Name: Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Erfahren Sie die optische Quantifizierung des intrazellulären pH in Drosophila-Malpighi-Röhrchen mit dem genetisch codierten Indikator pHerry. Diese Methode ermöglicht die Analyse basolateralen Protonentransports in intakten Epithelzellen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH DK092408 und DK100227, Herst AJR wurde von T32-DK007013 unterstützt. Möchten die Autoren danken Dr. Julian A.T. Dow für die CapaR-GAL4 und c724-GAL4 Drosophila Bestände. Wir danken auch Jacob B. Anderson für die Unterstützung, die Aufrechterhaltung der experimenteller fliegen Kreuzungen.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Erfolg der Quantifizierung der pH-Wertich in Drosophila MTs hängt ganz von der Gesundheit der extrahierten MTs und die Qualität der Montage und Zerlegung (Abbildung A – C). So ist der sorgsame Umgang mit Gewebe wie beschrieben zwingend. Folien, die frisch in PLL beschichtet Folien wesentlich Hilfe MT Montage, wie sie neigen dazu, viel mehr Kleber als die zuvor ausgesetzt waren auf Lösung. Sorgfältige Montage hilft auch bei der Identifizierung de...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Quantifizierung von intrazellulären pH (pHi) mit einer genetisch codierte pH-Indikator (GEpHI) zu beschreiben und zeigen, wie diese Methode zur basolateralen H+ Transport in einem Modell Insekt (D. Beurteilung herangezogen werden können Melanogaster) renal Struktur, Malpighian Röhrchen (MT). MTs dienen als die Ausscheidungsorgane der Fruchtfliege und sind funktionell ähnlich der Säugetier-Nephron in einigen wesentlichen Punkten1. MTs sind als 2 Paare der Tubuli (Front- und Seitenzahnbereich) in den Thorax und Abdomen der Fliege angeordnet. Die einzelligen epitheliale Röhre von jeder MT besteht aus metabolisch aktiven wichtigsten Zellen mit deutlichen apikalen (luminalen) sowie basolateralen (Salzhaushalts) Polarität und eingefügten Ganglion Zellen. Vorderen MTs bestehen aus 3 morphologisch, funktionell und entwicklungsgeschichtlich verschiedene Segmente, vor allem die anfängliche geweitet, Segment, Übergangs-Segment und sekretorischen Hauptsegment, verbindet die Harnleiter-2. Auf der zellulären Ebene Trans-epithelialen Ionentransport in das Lumen wird erreicht, indem eine apikale Plasmamembran V-ATPase3 sowie eine Alkali-Metall/H+ -Wärmetauscher und einen basolateralen Na+-K+-ATPase4, nach innen-Gleichrichter-K+ Kanäle5, Na+-getrieben Cl−/HCO3− Wärmetauscher (NDAE1)6und Na+-K+-2 Cl− Cotransporter (NKCC; Ncc69)7, während Ganglion Zellen Cl– vermitteln und Wassertransport8,9. Dieses komplexe, aber zugänglich physiologische System bietet hervorragende Möglichkeiten zur Untersuchung der endogenen Ion Transportmechanismen in Kombination mit den vielfältigen genetischen und Verhaltensstörungen Toolsets von Drosophila.
Die Gründe für dieses Protokoll war ein genetisch formbar System für das Studium der epithelialen Ionentransport mit Potenzial für die Integration von Zelle zu Verhalten und Export von Werkzeugen zu Fremdsystemen Modell zu beschreiben. Ausdruck von pHerry10, erlaubt ein GEpHI abgeleitet aus einer Fusion von grünen pH-Sensitive Super-Ekliptik pHluorin11,12 (SEpH) und rote pH-unempfindliche mCherry13, in MTs Quantifizierung der H+ Transport in MT-Einzelzellen durch die hohe K+/nigericin Kalibrierung Technik14. Wie viele Ionen-Transporter H+ äquivalente bewegen, dient Quantifizierung der intrazellulären pHich als eine funktionelle Darstellung der Ionenbewegung über eine Vielzahl von Transportern. Die Drosophila MT-Modell-System bietet auch genetische Werkzeuge in gewebespezifischen Transgene15 und RNA-Interferenz (RNAi)16 Ausdruck, die zelluläre Bildgebung mit ganz-Orgel-Assays17 kombiniert werden können , 18 , 19 der Röhrchen-Funktion, erstellen Sie eine robusteste Toolset mit vertikalen Integration von Molekülen zu Verhalten. Dies steht im Gegensatz zu vielen anderen Protokollen zur Beurteilung epithelialen Biologie, wie historisch solche Messungen auf komplizierte verlassen haben und erschreckend, Mikro-Dissektion, anspruchsvolle ionenselektive Elektroden20,21, und teure pH-sensitiven Farbstoffen22 mit restriktiven laden Anforderungen und schlechte zelluläre Spezifität in heterogenen Geweben. GEpHIs wurden verwendet, um ausgiebig pHich in einer Vielzahl der Zelle Arten23messen. Frühwerk ausgenutzt die inhärente pH-Empfindlichkeit von Green Fluorescent Protein (GFP) pH-Wertich in kultivierten Epithelzellen24 überwachen, aber zwei Jahrzehnte habe GEpHIs verwendet in Neuronen25, Glia26, Pilze27 , und Pflanzenzellen28. Die Kombination des Potenzials für zelluläre targeting der genetischen Konstrukte durch die GAL4/UAS Ausdruck System15 und die physiologische Zugänglichkeit der Drosophila MT machen dies eine ideale Vorbereitung für Untersuchungen von pHich Regulierung und epithelialen Ionentransport.
pH-Wertesich wurde seit Jahrzehnten untersucht und ist lebenswichtig. Die MT-Vorbereitung bietet ein stabiles Modell zur Physiologie des pH-Wertesich Lehren aber auch anspruchsvolle Untersuchungen von pHi Verordnung ex-Vivo - und in Vivo. Dieses Protokoll beschreibt Quantifizierung der H+ -Bewegung in der basolateralen Membran der Epithelzellen der Drosophila MT mit NH4Cl Puls Säure laden Technik21, aber als pH-Indikator ist genetisch codiert, können diese Methoden und ihre theoretischen Rahmen zur Vorbereitung zu Transgenese und live-Imaging angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin (PLL) Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Bei 4 & Grad lagern; C, kann wiederverwendet werden.</td></tr><tr><td>Nigericin Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>ACHTUNG: Mit Handschuhen anfassen. Als Aliquote von 20 mM Stammlösung in DMSO bei 4 μC lagern.</td></tr><tr><td>Selbstklebende Perfusionskammerabdeckungen, Klebegröße 1 mm, Kammerdurchmesser und -dicke 9 mm und 0,9 mm, Anschlussdurchmesser 1,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>Kann je nach Bedarf ausgetauscht werden, um dem Perfusionssystem gerecht zu werden.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikon-Elastomer-Kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Helping Hands Lötständer</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>60501</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Offenes Schwerkraft-Perfusionssystem mit Ventilsteuerung, 8-zu-1-Verteiler und Reserviors</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td><td>Jedes vergleichbare Perfusionssystem kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Durchflussregler</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>Kann bei Bedarf ausgetauscht werden, um es an das Perfusionssystem anzupassen.</td></tr><tr><td>Schneider's Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td>Store bei 4 &deg; C in sterilen Aliquoten.</td></tr><tr><td>#5 Inox-Stahl-Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Kann je nach Komfort des Experimentators ersetzt werden.</td></tr><tr><td>35 x 10 mm Polystyrol Petrischale</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>Genaue Marke und Größe sind unwichtig.</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Objektträger</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>Die genaue Marke und Größe können variieren, solange die Perfusionsvertiefungen kompatibel sind.</td></tr><tr><td>Filimentiertes Borosilikat-Kapillarglas, ID 1,5 mm, AD 0,86 mm, Dicke 0,32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Filiment nicht erforderlich, Glas kann ersetzt werden, um Perfusionsschläuchen und Perfusionsvertiefungen zu entsprechen.</td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch, ID 1/16", OD 1/8", Dicke 1/32"</td> <td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern, kann ersetzt werden, um dem Perfusionssystem zu entsprechen.</td></tr><tr><td>Vakuum-Silikonfett</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Kunststoff-Durchflussmessklemme</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>Von mehreren Anbietern erhältlich, Sterilität nicht erforderlich</td></tr><tr><td>Glasstäbe, 5 mm Durchmesser</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>Genaue Größe ist persönliche Vorliebe, mehrere Hersteller verfügbar</td></tr><tr><td>PAP Hydrophober Stift</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Von mehreren Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>Siegelfolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Erhältlich bei mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>MES; 4-Morpholineethansulfonsäure-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Hähne; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropansulfonsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5130</td><td>Erhältlich bei mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>10X/0,45 Air Objektiv</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>Vergleichbare Objektive können ersetzt werden. 40X Objektive können für die Einzelzellbildgebung verwendet werden.</td></tr><tr><td>Präparierstereoskop</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td> Es <td>kann jedes Präparierstereoskop verwendet werden.</td></tr><tr><td>UAS-pHerry transgene Drosophila melagnogaster</td><td>Verfügbar bei Romero Lab</td><td></td><td>Erstveröffentlichung: Citation 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Erhältlich bei Romero Lab</td><td></td><td>Erstveröffentlichung: Citation 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Erhältlich bei Romero Lab</td><td></td><td>Erstveröffentlichung: Zitat 2</td></tr><tr><td>monochromatische Digitalkamera mit hoher Empfindlichkeit</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 mono</td><td>Genaue Marke und Modell können variieren, kann durch jede monochromatische hochempfindliche Kamera ersetzt werden, die für die zelluläre Live-Bildgebung geeignet ist.</td></tr><tr><td>GFP/FITC-Filterset, 470/40 nm ex., 515 nm Longpass em., 500 nm dichroitisches</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>Jedes GFP/FITC-Filterset kann ersetzt werden.</td></tr><tr><td>RFP/TRITC-Filtersatz, 546/10 nm ex., 590 nm Langpass em., 565 nm dichroitisches</td><td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>Jedes GFP/FITC-Filterset kann ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Inverses Epifluoszierendes Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>Es kann jedes vergleichbare Mikroskop mit motorischer Filterschaltung verwendet werden. Aufrechte Mikroskope können mit offenen Perfusionsbädern und Wasserimmersionsobjektiven verwendet werden.</td></tr><tr><td>Statistische Analysesoftware</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>Jede Software mit vergleichbarer Funktionalität kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Bildanalysesoftware</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>Jede Software mit vergleichbarer Funktionalität kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Bilderfassungssoftware</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>Jede Software mit vergleichbarer Funktionalität kann ersetzt werden</td></tr><tr><td>Einschneidige Rasierklinge aus Kohlenstoffstahl</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71960</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Objektträgermappe für Mikroskopie</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>Von mehreren Anbietern erhältlich.</td></tr><tr><td>Polystrene Drosophila Aufzuchtfläschchen mit Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>Vergleichbare Artikel können ersetzt werden.</td></tr><tr><td>2,5 L Labor-Eiskübel</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>Erhältlich bei mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>NMDG; N-Methyl-D-glukamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2004</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>200 μl Barriere-Pipettenspitzen</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr><tr><td>200 &#956; L Pipette mit variablem Volumen</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>Erhältlich von mehreren Anbietern.</td></tr></tbody></table>

optische quantifizierung der intrazellulären ph in drosophila melanogaster malpighian röhrchen epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte ph indikator

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epitheliale Ionentransport unbedingt systemische Ion Homöostase sowie Wartung von wesentliche zelluläre elektrochemischen Gradienten. Intrazelluläre pH-Wert (pHich) wird von vielen Ionen-Transporter beeinflusst und somit pHich Überwachung ist ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung der Transporter Aktivität. Moderne genetisch codierte pH-Indikatoren (GEpHIs) bieten optische Quantifizierung der pH-Wertich in intakten Zellen auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dieses Protokoll beschreibt in Echtzeit Quantifizierung der zellulärenich pH-Wertes in Malpighian Tubuli (MTs) von Drosophila Melanogaster durch ex-Vivo Leben-Bildgebung von pHerry, ein Pseudo-ratiometrischen GEpHI mit einem p-Kein gut geeignet zum Nachverfolgen von Änderungen der pH-Wert in der Zellflüssigkeit. Extrahierten Erwachsenen Fliege MTs bestehen aus morphologisch und funktionell unterschiedliche Abschnitte der einzellige Schicht Epithelien und dient als Modell für die Untersuchung von epithelialen Transport zugänglich und genetisch gefügig. GEpHIs bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen pH-Sensitive fluoreszierende Farbstoffe und ionenselektive Elektroden. GEpHIs können unterschiedliche Zellpopulationen beschriften, sofern entsprechende Promotor Elemente verfügbar sind. Diese Kennzeichnung ist besonders nützlich in ex Vivo, in Vivound in Situ Präparate, die von Natur aus heterogen sind. GEpHIs erlauben auch die Quantifizierung der pHi im intakten Gewebe im Laufe der Zeit ohne Notwendigkeit einer Behandlung oder Gewebe Externalisierung wiederholte Farbstoff. Der Hauptnachteil des aktuellen GEpHIs ist die Tendenz zu aggregieren in cytosolischen Einschlüssen in Reaktion auf Gewebeschäden und Überexpression zu konstruieren. Diese Mängel, Lösungen und die Vorteile des GEpHIs werden in diesem Protokoll durch Bewertung der basolateralen (H+) Protonentransport in funktionell unterschiedliche Haupt- und Ganglion Zellen der extrahierten Fliege MTs demonstriert. Die Techniken und Analyse beschrieben sind leicht anpassbar an eine Vielzahl von Wirbeltieren und Wirbellosen Vorbereitungen und die Raffinesse des Assays kann von der Lehre Labs, um komplizierte Bestimmung der Ionen-Fluss über spezifische Transporter skaliert werden.

Gesundes Gewebe und korrekte Kennzeichnung der vorderen MTs sind entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls. Während der Dissektion sollte darauf geachtet werden, nicht direkt berühren die MTs und einzige Griff führt sie durch den Harnleiter als greifen die MTs direkt zum Bruch (– Abbildung 4A B). Wenn MTs flach auf der Folie gekehrt werden, die Tubuli darf so wenig wie möglich berührt werden und überflüssige Bewegung verm...

Zelluläre Ionentransport durch die Überwachung der intrazellulären pH-Wert oft beurteilt werden kann (pHich(). Genetisch bieten codiert pH-Indikatoren (GEpHIs) optische Quantifizierung von intrazellulären pH in intakten Zellen. Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung von intrazellulären pH durch zelluläre ex Vivo Leben-Bildgebung von Malpighian Tubuli von Drosophila Melanogaster mit pHerry, ein Pseudo-ratiometrischen genetisch codiert pH-Indikator.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Das übergeordnete Ziel dieses Bildgebungsprotokolls besteht darin, die Quantifizierung des intrazellulären pH-Werts mithilfe eines genetisch kodierten pH-Indikators zu beschreiben und zu demonstrieren, wie diese Methode zur Beurteilung des basolateralen Protonentransports in einem Modell einer insektenspezifischen Niere, dem Malpighian-Rohr, eingesetzt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des zellulären Transports zu beantworten, beispielsweise wie spezifische Transportproteine zur epithelialen Protonenbewegung bei der Regulation des intrazellulären pH-Werts beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass der zelluläre Transport schnell und einfach über mehrere funktionell unterschiedliche Zonen eines intakten Epithels hinweg bewertet werden kann.Obwohl diese Methode Einblicke in die pH-Regulation und das Insektenepithel ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar, wie beispielsweise das Säugetiernephron und epitheliale Zellen in Kultur. Um dieses Verfahren zu beginnen, positionieren Sie zwei Sätze von Löthelfer-Klemmen auf dem Objekttisch des Mikroskops, wobei sich jeweils eine Klammer auf jeder Seite befindet. Danach brin

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Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

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Visualisierung von Proteinen mit geringer Häufigkeit und posttranslationalen Modifikationen in lebenden Drosophila-Embryonen mittels Fluoreszenz-Antikörper-Injektion

Erfahren Sie die optische Quantifizierung des intrazellulären pH in Drosophila-Malpighi-Röhrchen mit dem genetisch codierten Indikator pHerry. Diese Methode ermöglicht die Analyse basolateralen Protonentransports in intakten Epithelzellen.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator (Video) | JoVE Journal

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

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