Name: Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Erkennung von Doppelstrang-RNA durch chemisch modifizierte Peptid-Nukleinsäuren. Diese Methode ermöglicht gezielte RNA-Strukturanalyse für die RNA-chemische Biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde von der Singapore Ministry of Education (MOE) Stufe 1 (RGT3/13 und RG42/15, g.c.) und MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 und MOE2015-T2-1-028, g.c.) unterstützt.

Eine Patentanmeldung (PAT/179/14/15/PCT) basiert auf der Arbeit hier berichtet wurde eingereicht.

RNA Duplex-Bindung PNA Oligomere (z.B. 10-Mers) sind Moleküle, die mittlere und somit können zeigen elektrophoretische Mobilität Verschiebung auf verbindliche RNAs mit einer vergleichbar oder etwas größeren Größe (z. B., 50-Mer oder kleiner). Wenn eine RNA deutlich größer als die PNA ist, Titration von PNA in RNA funktioniert möglicherweise nicht aufgrund einer begrenzten Gel-Mobilität-Verschiebung. So kann die großen RNA für die nicht-Denaturierung Seite Assays abgeschnitten werden. Titration von eine große RNA in einem Fluorophore beschriftet PNA ermöglicht die Überwachung der triplex Bildung durch ein nicht denaturierenden Agarosegel mit der Probe in der Mitte der Gel40geladen.
Für eine Titration Experiment nicht Denaturierung seitenweise mit konstanter Gesamtkonzentration von RNS verwenden wir in der Regel eine unbeschriftete RNA-Konzentration von 1 µM für effiziente Post Färbung freie RNA und triplex Bands durch Interkalation Bromid. Eine RNA-Konzentration so niedrig wie 0,2 µM kann auch abhängig von der RNA Konstrukt31ausreichen. Die Konzentration der unbeschrifteten RNA (0,2 µM) bestimmt, dass die K-d -Werte, die genau gemessen werden können über 0,2 µM oder größer sein sollte. Andere Färbung Farbstoffe können verwendet werden, um die Färbung Effizienz zu erhöhen. Alternativ zufolge unsere unveröffentlichten Daten Cy3 Farbstoff-markierten RNAs in nicht Denaturierung Seite Experimente verwendet werden können, um die feste Bindung Ereignisse zu messen.
Die 2-Aminopurine nur mäßig Leuchtstoff ist, ist 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration auch beschränkt sich auf die Messung der Bindung mit K-d -Werte nahe oder über 0,2 µM31. Die RNA oder PNA kann mit einem relativ hellen Farbstoff zur Quantifizierung eine relativ enge Bindung in Lösung durch Fluoreszenz Titration, wenn die Bindung ergibt sich Änderungen in der Fluoreszenz Signale53,54, beschriftet werden 55.
Die Strategie des Zielens RNA-Strukturen durch DsRNA-Bindung PNAs wurde für eine begrenzte Anzahl von RNAs getestet. Es ist wahrscheinlich, dass bindende Eigenschaften für DsRNAs mit verschiedenen Sequenzen und Basenpaar Kompositionen variieren kann. Man kann immer die Purin-reiche Strang eines Duplex für die Gestaltung der TFPNAs wählen. Es ist wichtig zu verstehen, wie in Folge an C-G-Tripel können die Stabilität der ein Triplex beeinträchtigen. Umfangreichere Studien der reihenfolgeabhängigen sind klar zu verstehen, die reihenfolgeabhängigen Bindungseigenschaften des TFPNAs erforderlich.
Die Bindungsaffinität des TFPNAs kann durch Erhöhung der Länge und/oder weitere Basen und Backbones56,57 des TFPNAs ändern weiter gesteigert werden. Allerdings kann eine kontinuierliche duplex Region nicht oft von mehr als 10 aufeinanderfolgenden Basenpaaren ohne Störung durch nicht-Watson-Crick-Strukturen bestehen. Man kann TFPNAs mit kleinen Molekülen für die Anerkennung von nicht-Watson-Crick-Strukturen an DsRNA Regionen angrenzenden konjugieren. Im Prinzip soll ein TFPNA kleines Molekül Konjugat Bindungsaffinität und Spezifität im Vergleich zu einer TFPNA oder kleines Molekül allein verbessert haben. Jedoch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Linkers für die Konjugation58,59,60,61,62,63,64 muss optimiert werden.
Die Tatsache, dass TFPNAs selektiv, um DsRNAs über SsRNAs binden können und DsDNAs deutet darauf hin, dass es möglich ist, TFPNAs zu entwickeln, als sehr nützlich chemische Sonden und mögliche therapeutische Liganden durch die Regulierung der RNA Strukturdynamik und Interaktionen mit Proteinen und Metaboliten. Zelluläre Aufnahme von TFPNAs kann erleichtert werden, durch die Konjugation mit Zelle eindringen Moieties wie kleinen Molekülen, Peptiden, und Nanopartikel oder Komplexierung mit supramolekularen Strukturen wie Liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Weiter kann Funktionalisierung von TFPNAs mit Bioimaging Tags wie Fluorophore und Radioisotopen die Erkennung, imaging und Ausrichtung der funktionalen RNA-Strukturen in lebenden Organismen erleichtern.

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele, durch die jüngsten Fortschritte in der Entdeckungen der RNAs Rollen in der Verordnung und Katalyse von diversen biologischen Prozessen1,2,3. Traditionell wurden antisense Stränge zur Bindung an SsRNAs durch Watson-Crick duplex Bildung3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. vor kurzem Triplex-bildende Peptid-Nukleinsäuren (TFPNAs) wurden entwickelt, um DsRNAs über Hoogsteen Wasserstoffbindung (Abbildung 1)3,28,29binden. DsRNA Regionen befinden sich in den meisten der traditionellen Antisense-gezielte RNAs, einschließlich Pre-mRNAs und mRNAs, Pre oder Pri-MiRNAs3und viele andere nicht-kodierende RNAs1,26,27. DsRNAs durch Dreifachhelix Bildung mit TFPNAs Targeting kann aufgrund seiner Struktur Besonderheit vorteilhaft sein und ist mit großem Potenzial für den Einsatz bei der Wiederherstellung der normalen Funktionen der RNAs, die Dysregulated in Krankheiten, zum Beispiel.
Die kürzlich veröffentlichten Arbeiten von Rozners Et Al., und uns3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, berichtet die Bemühungen zur Verbesserung der die selektive Bindung von modifizierten TFPNAs in Richtung DsRNAs mit verstärkten Affinität. Wir haben Synthesemethoden für rational gestalteten PNA Monomere (Abbildung 2) einschließlich Thio-Pseudoisocytosine (L) Monomer30 und Guanidin-modifizierten 5-Methyl Cytosin (Q) Monomer31entwickelt. Durch verschiedene biochemische und biophysikalische Charakterisierungsmethoden haben wir gezeigt, dass relativ kurzen PNAs (6-10 Rückstände) Einbeziehung L und Q Rückstände verbesserte Erkennung von Watson-Crick-G-C- und C-G Basenpaaren, bzw. in DsRNAs zeigen. Darüber hinaus zeigen im Vergleich zu unveränderten PNAs, PNAs, die L und Q Rückstände enthalten mehr selektive Bindung in Richtung DsRNA SsRNA und DsDNA. Die Guanidin-Funktionalität-42 in der Q-Base ermöglicht PNAs HeLa Zellen31eingeben.
In unserem Labor zu synthetisieren wir PNAs durch manuellen Boc-Chemie (Boc oder t- Boc steht für Tert-Butyloxycarbony (siehe Abbildung 2) Festphasen-Peptid-Synthese Methode4. Die Synthese von PNA Monomer mit Boc als das Amin Gruppe zu schützen ist praktisch, da die Boc Group sterisch weniger sperrig im Vergleich zu Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin Schutz-Gruppe, die während der Kopplung ist auf PNA-Monomer kann vorteilhaft sein die solide Unterstützung. Die Boc Group ist Säure-labil und kann leicht auf die solide Unterstützung von 20-50 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in Dichlormethan (DCM) während der PNA Synthese entfernt. Ein automatisierte Peptid-Synthesizer einsetzbar, PNA Oligomere zu synthetisieren; Allerdings braucht man 3-5-fach Übermaß an PNA Monomer für eine automatisierte Peptid-Synthesizer. Manuelle Synthese erfordert deutlich weniger PNA Monomer (2-3-Fach Selbstbehalt), mit jede Kupplung leicht von der Kaiser-Test43überwacht. Darüber hinaus sind viele automatisierte Synthesizer während der Boc-Schritt Entfernung nicht kompatibel mit der Boc-Strategie-Synthese durch den Einsatz von ätzenden TFA.
Die PNA-Oligomere können durch Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von MALDI-TOF gereinigt werden (Abbildungen 3 und 4)30, 31. beschäftigen wir nicht Denaturierung Seite triplex Bildung zu überwachen, dass freie RNA-Duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration Rate (Abbildung 5)30,31 . Keine Kennzeichnung ist erforderlich, wenn Post-effiziente Färbung für beide RNA duplex und PNA· erreicht werden kann RNS2 triplex Bands. Eine relativ kleine Menge der Probe ist für nicht-Denaturierung Seite Experimente erforderlich. Jedoch die Belastung (Inkubation) Puffer und die laufenden Puffer (pH 8,3) dasselbe, was in den Messungen wird beschränkt auf die kinetisch stabilen Triplexen, weil ein relativ hoher pH-Wert von 8,3 deutlich ein Triplex destabilisieren kann möglicherweise nicht.
2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); der 2-Aminopurine Fluoreszenzintensität (mit einer Emission Peak bei etwa 370 nm) ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung, und ist geeignet für die Überwachung der triplex Formation mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA Website (verbindlich aufgenommen Abbildung 6) 31. im Gegensatz zu vielen anderen Farbstoffen, die Fluoreszenzemission im sichtbaren Bereich zeigen, 2 Aminopurine beschriftet RNA kann ausgesetzt werden Raumlicht ohne Foto bleichen. Im Gegensatz zu Seite Experiment, in dem ein laufende Puffer pH 8,3 ist oft notwendig, 2-Aminopurine basierte Fluoreszenz Titration ermöglicht die Messung der Bindung in einer Lösung bei einem bestimmten pH-Wert, und so gestatten die Messung und Erfassung von relativ schwach und kinetisch instabil Bindung im Gleichgewicht.
UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität von Maisonetten (Abbildung 7)31 und triplexe30,32,44,45. Je nach Länge und Sequenz das Schmelzen des Triplexen kann oder kann nicht zeigen einen deutlichen Übergang. Thermodynamischen Parameter können erhalten werden, wenn die Heiz- und Kurven überlappen. Exakte thermodynamische Parameter erhalten Sie durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC)32; relativ große Mengen an Proben sind jedoch in der Regel erforderlich für ITC.

<table><tbody><tr><td>Molekularsiebe, 4A, Pellets mit 1-2 mm Durchmesser&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylaminhydrochlorid (MBHA&Yuml; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamin (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhyrid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Testkit&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Unmodifizierte PNA-Monomere</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisol</td><td>Alfa Aesar A14846</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluormethansulfonsäure</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 endcapped (5 & micro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Oligos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kundenspezifisch&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-Methylenbisacrylamid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer, pH 8,3</td><td>1. Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidiumbromid (10 mg/ml)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Hochpräzisionszelle (Quarz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenz-spezifische und gezielte anerkennung der doppelstrang-rna über single-stranded rna durch chemisch modifiziert peptid-nukleinsäuren

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele. So gibt es großes Potenzial bei der Entwicklung von chemischen Sonden und therapeutische Liganden für die Anerkennung der RNA-Sequenz und Struktur. Chemisch verändert Peptide Nucleic Acid (PNA) Oligomere vor kurzem entwickelt worden sind, die RNA-Maisonetten in einer Sequenz-spezifische Weise erkennen können. PNAs sind chemisch stabil mit einem neutralen Peptid-ähnliche-Backbone. PNAs können relativ leicht durch das manuelle Boc-Chemie Festphasen-Peptid-Synthese-Verfahren synthetisiert werden. PNAs sind durch Reverse-Phase-HPLC, gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) gereinigt. Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Technik erleichtert die Bildgebung der triplex-Formation, da sorgfältig entworfen, freie RNA duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration raten. Non-Denaturierung Seite mit Interkalation Bromid Post Färbung ist oft eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. In der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen lässt sich PNA Bindeeigenschaften wie verbindliche Affinitäten und Besonderheiten charakterisieren. 2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); die 2-Aminopurine Fluoreszenz-Intensität ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung und eignet sich für die Überwachung der triplex Bildung mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA-Bindungsstelle aufgenommen. 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration kann auch verwendet werden, um die verbindliche Selektivität der modifizierten PNAs zur gezielten doppelsträngigen RNAs (DsRNAs) über einzelsträngigen RNAs (SsRNAs) zu bestätigen. UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität des PNA-RNA Maisonetten und PNA· RNA-2 -Triplexen. Hier beschreiben wir die Synthese und Reinigung von PNA Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände und biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs beschreiben.

Reverse-Phase-HPLC ermöglicht die Reinigung von PNA Oligomere. Wir erhalten reine PNA Oligomere mit zwei Runden der HPLC-Reinigung (Abbildung 3). Die Identität des PNAs kann durch MALDI-TOF-Analyse (Abbildung 4) bestätigt werden.
Non-Denaturierung Seite ist eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. Wir verwenden in der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen Bindeeigenschaften (Abbildung 5) zu charakterisieren. Die nicht Denaturierung Seitendaten in Abbildung 5 dargestellten vorschlagen deutlich, dass die Q - und L-modifizierte PNA eine DsRNA-Region mit einem C-G-paar (Abbildung 5B, Bodenplatte) erkennen kann aber keiner ohne ein C-G-paar (Abbildung 5B, top Panel). Diese besondere und verbesserte Anerkennung ist durch die T· A-U, L· G-C und an C-G PNA· RNS2 base Triple (Abbildung 1A, C, D) Bildung. Verschiedene PNAs mit einzelnen oder mehreren Mutationen können auch verwendet werden, die verbesserten Bindungseigenschaften von einem modifizierten PNA zu demonstrieren. Wir haben gezeigt, dass 2 mM Mg2 + in der Inkubation Puffer hinzufügen die Bindung nicht beeinflusst erheblich31.
Wir haben 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration zeigen, die eine Q und L geändert PNA an eine gezielte DsRNA Region (Abbildung 6A, 6 C, 6D) aber nicht SsRNA (Abbildung 6B, 6E, 6F bindet). PNA P3 bindet an die 2-Aminopurine-Label DsRNA mit einem K-d -Wert von 0,8 ± 0,1 µM. Die Fluoreszenzintensität auf 370 nm für die 2-Aminopurine-Label SsRNA bleibt relativ konstant mit abwechslungsreichen P3-Konzentration, zeigt den Mangel an Bindung von PNA P3 an der SsRNA.
PNAs mit Q Rückstände (P2 und P3) zeigen keine thermische Übergänge (Abbildung 7), schlägt keine Bindung an die SsRNA schmelzen. Dies ist aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie Q-G paar vorhanden. Im Vergleich zu unveränderten PNA P1, PNAs P4 und P5 mit geändert L Rückstände aber keine Q-Rückstände, Show sank Schmelztemperaturen für die entsprechenden RNA-PNA-Maisonetten aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie L-G paar vorhanden. Die UV-Absorption-erkannt schmelzenden Temperaturdaten sind konsistent mit den 2-Aminopurine Fluoreszenz-Titration-Daten, die auch zeigen, dass ein PNA mit Q und L Rückstände nicht merklich zu SsRNA bindet (Abbildung 6B, 6E, 6F). Einbindung der Q-Base ist mehr als eine L-Basis, destabilisierenden, wie eine Q-Base einen bedeutenderen sterischen Zusammenstoß bei der Bildung der Watson-Crick-wie Q-G zwei (Abbildung 1F hat) im Vergleich zu ein paar Watson-Crick-wie L-G (Abbildung 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1 : Chemische Strukturen der stabilen Basis Dreibett- und instabilen Basenpaar Strukturen. (A-D) Major-Nut PNA· RNS2 base verdreifacht sich der T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) und an C-G (D). (E, F) Instabile Watson-Crick wie PNA-RNA Basenpaare des L-G (E) und Q-G (F). Der Buchstabe R steht das Zucker-Phosphat-Rückgrat der RNA. Wasserstoffbrücken sind durch schwarz gestrichelte Linien angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31abgebildet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Abbildung 2 : Chemische Strukturen von PNA Monomere. Vier PNA Monomere (T, C, L und Q) werden angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Chemische Struktur von einem PNA Oligomer und Reinigung mittels RP-HPLC. (A) chemische Struktur der PNA Sequenz P3. (B, C) RP-HPLC-Daten von Rohöl PNA P3 (B) und wieder gereinigt PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : MALDI-TOF-Spektrum der gereinigten PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : RNA-Haarnadel und PNA-Sequenzen und verbindliche Charakterisierung nicht Denaturierung seitenweise. (A) RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2), PNA P3 und eine PNA· RNS2 triplex zwischen PNA P3 und rHP2 gebildet. (B) nicht-Denaturierung Seite (12 %) ergibt sich für rHP1 und rHP2 Bindung an PNA P3. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Die geladenen RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2) sind bei 1 µM in 20 µL. Die PNA-Konzentrationen in Bahnen von links nach rechts sind 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, und 50 µM. PNA P3 bindet nicht an rHP1 (Oberseite) aber bindet an rHP2 (Bodenplatte). (C) Kd Bestimmung für P3 Bindung an rHP2. Der Anteil der triplex Bildung (Y) war gegen die PNA-Konzentration aufgetragen. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Fluoreszenz Titration Studie der PNA P3 Bindungzu 2 Aminopurine beschriftet RNAs. Der 2-Aminopurine Rückstand wird als "2" in der RNA-Sequenz bezeichnet. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) eine PNA· RNS2 triplex zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-Label DsRNA (dsRNA2-2AP) gebildet. (B) ein hypothetisches PNA-RNA Maisonette zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-mit der Bezeichnung SsRNA (ssRNA2-2AP) gebildet. (C, E) Fluoreszenz-Emissionsspektren für die 2-Aminopurine-Label RNA duplex (1 µM) und SsRNA (1 µM), abwechslungsreich, bzw. mit P3-Konzentration bei pH 7,5. Der Peak bei etwa 475 nm ist durch die schwache Fluoreszenzemission von der L-Basis in der PNA. (D, F) K d Bestimmung basiert auf den Grundstücken der Fluoreszenzintensität 2-Aminopurine (370 nm) des RNA-Duplex und SsRNA, bzw. im Vergleich zu PNA P3 Konzentration. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Thermische schmelzen Ergebnisse für RNA-PNA Maisonetten. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alle Proben enthalten 5 µM einsträngige RNA (ssRNA1) und PNA in 130 µL. (A) Single-Stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 und P5) und eine hypothetische PNA-RNA-Maisonette zwischen PNA P3 und ssRNA1 in einer parallelen Ausrichtung gebildet. Die sterische Zusammenstoß ist für die Watson-Crick wie Q-G und L-G-Paare angegeben. (B) Melting Kurven für verschiedene PNAs Bindung an ssRNA1. Die Schmelztemperaturen werden für die Kurven mit schmelzender Übergänge angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31angepasst.

Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Das übergeordnete Ziel dieses Methodenartikels ist es, die detaillierten Protokolle vorzustellen, die unser Labor zur Untersuchung der molekularen Erkennung doppelsträngiger RNAs durch chemisch modifizierte Peptid-Nukleinsäuren verwendet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Chemischen Biologie zu beantworten, beispielsweise die Detektion und gezielte Ansteuerung von RNA-Strukturen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Designprinzipien auf die gezielte Ansteuerung beliebiger RNA-Duplexstrukturen übertragbar sind.Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Desiree Toh, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie vier µL einer 35 %igen Glycerinlösung zu zuvor vorbereiteten RNA-PNA-Proben hinzufügen und vorsichtig mischen. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette und Gel-Ladespitzen vorsichtig je 20 µL jeder Probe auf ein zuvor vorbereitetes Polyacrylamidgel, und achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschließen.Führen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 250 Volt fünf Stunden lang laufen. Nach fünf Stunden schalten Sie die Stromversorgung aus und nehmen die Glasplatte vom Gel-Apparat ab. Entfernen Sie anschließend das Dichtungsband des Gels und zerlegen Sie die Glasplatte.Entfernen Sie das Gel vorsichtig von der Glasplatte und legen Sie es in einen Behälter, der mit 350 Millilitern deionisiertem Wasser gefüllt ist. Geben Sie vorsichtig 35 Mikroliter Bromidethidium zum Behälter hinzu und stellen Sie diesen für 30 Minuten auf den Plattenschüttler mit niedriger Geschwindigkeit. Nachdem Sie die Bromidethidium-Lösung entsorgt haben, spülen Sie das Gel mit 1,5 bis zwei Litern destilliertem Wasser ab. Scannen Sie dann das Gel mit einem Imaging-System, das über einen grünen Laser von 532 Nanometern verfügt und einen Emissionsfilter bei 610 Nanometern verwendet. Quantifizieren Sie die Bandenintensitäten im Gel mithilfe einer kostenlosen Software. Überführen Sie die geeignete Menge an mit 2-Aminopurin markierter doppelsträngiger RNA in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen.Anschließend die RNA-Lösungen mit einem Vakuumkonzentrator eindampfen. Danach die geeigneten Volumina der gezielten PNA für verschiedene Konzentrationen aus dem zuvor hergestellten Hauptansatz in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Die PNA-Lösungen anschließend mittels des Vakuumkonzentrators eindampfen.Fügen Sie 975 Mikroliter Inkubationspuffer zu dem Röhrchen mit der getrockneten RNA hinzu und mischen Sie gründlich, um sicherzustellen, dass die gesamte RNA gelöst ist. Nach einer kurzen Zentrifugation der RNA-Lösung führen Sie eine Annealing-Behandlung durch, indem Sie das Röhrchen für 10 Minuten in einen vorgeheizten Wärmeblock stellen. Schalten Sie anschließend den Wärmeblock aus und lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen.Fügen Sie 75 Mikroliter RNA zu jedem der Röhrchen mit dem getrockneten PNA hinzu und mischen Sie gründlich. Nachdem die Proben mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen wurden, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Überführen Sie nun die entsprechenden Mengen an 2-Aminopurin-markierter einzelsträngiger RNA in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen.Überführen Sie die geeigneten Volumina der gezielten PNA für verschiedene Konzentrationen aus dem Hauptansatz in die jeweiligen Röhrchen mit einzelsträngiger RNA. Nach dem Trocknen der Proben geben Sie 75 Mikroliter Inkubationspuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen gründlich. Führen Sie für jede Probe eine Annealing-Behandlung durch, indem Sie jedes Röhrchen 10 Minuten lang in einen vorgewärmten Heizblock stellen.Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Danach überführen Sie 70 Mikroliter jeder Probe in eine quadratische Küvette mit einem Zentimeter Lichtweg. Stellen Sie die Küvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer und messen Sie die Emission im Wellenlängenbereich von 330 bis 550 Nanometern.Nach Abschluss der Messung den Puffer aus der Küvette entfernen. Die Küvette mit destilliertem Wasser spülen und mit Stickstoffgas trocknen. Nach Wiederholung der Messung für alle Proben die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge auftragen.Überführen Sie die entsprechenden Mengen an einzelsträngiger RNA in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen. Anschließend pipettieren Sie die entsprechenden Volumina der gezielten PNA aus dem Hauptansatz in die jeweiligen Röhrchen mit der einzelsträngigen RNA. Nach dem Trocknen der Proben geben Sie 130 Mikroliter Inkubationspuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen gründlich. Unterziehen Sie jede Probe einem Annealing, indem Sie jedes Röhrchen für 10 Minuten in einen vorgewärmten Heizblock geben. Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Überführen Sie nun 130 Mikroliter jeder Probe in eine Acht-Mikrozelle-Küvette, wobei eine Zelle Inkubationspuffer enthält.Unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrophotometers die Absorption jedes Proben bei 260 Nanometern messen. Die Messung bei steigender Temperatur von 15 auf 95 Grad Celsius und anschließend bei fallender Temperatur von 95 auf 15 Grad Celsius mit einer Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit von 0,5 Grad Celsius pro Minute durchführen. PNA-Oligomere wurden nach zwei Reinstufen mittels umgekehrter Phasen-HPLC erhalten.Die Identität der PNA kann mittels MALDI/TOF-Analyse bestätigt werden. Die Daten der nichtdenaturierenden PAGE deuten darauf hin, dass die mit Q und L modifizierte PNA ausschließlich die doppelsträngige RNA-Region mit einem C-G-Paar erkennen kann. Diese spezifische und verstärkte Erkennung erfolgt durch die Bildung zweier Basentripel: T-A-U-L-G-C und Q-C-G zwischen PNA und RNA.Eine Fluoreszenz-Titrationsstudie mit 2-Aminopurin zeigte, dass ein mit Q und L modifiziertes PNA an eine gezielte doppelsträngige RNA bindet, jedoch nicht an einzelsträngige RNA. PNAs, die Q-Reste enthalten, zeigen keine thermischen Schmelzübergänge, was auf einen fehlenden Bindungsvorgang an einzelsträngige RNA aufgrund des sterischen Konflikts im Watson-Crick-ähnlichen Q-G-Paar hindeutet. Im Vergleich zu unmodifiziertem PNA P1 weisen die PNAs P4 und P5, die L-Reste enthalten, eine niedrigere Schmelztemperatur für die entsprechenden RNA-PNA-Duplexe auf, bedingt durch den sterischen Konflikt im Watson-Crick-ähnlichen L-G-Paar. Die mittels UV-Absorption erfassten thermischen Schmelzdaten stimmen mit den 2-Aminopurin-Fluoreszenz-Titrationsdaten überein, die ebenfalls zeigen, dass ein PNA, das Q- und L-Reste enthält, nicht stark an einzelsträngige RNA bindet. Die Einbindung einer Q-Base ist stärker destabilisierend als die einer L-Base, da die Q-Base beim Ausbilden eines Watson-Crick-ähnlichen Q-G-Paares einen stärkeren sterischen Hinderungsgrund aufweist. Wenn die Methoden einmal beherrscht sind, können die verschiedenen Experimente innerhalb einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.Nach dieser Methode können weitere Verfahren wie die Untersuchung und gezielte Ansteuerung von RNA-Strukturen in Zellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob wir RNA-Strukturen nachweisen und die Funktionen von RNA mithilfe doppelsträngig bindender RNA-PNAs regulieren können. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie und der Krankheitsforschung den Weg, therapeutische Ansätze zu entwickeln, die gezielt auf die Struktur von RNA abzielen.

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hochdurchsatz-selektiven 2-Hydroxyl-Acylierung durch Primer-Extension (FORM) analysiert verwendet einen neuartigen chemischen Tastertechnologie, reverse Transkription, Kapillarelektrophorese und Sekundärstrukturvorhersage Software, um die Strukturen der RNAs, die von mehreren hundert bis zu mehreren tausend bestimmen Nukleotide an Einzel-Nukleotid-Auflösung.

RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

Wir beschreiben ein Protokoll zur RNA-bindende Proteine und RNA-bindende Regionen in lebenden Zellen mit UV-vermittelten Photocrosslinking und Massenspektrometrie.

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Diese RNA Pulldown-Methode ermöglicht es, die RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA (LncRNA) zu identifizieren. Basierend auf der Hybridisierung von hausgemachten, gestaltete Gegenstrang DNA-Oligonukleotid Sonden spezifisch für diese LncRNA in einem entsprechend festen Gewebe oder Zell-Linie, ermöglicht es effizient die Erfassung aller RNA-Ziele von der LncRNA.

RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Doppelsträngige RNA produziert während der RNA-Virus-Replikation man Muster Anerkennung Rezeptoren erkennt an eine angeborene Immunantwort zu induzieren. Für negativ-Sense-RNA-Viren bleibt die Interaktion zwischen dem Low-Level-DsRNA und PRRs unklar. Wir haben eine Methode konfokalen Mikroskopie Arenavirus DsRNA und PRR in einzelnen Zellen visualisieren entwickelt.

Konfokale Abbildung von Double-Stranded RNA und Muster Anerkennung Rezeptoren im negativen Sinn-RNA-Virusinfektion

Sequenzspezifität ist entscheidend für die Genregulation. Regulatorische Proteine, die bestimmte Sequenzen erkennen, sind wichtig für die Genregulation. Die Definition funktioneller Bindungsstellen für solche Proteine ist ein schwieriges biologisches Problem. Ein iterativer Ansatz zur Identifizierung einer Bindungsstelle für ein RNA-bindendes Protein wird hier beschrieben und ist auf alle RNA-bindenden Proteine anwendbar.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

MALDI-TOF wurde verwendet, um Fragmente zu charakterisieren, die aus der Reaktivität zwischen oxidierter RNA und der Exoribonuklease Xrn-1 erhalten wurden. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methodik, die auf andere Prozesse mit RNA und/oder DNA angewendet werden kann.

Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Oligonukleotid-5′-Triphosphate sind allgegenwärtige Bestandteile in essentiellen biologischen Signalwegen und werden zunehmend in biotechnologischen Anwendungen eingesetzt. Hier beschreiben wir Techniken zur routinemäßigen Synthese und Aufreinigung von Oligonukleotid-5′-Triphosphaten, ausgehend von Oligonukleotiden, die durch automatisierte Standardsynthesetechniken hergestellt werden.

Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Die DNAzyme-basierten Nanomaschinen können für den hochselektiven und sensitiven Nachweis von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für das Design von DNAzym-basierten Nanomaschinen mit einem 10-23-Kern unter Verwendung freier Software und deren Anwendung am Beispiel der Detektion eines Epstein-Barr-Virusfragments.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Lernen Sie die Erkennung von Doppelstrang-RNA durch chemisch modifizierte Peptid-Nukleinsäuren. Diese Methode ermöglicht gezielte RNA-Strukturanalyse für die RNA-chemische Biologie.

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren (Video) | JoVE Journal

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Weitere Videos entdecken