Name: Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Hydroxy-PAAm-Hydrogelen zur Entkopplung mechanotransduktiver Signale. Diese Methode ermöglicht die unabhängige Kontrolle von Mikroumgebungsparametern für Zellbiologie-Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der belgischen Nationalen Stiftung für wissenschaftliche Forschung (F.R.S.-FNRS) durch "MIS Confocal Microscopy", "Crédit aux Chercheurs" Stipendien und das "Nanomotility FRFC project" (Nr. 2.4622.11) unterstützt. Das T.G. Doktorandenstipendium wird von der Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA) unterstützt. Die Autoren danken Sylvain Desprez für die mechanische Charakterisierung und Géraldine Circelli für die konfokale Bildgebung.

1. Aktivieren der Oberfläche des Deckgläser <ol><li> Ort Glaskreisdeckgläser (25 mm Durchmesser) in einer Petrischale und Abstrich 0,1 M NaOH-Lösung auf sie für 5 min (chemischen Abzugshaube empfohlen). </li><li> Entfernen Sie die NaOH-Lösung und vollständig eintauchen Deckgläser mit sterilem ddH2O für 20 min unter leichtem Schaukeln auf einem Schaukelplatte in einem sterilen Kultur Kapuze. </li><li> Abtropfen sterilen ddH2O und wiederholen Sie den Schritt 1.2. </li><li> Entfernen Sie die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit der Aktivseite nach oben. </li><li> Trockendeckgläser unter einem ständigen Strom von hochreinem Stickstoffgas. </li><li> In einem sterilen Kultur Haube, schmieren eine dünne Schicht von 3 (trimethoxysilyl) propylacrylat (92%) auf der Aktivseite der Deckglas für 1 Stunde. </li><li> Ausgiebig waschen Deckgläschen mit 3 Waschungen von sterilen ddH2O und tauchen sie in sterilen ddH2O in einem neuen Petrischale. </li><li> Tippen Sie auf die Petrischalemit Parafilm und legen Sie es auf einer Wippe Platte unter leichtem Schütteln für 10 min. </li><li> Deckgläser abnehmen ddH2O mit einer sterilen Pinzette mit feinen Spitzen und legen Sie sie in eine neue Petrischale mit der Aktivseite nach oben. </li><li> Speichern bei RT in einem trockenen Ort mit Aluminiumfolie, um Staub vom Festhalten an den Deckgläsern zu vermeiden. </li></ol> 2. Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele <ol><li> Vorbereitung ein Gewicht von 65 mg N-Hydroxyethyl-acrylamid (HEA) in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Es ist wichtig, um eine frische HEA-Lösung herzustellen. </li><li> 1 ml 50 mM HEPES-Puffer, um HEA und mischen mit einem Vortexer bis zur vollständigen Auflösung HEA. </li><li> Werden 400 ul 40% w / w in HEPES Acrylamid-Lösung und der gewünschten Menge von 2% w / w in HEPES-bis-acrylamid-Lösung (siehe Tabelle 1), um die gewünschte Steifigkeit zu erreichen Hydrogel. Einstellen mit 50 mM HEPES auf ein Endvolumen von 5 ml. </li><li> Mischen Sie die Lösung mit einem Vortexer und entgasenin einer Vakuumkammer für 20 Minuten, um die Sauerstoffkonzentration in der Lösung, die Hydroxy-PAAm Polymerisation verhindert reduzieren. </li><li> Unter einer sterilen Haube, filtern das entgaste Lösung mit einer 0,2 um Porengröße Filter, um sie zu sterilisieren. </li><li> Aktivieren runden Glasdeckgläschen (22 mm Durchmesser) in einem UV / Ozon-Reiniger während 7 min. </li><li> Planen 100 ul 10% Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung, das heißt 10 mg APS in 100 ul ddH 2 O. Es ist wichtig, um eine frische APS-Lösung herzustellen. </li><li> Fügen 2,5 ul Tetramethylendiamin (TEMED) und 25 ul APS Lösung des sterilisierten Hydroxy-PAAm-Lösung (Schritt 2.5), um die Polymerisation zu initiieren. Mischen Sie die Lösung von 3 aufeinander folgenden Pipettierungen ohne Einführung von Blasen, unter sterilen Bedingungen. </li><li> Unter einer sterilen Haube, legen Sie einen 25 ul Tropfen der Hydroxy-PAAm Lösung im 25 mm Deckglas (ab Schritt 1.9) und sofort legen Sie eine 22 mm glArsch Deckglas (auf Stufe 2.5 vorbereitet) auf der Oberseite des Tropfens, um das Hydroxy-PAAm Lösung zu quetschen. Zentrieren Sie die 22 mm Deckglas mit einer sterilen Pinzette und glätten keine Blasen. </li><li> Ermöglichen Hydroxy-PAAm Hydrogele bei RT für 15 min polymerisiert. Kehren Sie manuell die restlichen Hydroxy-PAAm Lösung in der Eppendorf-Röhrchen, um die Beendigung der Polymerisation Prozess zu folgen. </li><li> Voll eintauchen Deckgläser mit sterilem ddH2O und sorgfältig trennen die 22 mm Deckgläschen durch die Einführung der Kante einer Rasierklinge zwischen den 22 mm Deckgläschen und dem Hydroxy-PAAm Hydrogel-Schicht. </li><li> Mit sterilem PBS waschen Hydroxy-PAAm Hydrogele (3 Austausch von PBS) und lassen Sie die Gele vollständig in sterilem PBS eingetaucht, um Hydratation beizubehalten. </li><li> Speichern Hydroxy-PAAm Hydrogele in sterilem PBS bei 4 ° C für bis zu 3 Tagen. </li></ol> 3. Polydimethylsiloxan (PDMS) Microstamp Fabrication HINWEIS: Die Herstellung eines Silizium-Master ist vor der staRT Das PDMS microstamp Fertigung. Diese Mikro eines Silizium-Master kann durch lithographische Techniken, die spezielle Ausrüstung und Ausbildung erfordert geführt werden. Kooperationen mit einer Nanofabrikation Anlage werden ermutigt, den Silizium-Master herzustellen. Alternativ wenden Sie ein Unternehmen, das maßgeschneiderte mikrostrukturierte Silizium-Meister fertigt auf Anfrage. Es ist wichtig zu beachten, daß die Herstellung des Silizium-Master muss nur einmal durchgeführt werden. In der Tat können mikrostrukturierte Silizium-Meister auf unbestimmte Zeit zu Elastomer Briefmarken verwendet werden. <ol><li> Mix PDMS und Härter in einem 10: 1-Verhältnis in einem Kunststoffbecher und mischen mit einer Pipette für 10 min. </li><li> Entgast PDMS-Mischung unter Vakuum, um Luftblasen, die während der Stufe 3.1 gebildet wurden zu entfernen. </li><li> Legen Sie die mikrostrukturierte Silizium-Master in einer Petrischale und warf einen 10-mm-dicke Schicht von entgastem PDMS-Mischung auf, ohne Bildung von Blasen. </li><li> Lassen Sie die PDMS für 2 Stunden bei 60 ° C in einer heilenOfen. </li><li> In einer staubfreien Umgebung, Peel-off der PDMS-Schicht und der Verbrauch 1 cm 2 microstamps mit einem Skalpell. </li><li> Mit einer Pinzette, microstamps Ort PDMS Muster-up in einer Petrischale. </li></ol> 4. Mikrostrukturierung Hydroxy-PAAm Hydrogele <ol><li> Ort PDMS microstamps in einem Ethanol / Wasser (50:50)-Lösung und beschallen für 15 min. </li><li> Trocknen der Stempel mit einem Strom von Stickstofffluss und sie muster in einem UV / Ozon-Reinigungsmittel (λ &lt;200 nm) für 7 min. </li><li> Unter einer sterilen Haube, legen eine 150 ul-Tropfen einer gewünschten Proteinlösung (beispielsweise 100 ug / ml Laminin in PBS oder 25 ug / ml Fibronektin in PBS) auf die mikrostrukturierte Oberfläche eine 1-cm 2 PDMS-Stempel. </li><li> Optional: Ändern der Konzentration der Proteinlösung in die Zelle-Ligandendichte zu modulieren. </li><li> Ausbreitung der Proteinlösung über die Stempeloberfläche durch Verschieben mit einer sterilen Spitze einer Pipette zu jeder Eckeder Stempel. </li><li> Verlassen Sie die Proteinlösung auf der PDMS-Stempel für 60 Minuten unter einer sterilen Haube zu adsorbieren. Schalten Sie Lampen, um die Proteinschäden zu vermeiden. </li><li> Unter einer sterilen Haube, übertragen Hydroxy-PAAm beschichtete Deckgläser (erhältlich bei Schritt 2.13) in eine Petrischale. </li><li> Entfernen überschüssigen PBS von der Oberfläche Hydroxy-PAAm Substrate mit einem geringen Stickstoffstrom unter sterilen Bedingungen. Stoppen des Verfahrens, sobald keine Hinweise stehendem Wasser auf der Gel-Oberfläche beobachtet. Das Gel sollte nicht gründlich in diesem Stadium getrocknet werden. </li><li> Trocken sorgfältig die strukturierte Oberfläche der PDMS-Stempel mit einem stetigen Strom von hochreinem Stickstoffgas. </li><li> Fassen Sie die Protein-beschichteten Stempel mit Dressing Gewebe Pinzette und legen Sie die strukturierte Oberfläche in Kontakt mit der Oberfläche getrocknete Hydrogel. Gelten kurze Druckpunkte mit der Spitze der Pinzette auf der Oberseite der PDMS-Stempel, um einen guten Kontakt zwischen Stempel und Mikroformen des Hydrogels Oberfläche zu gewährleisten. </li><li> Verlassen Sie die PDMS-Stempel auf the Hydrogel Oberfläche für 1 h bei RT. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig PDMS-Stempel aus Hydroxy-PAAm Hydrogele mit Dressing Gewebe Pinzette und folgen Sie den Schritt 4.1, um den Stempel zu reinigen. </li><li> Waschen umfassend die Stanz Hydroxy-PAAm Hydrogele von 3 Austausch von PBS (pH = 7,4) unter sterilen Bedingungen 10 min pro Austausch. </li><li> Optional: Zusätzliche Mikro anderer ECM-Proteine ​​können durch folgende Schritte 4,5-4,11 auf die Hydroxy-PAAm Oberfläche hinzugefügt werden. </li><li> Passivierung nicht bedruckten Bereiche mit einer sterilen Lösung von BSA bei 5 mg / ml in PBS während einer Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln auf einer Schwingplatte. </li><li> Umfassend Waschen von 3 Austausch von PBS (pH = 7,4) unter sterilen Bedingungen 10 min pro Austausch. In diesem Stadium kann gestanzt Hydroxy-PAAm Hydrogele bei 4 ° C bis zu einer Woche gelagert werden. </li></ol> 5. Zellablage auf mikrostrukturierten Hydroxy-PAAm Hydrogele <ol><li> Deckgläschen in Zellmedium inkubieren 30-45 min vor dem Beschichten cEllen. </li><li> Waschen adhärenten Zellen in einer 75 cm 2 Kulturflasche mit sterilem PBS bei 37 ° C, und nehmen Sie mit 3 ml Trypsin-EDTA oder Accutase für 10 min. </li><li> Übertragen Sie die gewünschte Menge des vorgewärmten komplette Wachstumsmedium entsprechend Ihrer Zelllinie in den Kolben mit den abgelösten Zellen und Zentrifugieren der Zellsuspension für 3 min bei 650 x g. </li><li> Den Überstand mit einer Mikropipette und Die Zellen in komplettem Kulturmedium bei 15-20.000 Zellen / ml. </li><li> 4 ml der Zelllösung zu einem mikroDeckGlas (aus Stufe 5.1) erhalten und Küvette bedeckten Deckglas in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% Feuchtigkeit für 1-2 Stunden. </li><li> Saugen Sie sanft ungebunden Zellen und ersetzen Kulturmedium. Bringen Sie die anhaftenden Zellen in den Inkubator und lassen Sie sie vollständig verteilt (3-6 Stunden, je nach Zelltyp). </li></ol>

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Viele in vitro Beobachtungen in modernen Zellbiologie haben auf starren Glasplättchen, die oft mit einer dünnen Schicht aus ECM-Proteine ​​oder synthetische Peptide, die die RGD-Sequenz beschichtet geführt. Allerdings sind solche grundlegenden Kultursubstraten nicht rekapitulieren die gesamte physikalisch-chemische Komplexität des ECM und somit nicht ein genaues Modell für die Untersuchung zellulärer Mechanotransduktion Prozesse. Um dieses Problem anzugehen, schlagen wir eine einfache Alternative zu zweidimensi...

Viele Aspekte der zellulären Mikroumgebung lokalen (zB Steifigkeit, Porengröße, Art der Proteine ​​oder Zell-Ligandendichte) eine regulatorische Hinweise, die zelluläre Prozesse wie Motilität, Zellproliferation, Differenzierung und Genexpression steuern koordinieren. Modifikationen der physikalisch-chemischen Eigenschaften der extrazellulären Umgebung durch Zellen wahrgenommen werden und zu unterschiedlichen physiologischen Auswirkungen, einschließlich Verformung der Zellpolarisation, Migration und Differenzierung. Es bleibt jedoch unklar, wie die Zellen zu übersetzen ECM Änderungen in zelluläre biochemische Signale. Es ist daher von großer Bedeutung, um in vitro Mikroumgebungen, die die Interaktionen zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung für die Untersuchung Mechanotransduktion Wege reproduzieren gesteuert Ingenieur. Um dieses Problem anzugehen, haben wir vor kurzem eine neuartige Methode 1, genannt Hydroxy-PAAm Hydrogele, auf einfache Weise zwei Centnsional weichen Matrizen, die unabhängig voneinander zu steuern wichtige Hinweise Mechanotransduktion erlauben: Matrix Steifigkeit, Zellgeometrie und Haft, Natur des Proteins und Zell-Ligandendichte. ECM lenkt zelluläre Prozesse über Gradienten in Morphogenen (Chemotaxis), Klebeproteine ​​(Haptotaxis) und Steifigkeit (durotaxis). Im Laufe der letzten Jahrzehnte, fortschrittliche In-vitro-Plattformen wurden entwickelt, um diese extrazelluläre Signale, um zu isolieren, um herauszuarbeiten, wie die Zellen in der Lage, biochemische und biophysikalische Eigenschaften in physiologische Prozesse 2-5 zu übersetzen. Elektronenstrahl 6, Photolithographie 7, photochemische Immobilisierung 8 oder plasmaunterstützte Techniken 9 entwickelt worden, um das Wachstum der lebenden Zellen auf mikro Substrate zu lenken. Obwohl diese Techniken haben wichtige Ergebnisse gebracht, die meisten von ihnen Diskriminierung zwischen den einzelnen Einfluss verschiedener Hinweise auf das Zellverhalten nicht zulassen,und sie erfordern technische Einrichtungen, die nur wenige Labors leisten können. Unter diesen Techniken, Mikrokontakt-Drucken (mCP), wurde als robust und leicht zugängliche Verfahren zur Zell-anhaftenden Mikroinseln 10 zu schaffen taucht. In jüngerer Zeit umfangreiche Bemühungen 11-14 wurden unternommen, um mCP auf Hydrogelen mit abstimmbaren Rigiditäten, um das breite Spektrum der in lebenden Geweben beobachtet Rigiditäten reproduzieren zu entwickeln. Unter diesen Werken, Polyacrylamid (PAAm) populär geworden 15 und ist schon jetzt einer der am häufigsten verwendeten Polymerbasis Matrizen für die Zell Biomechanik-Assays. PAAm Oberflächen sind häufig mit dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel N-Sulfosuccinimidyl-6-[4&#39;-Azido-2&#39;-nitrophenylamido] (Sulfo-SANPAH) und ECM-Proteine ​​auf der Oberfläche durch UV-Aktivierung des Sulfo-SANPAH nitrophenyl verbunden funktionalisierten Azid-Gruppen 16. Eine weitere Technik besteht in Kupplungs Hydrazin, Proteine, die stark oxidiert worden sindmit Perjodat 17. Hynd und Mitarbeiter wurde eine Technik zur Strukturierung biomimetische Oberflächen Hydrogel mit Protein und Peptide, die Photopolymerisation in Gegenwart eines acroyl-Streptavidin-Monomer 18 erfordert. In jüngerer Zeit, Tseng et al. Einen neuen Mikrostrukturierungsverfahren 19 basierend auf tiefen UV-Belichtung durch einen optischen PAAm Quarzmaske, die aktiviert PA-Gelen mit 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimidhydrochlorid inkubieren erfordert (EDC) berichtet und N-Hydroxysuccinimid (NHS) wässrigen Lösungen vor, die das Protein hinzuzufügen. Trotz der Fähigkeit dieser Techniken, um homogene und reproduzierbare Mikroproteine ​​zu erzeugen, die meisten von ihnen leiden wesentliche Einschränkungen: lange Syntheseverfahren (zum Beispiel Dialyse, Lyophilisierung usw.), teure chemische Verbindungen (zB Hyaluronsäure, Sulfo-SANPAH) oder tiefen UV- Bestrahlung. Hinzu kommt, dass diese Techniken nicht zulassen, dass unabhängige Modulation der Steifigkeit Substrat, MikroGeometrie, ECM-Protein der Natur, und Zell-Ligandendichte. Unter Berücksichtigung dieser Einschränkungen zu berücksichtigen, wurde ein neues und einfach auf Acrylamid basierenden Ansatz, der Immobilisierung einer Vielzahl von Proteinen und Biomolekülen auf weichen Hydrogele ermöglicht und erlaubt unabhängige Abstimmung der Mechanotransduktion Signale, um ihre Rolle bei Zellfunktionen entschlüsseln entwickelt. Statt der Behandlung PAAm Hydrogele mit aggressiven chemischen Verbindungen führen wir eine kommerzielle Acrylamid-Monomer mit Hydroxylgruppen während PAAm Polymerisation. Dieser einfache Vorgang überwindet den inneren Antihafteigenschaft PAAm Hydrogele ohne weitere technische Anforderungen. Die Gegenwart von Hydroxyl-Gruppen führt zu einer hohen Affinität Hydroxy-PAAm Hydrogele Proteine ​​und Biomoleküle, die Wasserstoffbrücken bilden. In Kombination mit mCP, Hydroxy-PAAm Hydrogele ermöglichen eine schnelle Erzeugung von zweidimensionalen Kulturplattform mit einem unabhängigen Steuerauf Matrix Steifigkeit, Art der ECM-Proteine, Zelldichte und-Liganden beschränkt Haft, die geplant, um eine leistungsstarke Plattform für die Untersuchung Mechanotransduktion sein werden. Der Zweck dieses Protokolls ist es, die notwendigen Informationen für leicht machen Hydroxy-PAAm Hydrogele ohne Know-how in den Materialwissenschaften liefern. Das ultimative Ziel ist es, ein Mittel bereitzustellen, für Forscher, die physiologisch relevanten Fragen an den zellulären und Gewebespiegel, die zu einem besseren Verständnis der Mechanotransduktion Wege in pathophysiologische Mechanismen führen kann fragen.

<table><tbody><tr><td>UV/Ozon-Photoreaktor</td><td>Ultraviolette Produkte</td><td>Modell PR-100</td><td></td></tr><tr><td>Schaukelplatte</td><td>IKAcWerke</td><td>Modell KS 130 Basic</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Modell Vortex Genie2</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Entgasungskammer</td><td>Angewandte Vakuumtechnik</td><td>DP- 8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette aus Edelstahl mit feiner Spitze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Zange für Verbandsgewebe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen aus Polystyrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie, Dicke 0,5&nbsp; mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>Isoporen-Membranfilter (0,2 &Mikro; m Porengröße)</td><td>Millipore</td><td>GTTP Filtercode</td><td></td></tr><tr><td>Rundes Glasdeckglas (22 mm Durchmesser)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>Rundes Glasdeckglas (25 mm Durchmesser)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette mit variablem Volumen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriffe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturkolben (75 cm2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallbadwanne, massiv (Edelstahl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid (Pulver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Methylenbis(acrylamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxyethylacrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Amoniumpersulfat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>3-(Trimetoxysilyl)propylacrylat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches Plasmafibronektin</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Laminin aus EHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Doppelt destilliertes Wasser (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsmedium für Endothelzellen</td><td>Anwendungen</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellen für menschliche Nabelvenen (HUVEC)</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>PAA Laboratorien</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-Pufferlösung 1 M in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika-Antimykotika</td><td>PAA-Laboratorien</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung</td><td>PAA-Laboratorien</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phaloidin-Molekularsonden</td><td></td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vinculin-Antikörper, hergestellt in der Maus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus Antikörper-Tetramethylrhodamin</td><td>Molekulare Sonden</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronektin (Kaninchen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Laminin-Antikörper (Kaninchen)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2,5L</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von hydroxy-paam hydrogele zur entkopplung der auswirkungen von mechanotransduction cues

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Es ist nun gut bekannt, daß viele zelluläre Funktionen durch Wechselwirkungen von Zellen mit physikalisch-chemischen und mechanischen Signale der extrazellulären Matrix (ECM)-Umgebung reguliert. Eukaryotischen Zellen spüren ständig ihre lokalen Mikroumgebung durch Oberflächen Mechanosensoren zu körperlichen Veränderungen von ECM in biochemische Signale transduzieren, und integrieren diese Signale an bestimmten Veränderungen in der Genexpression zu erzielen. Interessant ist, physikalisch-chemischen und mechanischen Parameter des ECM Paar miteinander, um das Schicksal der Zelle regulieren. Daher ist ein Schlüssel zum Verständnis Mechanotransduktion um den relativen Beitrag der ECM Hinweise auf zelluläre Funktionen zu entkoppeln. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Versuchsprotokoll, um schnell und einfach erzeugen biologisch relevanten Hydrogele für die unabhängige Abstimmung der Mechanotransduktion Cues in vitro. Wir chemisch modifiziertes Polyacrylamid-Hydrogele (PAAm), um ihre nicht-eigen ADHES überwindenive Eigenschaften durch Einbau Hydroxyl-funktionalisierten Acrylamid-Monomeren während der Polymerisation. Wir erhalten eine neue PAAm Hydrogel genannt Hydroxy-PAAm, die Immobilisierung von jeder gewünschten Art von ECM-Proteinen erlaubt. Die Kombination von Hydroxy-PAAm Hydrogele mit Mikrokontaktdrucken ermöglicht, unabhängig die Morphologie der einzelnen Zellen, die Matrix Steifigkeit, die Art und die Dichte der extrazellulären Matrixproteinen. Wir bieten eine einfache und schnelle Methode, die in jedem Biologielabor eingestellt werden können, in-vitro-Zell Mechanotransduktion Prozesse zu untersuchen. Wir validieren diesem Roman zweidimensionale Plattform durch die Durchführung von Experimenten auf Endothelzellen, die eine mechanische Kopplung zwischen ECM Steifigkeit und den Zellkern zu demonstrieren.

Figur 1A zeigt die Co-Polymerisation von Acrylamid (AAM) und Bisacrylamid (bis-AAM) mit N-Hydroxyethylacrylamid (HEA) Monomeren, die eine primäre Hydroxylgruppe durch statistische radikalische Polymerisation mit eingelagerten Hydroxygruppen gebildet ein hydrophiles Netzwerk von Polyacrylamid (hydroxy-PAAm) . In diesem Protokoll muss ein Gewicht 65 mg HEA in einem Volumen von 1 ml HEPES verdünnt werden. Wissend, dass die Dichte der HEA ist ungefähr gleich eins ist, gehen wir davon aus, dass wir erhalten ...

Wir präsentieren ein neues Polyacrylamid-Hydrogel, genannt Hydroxy-PAAm, die mit minimalen Kosten oder Know-how eine direkte Bindung von ECM-Proteine ​​ermöglicht. Die Kombination von Hydroxy-PAAm Hydrogele mit Mikrokontaktdruck erleichtert eine unabhängige Steuerung der vielen Hinweise des natürlichen Zellmikroumgebung für die Untersuchung zellulärer mechanostransduction.

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine einfache und effiziente Strategie zur Immobilisierung beliebiger Proteine interessierender Art auf Polyacrylamid-Hydrogelen zu entwickeln, um verschiedene Parameter des zellulären Mikromilieus unabhängig voneinander steuern zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst die Proteinslösung auf der Oberfläche des PDMS-Stempels verteilt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die strukturierte Oberfläche des PDMS-Stempels vorsichtig mit einem gleichmäßigen Strom von hochreinem Stickstoffgas zu trocknen. Anschließend wird der mit Protein beschichtete Stempel mit seiner strukturierten Oberfläche auf die getrocknete Hydrogeloberfläche gelegt, und kurze Druckpunkte werden auf die Oberseite des PDMS-Stempels ausgeübt, um einen guten Kontakt zwischen den mikrostrukturierten Merkmalen des Stempels und der Hydrogeloberfläche sicherzustellen. Im letzten Schritt wird der PDMS-Stempel vorsichtig von der Hydrogeloberfläche entfernt und der Stempel nach der Entfernung der Nicht-Druckzonen gereinigt. Mit BSA können Zellen auf der mikrostrukturierten Hydrogeloberfläche angesiedelt werden. Abschließend wird ein invertiertes Fluoreszenzmikros

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Wirkung von Substraten Steifigkeit auf die zelluläre Funktion modelliert werden...

Untersuchung der Auswirkungen von Matrix Stiffness auf Cellular-Funktion mit Acrylamid-basierte Hydrogele

Dieses Video zeigt quantitative Zeitraffermikroskopie zur Bewertung der extrazellulären Matrixsteifigkeitsabhängigkeit von Listeria monocytogenes Verbreitung durch Endothelzellen. Ein weicheres Hydrogel ermöglicht eine schnellere bakterielle Ausbreitung durch Endothelzellen im Vergleich zu steiferen Gegenstücken, was den Einfluss der Matrixsteifigkeit auf die bakterielle Verbreitung unterstreicht.

Quantitative Zeitraffermikroskopie zur Beurteilung der Steifigkeitsabhängigkeit der extrazellulären Matrix

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Bei dieser Methode verwenden wir Photopolymerisation und klicken Sie auf Chemie Techniken zum Erstellen von Protein oder Peptid Mustern auf der Oberfläche von Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele, Bereitstellung immobilisiert bioaktiven Signale für die Erforschung der zellulären Reaktionen in-vitro- .

Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen

Wir haben eine Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zum Sondieren der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf bakterielle Infektion von adhärenten Zellen entwickelt. Dieser Assay ist kompatibel mit Durchflusszytometrie, Immunostaining und Traktion Rasterkraftmikroskopie, zulassend quantitative Messungen der biomechanischen Wechselwirkungen zwischen Zellen, extrazelluläre Matrix und Pathogene Bakterien.

Ein Multi-well-Format Polyacrylamid-basierten Test zur Untersuchung der Wirkung der extrazellulären Matrix Steifigkeit auf die bakterielle Infektion von adhärenten Zellen

Hier ist ein Protokoll für die Verkapselung und Kultivierung von Zellen in Poly(ethylene glycol) (PEG) Hydrogele funktionalisiert mit einem Fluorogenic Matrix-Metalloproteinase (MMP) präsentiert-abbaubar Peptid. Zelluläre MMP und Stoffwechselaktivität werden direkt von der Hydrogel-Kulturen mit einem standard Mikrotestplatte Reader gemessen.

Messung der globalen zellulären Matrix Metalloproteinase und metabolische Aktivität in 3D Hydrogele

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokolle werden hier beschrieben, um mechanische Signale in vitro mit multipotenten O9-1-Neuralleistenzellen und Polyacrylamid-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit zu untersuchen.

Ein optimiertes O9-1/Hydrogel-System zur Untersuchung mechanischer Signale in Neuralleistenzellen

Nah-UV-Lithographie und Zugkraftmikroskopie werden kombiniert, um zelluläre Kräfte auf mikrostrukturierte Hydrogele zu messen. Die gezielte lichtinduzierte Freisetzung einzelner Zellen ermöglicht eine hohe Anzahl von Messungen an derselben Probe.

Kontrolle der Zelladhäsion mit Hydrogel-Patterning-Techniken für Anwendungen in der Zugkraftmikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines einzigartigen zweischichtigen mikrofluidischen Geräts vor, um die elektromechanische Regulation der Homöostase des Epithelgewebes zu untersuchen. Das Gerät legt statische physiologische elektrische Ströme senkrecht zur Gewebeebene an, die die Zell-Zell-Adhäsion, Proliferation und Extrusion beeinflussen. Lebendzell-Imaging und mechanische Stressmessungen enthüllen die Mechanismen dieser Prozesse.

Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Erfahren Sie die Herstellung von Hydroxy-PAAm-Hydrogelen zur Entkopplung mechanotransduktiver Signale. Diese Methode ermöglicht die unabhängige Kontrolle von Mikroumgebungsparametern für Zellbiologie-Forschung.

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

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