Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Das übergeordnete Ziel dieses Bildgebungsprotokolls ist es, die Quantifizierung des intrazellulären pH-Werts unter Verwendung eines genetisch kodierten pH-Indikators zu beschreiben und zu zeigen, wie diese Methode zur Beurteilung des basolateralen Protonentransports in einem Insekten-Nierenstrukturmodell, dem Malpighischen Tubulus, verwendet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im zellulären Transportbereich zu beantworten, z. B. wie spezifische Transporterproteine zur epithelialen Protonenbewegung bei der intrazellulären pH-Regulation beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass der zelluläre Transport schnell und einfach über mehrere funktionell unterschiedliche Zonen des intakten Epithels hinweg beurteilt werden kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die pH-Regulation und das Epithel von Insekten geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie das Nephron von Säugetieren und Epithelzellen in Kultur angewendet werden. Um diesen Vorgang zu starten, positionieren Sie zwei Sätze Lötklemmen mit helfenden Händen auf dem Mikroskoptisch, wobei sich auf jeder Seite eine Klemme befindet. Führen Sie anschließend die jeweiligen gebogenen Glaskapillaren und die Zuflussleitung sowie die mit dem Vakuum verbundene Auslaufleitung ein.

Montieren Sie diese dann in die helfenden Hände und richten Sie sie auf den Abbildungstisch des Mikroskops aus. Verteilen Sie Vakuumfett auf das Deckenband und drücken Sie den selbstklebenden Vertiefungsteiler auf das Klebeband, um den Boden mit Fett zu bestreichen. Ziehen Sie die Trennwand für die selbstklebende Perfusionsvertiefung ab und legen Sie sie mit der Fettseite nach unten auf einen mit Poly L-Lysin beschichteten Objektträger.

Entfernen Sie anschließend den Perfusions-Well-Teiler, um einzelne spezifische Wells in hydrophobem Fett zu hinterlassen. Danach geben Sie 200 Mikroliter IPBS oder Insektenphosphatpuffer-Kochsalzlösung bei Raumtemperatur in den gefetteten und gut kreisenden Objektträger auf dem mit Polylysin beschichteten Objektträger. Legen Sie dann den Objektträger unter das Steroskop, gießen Sie eiskaltes Schneider-Medium in die Präparierschale und übertragen Sie eine einzelne betäubte weibliche Fliege darauf.

Halten Sie die Fliege mit einer Pinzette am Brustkorb fest und greifen Sie mit der anderen sanft nach dem hinteren Bauch. Ziehe das hintere Ende des Hosenschlitzes in kurzen, bewussten Bewegungen auf. Sobald der Hinterschutz sichtbar ist, greifen Sie das distale Ende und befreien Sie den Darm und die Antes von den darunter liegenden Trachealen, indem Sie den Hinterschutz durch wiederholte kurze Züge vom Körper wegziehen.

Kneifen Sie dann die vorderen Antes des Harnleiters mit einer feinen Pinzette ab, sobald der zweite Satz Antes vom Bauch befreit ist. Nehmen Sie die freien anterioren Anten mit dem Polglasstab auf, indem Sie den Stab unter den Harnleiter schieben, so dass die Tubuli zu beiden Seiten abfallen. Heben Sie danach die Antes gerade nach oben, aus der Lösung, und drehen Sie danach den Glasstab so, dass die Antes und der Harnleiter an der Unterseite des Stabes haften.

Senken Sie den Harnleiter gerade nach unten auf den Objektträger ab, befestigen Sie dann den Harnleiter und versiegeln Sie die distalen Enden der Anten, indem Sie den Harnleiter weiter auf den Objektträger drücken. Streichen Sie mit dem feinen Ende des Glasstabes vorsichtig über jeden Tubulus über die Objektträgeroberfläche. Streifen Sie den Stab gegen den Objektträger, um ein Zerquetschen des Tubulus zu vermeiden, und schieben Sie den Stab über die Oberseite des Tubulus, indem Sie sich von distal nach proximal bewegen, um die gesamte Länge jedes Tubulus an der Oberfläche des mit Polylysin beschichteten Objektträgers zu befestigen.

Der Erfolg dieser Technik hängt vollständig von der genauen Identifizierung und sorgfältigen Behandlung der vorderen malpighischen Tubuli ab. Beschädigte Tubuli führen zu inkonsistenten Ergebnissen. Setzen Sie als Nächstes den selbstklebenden Vertiefungsteiler wieder auf den Objektträger, um eine kleine mit Flüssigkeit gefüllte Vertiefung über dem montierten Tubulus zu bilden.

Legen Sie danach die Probe auf den Mikroskoptisch. Positionieren Sie die Zu- und Abflusskapillaren über der Einlass- bzw. Auslassöffnung der Vertiefung. Schalten Sie bei diesem Verfahren das Mikroskop, die Lichtquelle und das Bildgebungssystem ein und öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware.

Schauen Sie durch die Okulare und stellen Sie den Fokus manuell ein, bis das Lumen des Antes unter dem durchgelassenen Licht deutlich sichtbar ist. Klicken Sie dann auf die Registerkarte "Erfassung" und wählen Sie "2x2" im Pulldown-Menü "Dimmen" im Abschnitt "Erfassungslast" aus. Setzen Sie einen 5%igen Neutraldichtefilter in den Strahlengang ein, um das Beleuchtungslicht zu reduzieren und das Photobleichen zu minimieren.

Klicken Sie im Kanalmenü auf den GFP-Kanal und dann auf Live, um das Fluoreszenzsignal über die Kamera zu beobachten. Stellen Sie danach den Zeitschieberegler ein, um die Belichtungszeit so einzustellen, dass die hellsten Pixelwerte im Intensitätshistogramm etwa 40 % des Maximalwerts betragen. Klicken Sie dann auf Stopp, um die Beleuchtung zu stoppen.

Wiederholen Sie die Eingriffe im RFP-Kanal und bestätigen Sie das Vorhandensein des erweiterten Anfangssegments des anterioren Ante und das Fehlen von Cytosolid m Kirschaggregaten, was auf eine Gewebeschädigung oder Überexpression hinweist. Aktivieren Sie anschließend ein Zeitraffer-Imaging-Protokoll, indem Sie auf das Kontrollkästchen für die Zeitreihe klicken. Passen Sie die Dauer im Pulldown-Menü im Abschnitt Zeitreihe auf 10 Minuten und den Schieberegler für das Intervall auf Null an, um die Gesamtaufnahmezeit mit der maximalen Bildaufnahme festzulegen.

Aktivieren Sie dann sowohl die GFP- als auch die RFP-Kontrollkästchen im Kanalbereich. Öffnen Sie die IPBS-Leitung des Profusion-Systems, indem Sie die entsprechende Ventilsteuerung aktivieren und starten Sie das Bildgebungsprotokoll mit einem Klick auf Experiment starten. Wechseln Sie nach einer Minute für 20 Sekunden zu Ammoniumchlorid-Nachlösung, indem Sie das entsprechende Ventil öffnen und die IPBS-Leitung schließen.

Kehren Sie dann zum IPBS zurück, indem Sie die Ammoniumchloridleitung schließen und das IPBS-Ventil wieder öffnen. Um eine Zwei-Punkt-Kalibrierung durchzuführen, entfernen Sie den Well-Teiler, indem Sie ihn vom darunter liegenden Objektträger abziehen, und entfernen Sie die Profusionskapillaren in Klammern aus der Imaging-Well. Tragen Sie anschließend 200 Mikroliter IPBS-Kalibrierpuffer auf einen pH-Wert von 7,4 auf.

Nehmen Sie dann die Lösung aus der Bildgebungsvertiefung und ersetzen Sie sie durch weitere 200 Mikroliter Kalibrierlösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang viermal, um einen vollständigen Lösungsaustausch zu gewährleisten. Inkubieren Sie anschließend die Präparations- und Kalibrierlösung 30 Minuten lang, bevor Sie die Bildgebung durchführen.

Wiederholen Sie das Bildgebungsprotokoll mit den gleichen Parametern, die zuvor festgelegt wurden, mit der Änderung von nur einer Minute Bildaufnahme. Fügen Sie dann 200 Mikroliter IPBS-Kalibrierpuffer auf pH neun hinzu. Nehmen Sie die Lösung aus der Bildgebungsvertiefung und ersetzen Sie sie durch weitere 200 Mikroliter Kalibrierlösung.

Inkubieren Sie das Präparat anschließend 10 Minuten vor der Bildgebung in der zweiten Kalibrierlösung und wiederholen Sie das Bildgebungsprotokoll. Überprüfen Sie danach das aufgenommene Bild, das in der Bildanalysesoftware gestapelt wurde, um sicherzustellen, dass keine Pixel in einem der beiden Kanäle gesättigt sind, indem Sie auf MeanROI klicken und dass keine der im Intensitätshistogramm gemeldeten Werte den maximal erkennbaren Wert erreicht haben, während Sie mit dem Frame-Schieberegler durch den Bildstapel scrollen. Analysieren Sie als Nächstes den Bildstapel, indem Sie die Fluoreszenzintensität und das Fluoreszenzverhältnis als Funktion der Zeit darstellen, hier sehen wir die erwartete Fluoreszenzreaktion auf den Ammoniumchloridpuls in den pH-empfindlichen und pH-unempfindlichen Kanälen des Indikators.

Das Verhältnis dieser Signale zeigt die intrazelluläre pH-Vergänglichkeit. Um diese Analyse durchzuführen, klicken Sie zunächst auf meanROI und wählen Sie das Freiform-Tool aus. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt, um einen 50-Mikrometer-MT zu verfolgen, und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Darstellung des ROI abzuschließen.

Wiederholen Sie dies dann in einem Bereich neben dem MT, um den ROI im Hintergrund zu definieren. Klicken Sie anschließend unter Messungen auf mittlere Intensität und erstellen Sie eine Tabelle mit Intensitätswerten, indem Sie auf Exportieren, Datentabelle, Erstellen klicken. Klicken Sie auf das Symbol für das Taktrad der Konfiguration und deaktivieren Sie alle Parameter außer Zeit und mittlerer Intensität.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte für die neu erstellte Datentabelle, wählen Sie Speichern unter und exportieren Sie die Daten als CSV-Datei. Hier ist ein Weitfeldbild zu sehen, eine superelliptische Fluoreszenz in Hauptzellen des anterioren ante und sternen Zellen des anterioren ante. Beachten Sie, dass Sternzellen im Anfangssegment balkenförmig und im Übergangssegment variabel sind und im Hauptsegment deutliche zelluläre Projektionen aufweisen.

Dieses Diagramm zeigt die kalibrierten interzellulären pH-Änderungen als Reaktion auf einen 20-Sekunden-Ammoniumchlorid-Impuls von 40 Millimolar in den interessierenden Regionen. Gestrichelte Kurven zeigen einzelne exponentielle Passungen, die auf die Säurerückgewinnungsphase nach dem Ammoniumchlorid-Entzug angewendet werden. Daraus werden die zerfallenen konstanten Werte abgeleitet.

Dieses Diagramm zeigt die Säureextrusionsrate als Funktion des intrazellulären pH-Werts und dieses Diagramm zeigt den Säurefluss als Funktion des intrazellulären pH-Werts, abgeleitet aus den Exponentialanpassungen aus der vorherigen Abbildung. Einmal gemeistert, kann die Extraktion des malpighischen Tubulus innerhalb von 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass der Erfolg vollständig von der Qualität der Dissektion und der genauen Kalibrierung des pH-Indikators abhängt.

Dieses Präparat kann mit anderen genetisch kodierten Biosensoren wie fluoreszierenden Kalzium- und Halogenidindikatoren kombiniert werden, um die Bewegung gelöster Stoffe und die intrazelluläre Signalübertragung in Epithelzellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde Drosophila malpighian-Tubuli vorbereitet, einen genetisch kodierten pH-Indikator abbildet und die Protonenbewegung in Epithelzellen quantifiziert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nitroizen gefährlich sein kann und die Vorbereitungen beschädigt, weshalb bei der Durchführung dieses Verfahrens Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, um sicherzustellen, dass keine Geräte, die wiederverwendet werden sollen, verunreinigt werden.