Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine einfache und effiziente Strategie zur Immobilisierung beliebiger Proteine auf Polyacrylamid-Hydrogelen zu entwickeln, um verschiedene Parameter der Zellmikroumgebung unabhängig voneinander zu steuern. Dies wird erreicht, indem zunächst die Proteinlösung auf der PDMS-Stempeloberfläche verteilt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die strukturierte Oberfläche des PDMS-Stempels sorgfältig mit einem stetigen Strom von hochreinem Stickstoffgas zu trocknen.

Als nächstes wird der proteinbeschichtete Stempel mit einer strukturierten Oberfläche in Kontakt mit der getrockneten Hydrogeloberfläche platziert und kurze Druckpunkte werden auf die Oberseite des PDMS-Stempels aufgebracht, um einen guten Kontakt zwischen den Mikromerkmalen des Stempels und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten. Der letzte Schritt besteht darin, den PDMS-Stempel vorsichtig von der Hydrogeloberfläche zu entfernen und den Stempel nach der Veröffentlichung der nicht gedruckten Zonen zu reinigen. Mit BSA können Zellen auf der Oberfläche des Mikromusters Hydrogel platziert werden. Schließlich wird ein inverses Fluoreszenzmikroskop verwendet, um die Mikromerkmale des Proteins zu beobachten.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Mechano-Transduktion zu beantworten, wie z. B. den relativen Beitrag der extrazellulären Matrixeigenschaften, z. B. Steifigkeit, Zellligonendichte oder Proteinnatur. Es wird empfohlen, dieses Verfahren in einem chemischen Abzug durchzuführen. Beginnen Sie damit, kreisförmige Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 25 Millimetern in eine Petrischale zu legen und fünf Minuten lang 0,1 molare Natronlauge darauf zu schmieren.

Entfernen Sie die Natronlauge und tauchen Sie die Deckgläser vollständig in steriles DD H2O ein, schütteln Sie es 20 Minuten lang sanft auf einer Schaukelplatte, lassen Sie das sterile DDH zwei O abtropfen und fügen Sie sterileres DDH zwei O hinzu, um die Deckgläser vollständig einzutauchen, und schaukeln Sie weitere 20 Minuten lang vorsichtig. Entfernen Sie die Deckgläser mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine neue Petrischale. Wenn die aktivierte Seite nach oben trocken ist, gleitet der Deckdeckel mit einem stetigen Fluss von hochreinem Stickstoffgas.

Sobald die Deckgläser trocken sind, bringen Sie sie zurück in die sterile Kulturhaube und schmieren Sie eine dünne Schicht aus drei Trimethylpropyl-ACRL auf die aktivierte Seite jeder Abdeckung. Nach einer Stunde eine Stunde schlüpfen. Waschen Sie die Glasabdeckfolien ausgiebig mit sterilem DD H2O.

Tauchen Sie dann die Deckgläser in steriles DD H2O in eine neue Petrischale. Verschließen Sie die Petrischale mit Para-Folie und legen Sie sie auf eine Schaukelplatte unter leichtem Rühren für 10 Minuten. Zum Schluss übertragen Sie mit einer sterilen Pinzette mit feinen Spitzen die Deckgläser von der DDH zwei O in eine neue Petrischale.

Mit der aktivierten Vorderseite nach oben. Decken Sie die Schüssel mit Alufolie ab, damit kein Staub an den Deckgläsern haften bleibt, und lagern Sie sie bei Raumtemperatur an einem trockenen Ort. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie fünf Milliliter einer sterilen Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung und 100 Mikroliter einer frischen 10%igen Ammonium-pro-Sulfat-Lösung vor.

Wie im Protokolltext beschrieben, fügen Sie der Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung 2,5 Mikroliter Tetramethylendiamin und 25 Mikroliter der Ammoniumpersulfatlösung hinzu. Um die Polymerisation zu initiieren, mischen Sie die Lösung durch dreimaliges Pipettieren ohne Einbringen von Blasen unter sterilen Bedingungen unter einer sterilen Haube, geben Sie einen 25-Mikroliter-Tropfen der Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung auf einen 25 Millimeter kreisförmigen Deckglas und legen Sie sofort einen 22 Millimeter kreisförmigen Glasdeckglas auf das Tröpfchen, um die Hydroxypolyacrylamid-Hydrogellösung zusammenzudrücken. Das 22 Millimeter große Glasdeckglas wurde zuvor durch eine siebenminütige Exposition in einem UV-Ozonreiniger aktiviert.

Zentrieren Sie den gläsernen Deckglas mit einer sterilen Pinzette und glätten Sie alle Blasen. Lassen Sie das Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel 15 Minuten lang bei Raumtemperatur polymerisieren. Die restliche Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel-Lösung im Röhrchen manuell umdrehen.

Um den Abschluss des Polymerisationsprozesses zu verfolgen, tauchen Sie die Deckgläser vollständig mit sterilem D DH zwei o ein. Trennen Sie den 22-Millimeter-Glasdeckglas vorsichtig, indem Sie die Kante einer Rasierklinge zwischen den 22-Millimeter-Glasdeckglas und die Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel-Schicht einführen. Waschen Sie das Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel dreimal mit sterilem PBS und lassen Sie das Gel vollständig in steriles PBS eintauchen, um die Hydratation aufrechtzuerhalten.

Die bei diesem Verfahren verwendeten Polydimethylsoan- oder PDMS-Mikrostempel wurden wie im Textprotokoll beschrieben hergestellt. Legen Sie die PDMS-Mikrostempel in eine 50 bis 50 % Ethanol-Wasserlösung und beschallen Sie sie 15 Minuten lang. Trocknen Sie die Stempel mit einem Dampf aus Stickstoff und legen Sie sie sieben Minuten lang in einen UV-Ozonreiniger.

Geben Sie unter einer sterilen Haube einen 150-Mikroliter-Tropfen einer gewünschten Proteinlösung auf die mikrostrukturierte Oberfläche von A-P-D-M-S. In dieser Demonstration wird der Stempel FI nin verwendet. Verteilen Sie die Proteinlösung auf der Oberfläche des Stempels, indem Sie sie mit einer sterilen Pipettenspitze in Richtung jeder Ecke des Stempels bewegen.

Lassen Sie die Proteinlösung 60 Minuten lang auf dem PDMS-Stempel einziehen. Schalten Sie unter dieser sterilen Haube die Lampen aus, um Proteinschäden zu vermeiden. Übertragen Sie als Nächstes die mit Hydroxypolyacrylamid Hydrogel beschichteten Deckgläser in eine neue Petrischale.

Entfernen Sie überschüssiges PBS von der Oberfläche der Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel-Substrate mit dem geringen Stickstoffstrom unter sterilen Bedingungen. Stoppen Sie den Vorgang. Sobald keine Anzeichen von stehendem Wasser auf der Geloberfläche zu beobachten sind.

Das Gel sollte zu diesem Zeitpunkt nicht gründlich getrocknet werden. Trocknen Sie die strukturierte Oberfläche des PDMS-Stempels sorgfältig mit einem gleichmäßigen Strom von hochreinem Stickstoffgas. Fassen Sie den proteinbeschichteten Stempel mit einer Verbandszange und bringen Sie eine strukturierte Oberfläche in Kontakt mit der getrockneten Hydrogeloberfläche.

Bringen Sie mit der Pinzettenspitze kurze Druckpunkte auf die Oberseite des PDMS-Stempels an, um einen guten Kontakt zwischen den Mikromerkmalen des Stempels und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten, und lassen Sie den PDMS-Stempel nach einer Stunde eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf der Hydrogeloberfläche. Entfernen Sie den PDMS-Stempel vorsichtig mit einer Verbandszange aus dem Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel und reinigen Sie den Stempel, indem Sie ihn 15 Minuten lang in einer Ethanol-Wasserlösung Unzucht treiben. Waschen Sie das gestanzte Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel ausgiebig durch dreimaligen Austausch von PBS unter sterilen Bedingungen für 10 Minuten pro Austausch.

Nach der letzten PBS-Wäsche eine sterile BSA-Lösung hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren auf einer Schaukelplatte inkubieren. Dadurch werden die nicht gedruckten Zonen am nächsten Tag gefressen. Waschen Sie das gestanzte Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel ausgiebig durch dreimaligen Austausch von PBS unter sterilen Bedingungen für 10 Minuten pro Austausch.

Gestanzte Hydroxypolyacrylamid-Hydrogele können bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius gelagert werden. Die Ergebnisse zeigen eine lineare Korrelation zwischen der Entwicklung der Steifigkeit von Hydroxypolyacrylamid-Hydrogelen und der Menge an Bis-Acrylamid-Vernetzer-Epi-Fluoreszenzbildern von rechteckigen Laminat-Mikromustern, die auf Hydroxypolyacrylamid-Hydrogelen mit drei verschiedenen Steifigkeiten abgeschieden wurden, zeigen die unabhängige Abstimmung der Mikromustergeometrie und der Matrixsteifigkeit. Die Zellligandendichte kann moduliert werden, indem die Konzentration der Proteinlösung, die zur Inkubation der PDMS-Stempel verwendet wird, variiert wird.

Hier sind zwei Fluoreszenzbilder aus sequentiellen Mikrokontaktdrucken zu sehen. Streifen aus Fibronektin in Rot und Laminin in Grün, im 90-Grad-Winkel gekreuzt, und Fibrin-Laminin- und Kollagenstreifen, die nacheinander auf ein 25-Kilo-Pascal-Hydroxy-Polyacrylamid-Hydrogel-Substrat gedruckt wurden. Wenn Primärzellen auf homogen beschichteten und mikrostrukturierten Hydroxypolyacrylamid-Hydrogel-Oberflächen plattiert wurden, betrug die Zellviabilität bis zu drei Tage nach der Beschichtung mindestens 80 %.

Es wurde auch beobachtet, dass sich die Zellen auf steifen Substraten stärker vermehren als auf weichen Substraten. Bei der Beschichtung auf rechteckigen Fibronektin-beschichteten Mikromustern werden auf Hydroxypolyacrylamid-Hydrogele mit drei verschiedenen Steifigkeiten abgeschieden. Primäre Endothelzellen weisen eine geringe Aktinfaserdichte und einen abgerundeten Kern auf der weichen Seite auf.

Die Substrate auf steiferen Substraten, Aktinfasern, sind gerader und dicker und der Zellkern wird nach seiner Entwicklung verformt. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der mechanischen Transduktion, um die individuelle Rolle der Parameter der Zellmikroumgebungen in einer Vielzahl von zellulären Systemen wie Primär- oder Stammzellen, Gewebeebene, Modellorganismus, Mode-, Demografie- oder Organsystemen zu untersuchen.