig von der Qualität der Dissektion und der genauen Kalibrierung des pH-Indikators abhängt.Diese Vorbereitung kann mit anderen genetisch kodierten Biosensoren wie fluoreszierenden Kalzium- und Halogenidindikatoren kombiniert werden, um den Transport von gelösten Stoffen und die intrazelluläre Signalübertragung in epithelialen Zellen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde Malpighianische Tubuli von Drosophila präpariert, einen genetisch kodierten pH-Indikator abbildet und Protonentransport in epithelialen Zellen quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nitroizene gefährlich sein und Präparationen beschädigen kann; daher sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass keine Ausrüstung, die wiederverwendet werden soll, kontaminiert wird.

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Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Erfahren Sie die optische Quantifizierung des intrazellulären pH in Drosophila-Malpighi-Röhrchen mit dem genetisch codierten Indikator pHerry. Diese Methode ermöglicht die Analyse basolateralen Protonentransports in intakten Epithelzellen.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator (Video) | JoVE Journal

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

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