Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und effiziente Strategie zur Immobilisierung beliebiger Proteine interessierender Art auf Polyacrylamid-Hydrogelen zu entwickeln, um verschiedene Parameter des zellulären Mikromilieus unabhängig voneinander steuern zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Proteinslösung auf der Oberfläche des PDMS-Stempels verteilt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die strukturierte Oberfläche des PDMS-Stempels vorsichtig mit einem gleichmäßigen Strom von hochreinem Stickstoffgas zu trocknen.

Anschließend wird der mit Protein beschichtete Stempel mit seiner strukturierten Oberfläche auf die getrocknete Hydrogeloberfläche gelegt, und kurze Druckpunkte werden auf die Oberseite des PDMS-Stempels ausgeübt, um einen guten Kontakt zwischen den mikrostrukturierten Merkmalen des Stempels und der Hydrogeloberfläche sicherzustellen. Im letzten Schritt wird der PDMS-Stempel vorsichtig von der Hydrogeloberfläche entfernt und der Stempel nach der Entfernung der Nicht-Druckzonen gereinigt. Mit BSA können Zellen auf der mikrostrukturierten Hydrogeloberfläche angesiedelt werden. Abschließend wird ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop verwendet, um die proteinbasierten Mikrostrukturen zu beobachten.

Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der Mechanotransduktion beantwortet werden, beispielsweise zum relativen Beitrag von Eigenschaften der extrazellulären Matrix, wie Steifigkeit, Dichte der Zellliganden oder Art des Proteins. Während des Ano-Transaktionsprozesses wird empfohlen, das Verfahren in einer chemischen Abzugshaube durchzuführen. Beginnen Sie damit, runde Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 25 Millimetern in eine Petrischale zu legen und sie fünf Minuten lang mit einer 0,1-molaren Natriumhydroxidlösung zu benetzen.

Entfernen Sie die Natronlauge und tauchen Sie die Deckgläser vollständig in sterilem DD H2O ein; schwenken Sie sie 20 Minuten lang vorsichtig auf einer Schüttelplatte. Gießen Sie das sterile DDH₂O ab, geben Sie frisches steriles DDH₂O hinzu, um die Deckgläser vollständig zu bedecken, und schwenken Sie erneut 20 Minuten lang vorsichtig. Entnehmen Sie die Deckgläser mit sterilen Pinzetten und legen Sie sie in eine neue Petrischale. Trocknen Sie die Deckgläser mit der aktivierten Seite nach oben durch einen gleichmäßigen Strom von hochreinem Stickstoffgas.

Nachdem die Deckgläser trocken sind, bringen Sie sie zurück in die sterile Zellkulturhaube und tragen Sie eine dünne Schicht aus drei Trimethylpropylacrylat auf die aktivierte Seite jedes Deckglases auf. Lassen Sie sie eine Stunde lang ruhen. Waschen Sie die Glasdeckgläser anschließend gründlich mit steriler DD H2O.

Danach die Deckgläser in steriles DD H2O in einer neuen Petrischale versenken. Die Petrischale mit Parafilm versiegeln und für 10 Minuten auf einer Wippe unter leichtem Rühren platzieren. Zuletzt die Deckgläser mit sterilen feinspitigen Pinzetten aus dem DDH zwei O in eine neue Petrischale überführen.

Bei aktivierter Seite nach oben. Die Schale mit Aluminiumfolie abdecken, um zu verhindern, dass Staub an den Deckgläsern haftet, und bei Raumtemperatur an einem trockenen Ort lagern. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie fünf Milliliter einer sterilen Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogellösung und 100 Mikroliter einer frischen 10%igen Ammoniumpersulfatlösung vor.

Wie im Protokolltext beschrieben, geben Sie 2,5 µL Tetramethylendiamin und 25 µL der Ammoniumpersulfatlösung zu der Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung hinzu. Um die Polymerisation einzuleiten, mischen Sie die Lösung durch dreimaliges wiederholtes Pipettieren, ohne Blasen einzuschließen, unter sterilen Bedingungen in einer sterilen Werkbank. Geben Sie einen 25-µL-Tropfen der Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung auf eine 25 mm runde Deckglasplatte und setzen Sie unmittelbar danach ein 22 mm rundes Glasdeckglas auf den Tropfen, um die Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung zu verteilen. Das 22-mm-Glasdeckglas war zuvor durch eine siebenminütige Behandlung in einem UV-Ozon-Reiniger aktiviert worden.

Zentrieren Sie die Glasdeckenscheibe mit sterilen Pinzetten und glätten Sie eventuelle Blasen. Lassen Sie das Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel 15 Minuten bei Raumtemperatur polymerisieren. Invertieren Sie manuell die restliche Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel-Lösung im Reaktionsgefäß.

Um den Abschluss des Polymerisationsprozesses zu überwachen, tauchen Sie die Deckgläser vollständig in steriles D DH zwei o. Trennen Sie vorsichtig das 22-Millimeter-Glasdeckglas, indem Sie die Kante einer Rasierklinge zwischen das 22-Millimeter-Glasdeckglas und die Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogelschicht einführen. Waschen Sie das Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel dreimal mit steriler PBS und lassen Sie das Gel vollständig in steriler PBS eingetaucht, um die Hydratation aufrechtzuerhalten.

Die in diesem Verfahren verwendeten Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Mikrostempel wurden gemäß der schriftlichen Anleitung hergestellt. Geben Sie die PDMS-Mikrostempel in eine 50:50-Ethanol-Wasser-Lösung und behandeln Sie sie 15 Minuten lang mit Ultraschall. Trocknen Sie die Stempel mit einem Strom aus Stickstoffgas und legen Sie sie mit der Struktur nach oben sieben Minuten lang in einen UV-Ozon-Reiniger.

Unter einer sterilen Haube einen 150 µL großen Tropfen einer gewünschten Proteinglösung auf die mikrostrukturierte Oberfläche von A-P-D-M-S auftragen. Im vorliegenden Demonstrationsversuch wird Stamp FI nin verwendet. Die Proteinglösung mit einer sterilen Pipettenspitze zu jeder Ecke des Stempels bewegen, um sie gleichmäßig auf der Stempeloberfläche zu verteilen.

Lassen Sie die Proteiniösung 60 Minuten lang auf dem PDMS-Stempel absorbieren. Schalten Sie unter dieser sterilen Haube die Lampen aus, um eine Schädigung der Proteine zu vermeiden. Überführen Sie anschließend die mit hydroxylierter Polyacrylamid-Hydrogel beschichteten Deckgläser in eine neue Petrischale.

Entfernen Sie überschüssiges PBS von der Oberfläche der Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogelsubstrate mit einem schwachen Stickstoffstrom unter sterilen Bedingungen. Stoppen Sie das Verfahren, sobald kein Hinweis auf stehendes Wasser auf der Geloberfläche mehr zu erkennen ist.

Das Gel sollte an dieser Stelle nicht vollständig getrocknet werden. Trocknen Sie die strukturierte Oberfläche des PDMS-Stempels vorsichtig mit einem gleichmäßigen Strom von hochreinem Stickstoffgas. Greifen Sie den proteinbeschichteten Stempel mit chirurgischer Pinzette und bringen Sie die strukturierte Oberfläche in Kontakt mit der getrockneten Hydrogeloberfläche.

Üben Sie mit der Spitze der Pinzette kurze Druckpunkte auf die Oberseite des PDMS-Stempels aus, um einen guten Kontakt zwischen den mikroskopischen Strukturen des Stempels und der Oberfläche des Hydrogels sicherzustellen. Lassen Sie den PDMS-Stempel eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Hydrogeloberfläche. Entfernen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig vom hydroxy-polyacrylamidhaltigen Hydrogel mit einer Mullbinde-Pinzette und reinigen Sie den Stempel durch Schwenken in einer Ethanol-Wasser-Lösung für 15 Minuten. Waschen Sie das bedruckte hydroxy-polyacrylamidhaltige Hydrogel gründlich durch drei Wechsel von PBS unter sterilen Bedingungen, jeweils 10 Minuten pro Wechsel.

Nach der letzten PBS-Waschung eine sterile BSA-Lösung hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichter Agitation auf einer Schüttelplatte inkubieren. Dadurch werden die nicht bedruckten Zonen am folgenden Tag passiviert. Den gestempelten Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel unter sterilen Bedingungen ausgiebig waschen, indem dreimal PBS ausgetauscht wird, jeweils mit einer Dauer von 10 Minuten pro Wechsel.

Gestempelte Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogelen können bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius gelagert werden. Die Ergebnisse zeigen eine lineare Korrelation zwischen der Entwicklung der Steifigkeit von Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogelen und der Menge an Bisacrylamid-Vernetzer. Epifluoreszenzbilder laminierter rechteckiger Mikrostrukturen, die auf Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogelen mit drei unterschiedlichen Steifigkeiten abgeschieden wurden, demonstrieren die unabhängige Einstellung der Mikrostrukturgeometrie und der Matrixsteifigkeit. Die Dichte der Zellliganden kann durch Variation der Konzentration der Proteiniösung, die zum Inkubieren der PDMS-Stempel verwendet wird, moduliert werden.

Hier sind zwei fluoreszierende Bilder von sequenziellen Mikrokontaktdrucken zu sehen. Streifen aus Fibronectin in Rot und Laminin in Grün kreuzen sich in einem Winkel von 90 Grad; zusätzlich wurden Laminin- und Kollagenstreifen nacheinander auf einem 25-Kilo-Pascal-Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel-Substrat mikrogedruckt. Wenn primäre Zellen auf homogen beschichteten und mikrostrukturierten Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel-Oberflächen ausgesät wurden, betrug die Zellviabilität mindestens 80 % bis zu drei Tage nach der Aussaat.

Es wurde außerdem beobachtet, dass die Zellen auf steifen Substraten stärker proliferieren als auf weichen Substraten. Wenn primäre endotheliale Zellen auf rechteckigen, mit Fibronectin beschichteten Mikromustern ausgesät werden, die auf Hydroxy-polyacrylamid-Hydrogelen mit drei unterschiedlichen Steifigkeiten abgeschieden sind, weisen sie auf dem Weichen eine geringe Dichte an Aktinfilamenten und einen runden Zellkern auf.

Auf steiferen Substraten sind Aktinfilamente gerader und dicker, und der Zellkern ist nach seiner Entwicklung verformt. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der mechanischen Transduktion den Weg, um die individuelle Rolle der Parameter der zellulären Mikroumgebungen in einer Vielzahl von zellulären Systemen wie primären Zellen oder Stammzellen, Gewebestrukturen, Modellorganismen, Organismen auf der Ebene von Populationen oder Organsystemen zu untersuchen.