Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Verfahren zu beschreiben, die für die erfolgreiche Erzeugung genetisch veränderter Mäuse durch Mikroinjektion von Eizellen erforderlich sind. Dieses Protokoll kann Forschern und technischem Personal helfen, die sich sowohl mit der Genese von Mäusen, als auch mit dem Gen-Targeting befassen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf der direkten Injektion von Maus-Eizellen beruht, sowohl für die zufällige Integration, als auch für das Gen-Targeting, wodurch genetisch veränderte Mäuse in nur sechs Wochen erzeugt werden können.

Um eine einzelne Guide-RNA herzustellen, wird nach Auswahl der gewünschten zwei Zielsequenzen und Herstellung von Primern gemäß dem Textprotokoll ein lineares DNA-Template synthetisiert, indem das PX330-Plasmid auf 10 Nanogramm pro Mikroliter in nukleasefreiem Wasser verdünnt wird. Bereiten Sie einen Mastermix vor, fügen Sie zum Schluss die Polymerase hinzu und bewahren Sie ihn auf Eis auf. Mischen Sie dann die Lösung und teilen Sie sie in acht PCR-Röhrchen auf.

Fügen Sie einen Mikroliter PXR330 pro Tube hinzu und führen Sie das folgende Programm aus. Verwenden Sie anschließend ein PCR-Aufreinigungskit, einen Verteiler und eine Vakuumquelle, um das PCR-Produkt zu reinigen. Geben Sie fünf Volumen Bindungspuffer zu einem Volumen der PCR-Probe und mischen Sie.

Platzieren Sie die Spin-Säule der Silikonmembran auf dem Verteiler. Um DNA zu binden, geben Sie alle acht Proben im Vakuum auf die Säule. Um die Probe zu waschen, geben Sie 0,75 Milliliter Waschpuffer in die Säule und saugen Sie sie ab.

Zentrifugieren Sie dann die Säule 60 Sekunden lang bei 12.000 mal G, um Ethanolreste zu entfernen. Legen Sie die Säule in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann zur Eluierung der DNA 30 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Mitte der Membran hinzu. Lassen Sie die Säule eine Minute lang stehen und zentrifugieren Sie sie, 12.000 Mal G für 60 Sekunden.

Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die DNA-Konzentration zu messen. Um eine In-vitro-Transkription mit einem t7-RNA-Synthesekit durchzuführen, bereiten Sie den Mastermix vor und inkubieren Sie die Reaktion in einem Thermocycler bei 37 Grad Celsius für drei Stunden. Fügen Sie 28 Mikroliter nukleasefreies Wasser und zwei Mikroliter DNA hinzu und inkubieren Sie die Reaktion für weitere 15 Minuten.

Um die RNA zu reinigen, lösen Sie das in der mitgelieferten Spin-Säule enthaltene Pulver und 650 Mikroliter nukleasefreien Mikroinjektionspuffer auf. Entfernen Sie vorsichtig alle Luftblasen, verschließen Sie das Röhrchen und hydratisieren Sie die Lösung fünf bis 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die blaue Kappe an der Unterseite und legen Sie die Säule in ein zwei Milliliter Röhrchen.

Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 750 mal G bei Raumtemperatur für zwei Minuten. Legen Sie dann die Säule in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und tragen Sie 50 Mikroliter der RNA-Lösung tropfenweise auf die Mitte auf, ohne die Säulenwand zu berühren. Drehen Sie dann die Säule zwei Minuten lang mit dem 750-fachen G.

Messen Sie die RNA-Konzentration und beurteilen Sie die Qualität der RNA gemäß dem Textprotokoll. Verdünnen Sie unter Verwendung eines nukleasefreien Mikroinjektionspuffers die mRNA um neun auf 50 Nanogramm pro Mikroliter und die sgRNAs auf 12,5 Nanogramm pro Mikroliter für Gen-Knockout-Experimente. Fügen Sie das Donor-Template in einer Konzentration von 200 Nanogramm pro Mikroliter hinzu, um das Genome Editing auf der Grundlage der Homologie-Direktreparatur durchzuführen, und halten Sie es auf Eis.

Verwenden Sie das Aspirator-Mundstück, um die Eizellen mit vier frischen Tropfen Kasein-Aminosäuren zu waschen. Und geben Sie sie in einen letzten Tropfen Casome Eight Medium, der mit Mineralöl überzogen ist. Um eine pro-nukleare Injektion für die zufällige Integration durchzuführen, verwenden Sie unter dem Stereomikroskop das Aspiratormundstück, um etwa 50 Eier in einen Tropfen m2 Medium zu verwandeln, der mit Mineralöl überzogen ist, das als Injektionskammer verwendet wird.

Übertragen Sie die Injektionskammer in ein inverses Mikroskop und injizieren Sie die befruchteten Eizellen mit einigen Pikolitern der Injektionsmischung. Der Vorkern schwillt an, wenn die Injektion erfolgreich ist. Führen Sie eine zytoplasmatische Injektion für das Gen-Targeting durch, übertragen Sie mit einem Mundstück etwa 50 Eier in einen Tropfen Casom A, der fünf Mikrogramm pro Milliliter Cytochalasin B enthält, und inkubieren Sie die Eier fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Übertragen Sie die Eier in die Injektionskammer und injizieren Sie dann bei sehr niedrigem Druck einige Pikoliter der Injektionsmischung in das Zytoplasma. Wenn möglich, unter Verwendung des Ausgleichsdrucks des automatisierten Mikroinjektors. Nach der Injektion überführen Sie die Eizellen mit dem Mundstück wieder in einen Tropfen Casomeaminosäuren.

Bewahren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid auf, bis sie für die Reimplantation in den Eileiter der Pseudoschwangeren Hündinnen geladen werden. Nach der Anästhesie einer verstopften weiblichen Maus gemäß dem Textprotokoll wird der Fortpflanzungstrakt mit einem Skalpell einem ein Zentimeter langen Schnitt parallel zur dorsalen Mittellinie ausgesetzt, um eine Reimplantation unter sterilen Bedingungen durchzuführen. Schneiden Sie dann mit einer Schere den Muskel ab und greifen Sie mit einer Pinzette nach dem Fettpolster.

Ziehen Sie den Eierstock vorsichtig heraus, bis der daran befestigte Eileiter und die Gebärmutter deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie dann eine Gefäßklemme, um das Fettpolster zu fixieren. Unter dem Stereomikroskop machen Sie mit einer Mikroschere einen Schnitt in die Wand des Eileiters, einige Millimeter vor der Ampulle.

Laden Sie außerdem unter dem Stereomikroskop 25 mikroinjizierte Eier in die Glaskapillare, die mit dem Mundstück verbunden ist. Führen Sie dann die Glaskapillare in den Eileiter ein und stoßen Sie die Eizellen aus, bis eine Luftblase im Inneren der Ampulle sichtbar ist. Um sicherzustellen, dass die Reimplantation erfolgreich war, müssen Sie das Vorhandensein der Luftblase in der Ampulle überprüfen, die garantiert, dass alle Eizellen an der richtigen Stelle ausgestoßen wurden und keine in der Glaskapillare verbleibt.

Entfernen Sie vorsichtig die Glaskapillare und legen Sie den Fortpflanzungstrakt wieder in den Bauch. Verwenden Sie dann drei nicht-resorbierbare chirurgische Nähte, um den Schnitt zu nähen, und verwenden Sie dann Wundclips, um die Haut zu schließen. Legen Sie die Maus auf eine warme Matte, um eine Unterkühlung zu vermeiden, und injizieren Sie das Analgetikum subkutan.

Überwachen Sie die Maus bis zur vollständigen Wiederherstellung. Führen Sie abschließend die Genomtypisierung und Sequenzierung gemäß dem Textprotokoll durch. Diese Abbildung zeigt analytische Gele, die die Qualität der Transgenreinigung und der sgRNA-Synthese demonstrieren, die für die erfolgreiche Erzeugung genetisch veränderter Mäuse entscheidend sind.

Hier ist ein typisches Auslesen einer Mikroinjektionssitzung für die zufällige Integration. Der Genotypisierungsprimer sollte auf dem Transgen sitzen und so ausgelegt sein, dass er ein Fragment von 200 bis 800 Basenpaaren erzeugt. In dieser Auslese für das Gen-Targeting wurden die Primer ausgewählt, um mit der genomischen DNA außerhalb der Region zu hybridisieren, die schließlich von den beiden Jungs herausgeschnitten wurde.

Diese Strategie ermöglicht die direkte Identifizierung von heterozygoten und homozygoten Knock-out-Gründern. Wie hier dargestellt, sollte bei der Optimierung jedes Schritts des Protokolls der Prozentsatz der transgenen Welpen 10 % bis 25 % für die zufällige Integration erreichen, was im Vergleich zur Fähigkeit der CRISPR-Komponenten, das Mausgenom zu bearbeiten, etwas gering ist. Bei der Verwendung von CRISPR für das Gen-Targeting ist die Anzahl der Gründer im Allgemeinen höher und reicht von 25 % bis 100 %. Es ist nicht ungewöhnlich, eine ganze Nachkommenschaft zu erhalten, die bei der Bearbeitung mit CRISPR erfolgreich homozygot ist.

Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik Forschern in Bereichen wie den Neurowissenschaften oder Krebs, neue Maskenmodelle zu verwenden, um pathologische Mechanismen zu entdecken und diese schließlich in therapeutische Strategien umzusetzen.