Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Das übergeordnete Ziel dieses Methodenartikels ist es, die detaillierten Protokolle vorzustellen, die von unserem Labor zur Untersuchung der molekularen Erkennung von doppelsträngigen RNAs durch chemisch modifizierte Peptidnukleinsäuren verwendet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der chemischen RNA-Biologie zu beantworten, wie z. B. den Nachweis und das Targeting von RNA-Strukturen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Designprinzipien auf das Targeting beliebiger RNA-Duplexstrukturen anwendbar sind.

Das Verfahren wird von Desiree Toh, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin aus meinem Labor, vorgeführt. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie vier Mikroliter einer 35%igen Glycerinlösung zu zuvor vorbereiteten RNA-PNA-Proben hinzu und mischen Sie vorsichtig. Geben Sie mit einer Mikropipette und Gelladespitzen vorsichtig 20 Mikroliter jeder Probe in ein zuvor vorbereitetes Polyacrylamid-Gel und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen.

Lassen Sie das Gel fünf Stunden lang bei einer konstanten Spannung von 250 Volt laufen. Schalten Sie nach fünf Stunden die Stromversorgung aus und entfernen Sie die Glasplatte vom Gelständer. Entfernen Sie dann das Gel-Dichtband und zerlegen Sie die Glasplatte.

Nehmen Sie das Gel vorsichtig aus der Glasplatte und geben Sie es in einen Behälter, der mit 350 Millilitern entionisiertem Wasser gefüllt ist. Geben Sie vorsichtig 35 Mikroliter Ethidiumbromid in den Behälter und stellen Sie ihn 30 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit auf den Plattformschüttler. Nach der Entsorgung der Ethidiumbromidlösung spülen Sie das Gel mit 1,5 bis zwei Litern destilliertem Wasser aus.

Scannen Sie dann das Gel mit einem Imager mit einem grünen Laser von 532 Nanometern und dem auf 610 Nanometer eingestellten Emissionsfilter. Quantifizieren Sie die Intensitäten der Gelbanden mit kostenloser Software. Übertragen Sie die entsprechende Menge an 2-Aminopurin-markierter doppelsträngiger RNA in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Konzentrieren Sie dann die RNA-Lösungen mit einem Vakuumkonzentrator. Als nächstes werden die entsprechenden Volumina des Ziel-PNA für verschiedene Konzentrationen aus dem zuvor vorbereiteten Hauptmaterial in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen. Konzentrieren Sie die PNA-Lösungen mit dem Vakuumkonzentrator.

Geben Sie 975 Mikroliter Inkubationspuffer in das Röhrchen mit der getrockneten RNA und mischen Sie gründlich, um sicherzustellen, dass die gesamte RNA aufgelöst ist. Nachdem Sie die RNA-Lösung kurz zentrifugiert haben, glühen Sie sie, indem Sie das Röhrchen 10 Minuten lang in einen vorgeheizten Heizblock legen. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie den Heizblock aus und lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen.

Geben Sie 75 Mikroliter RNA in jedes der Röhrchen mit dem getrockneten PNA und mischen Sie es gründlich. Nachdem Sie die Proben mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur gelagert haben, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie nun die entsprechenden Mengen an 2-Aminopurin-markierter einzelsträngiger RNA in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Übertragen Sie die entsprechenden Volumina des Ziel-PNA für verschiedene Konzentrationen aus dem Hauptstamm in die entsprechenden Röhrchen, die die einzelsträngige RNA enthalten. Nach dem Trocknen der Proben 75 Mikroliter Inkubationspuffer in jedes der Röhrchen geben und gründlich mischen. Jede Probe wird geglüht, indem jedes Röhrchen 10 Minuten lang in einen vorgeheizten Heizblock gelegt wird.

Nachdem Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen ließen, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend werden 70 Mikroliter jeder Probe in eine einen Zentimeter große Küvette überführt. Legen Sie die Küvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer und messen Sie die Emission über einen Wellenlängenbereich von 330 bis 550 Nanometern.

Sobald die Messung abgeschlossen ist, entfernen Sie den Puffer von der Küvette. Spülen Sie die Küvette mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie mit Stickstoffgas ab. Nachdem Sie die Messung für alle Proben wiederholt haben, stellen Sie die Fluoreszenzintensität gegen die Wellenlänge dar.

Übertragen Sie die entsprechenden Mengen einzelsträngiger RNA in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie dann die entsprechenden Volumina des Ziel-PNA aus dem Hauptstamm in die entsprechenden Röhrchen, die die einzelsträngige RNA enthalten. Nach dem Trocknen der Proben geben Sie 130 Mikroliter Inkubationspuffer in jedes der Röhrchen und mischen Sie gründlich.

Jede Probe wird geglüht, indem jedes Röhrchen 10 Minuten lang in einen vorgeheizten Heizblock gelegt wird. Nachdem Sie die Proben auf Raumtemperatur abkühlen ließen, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie nun 130 Mikroliter jeder Probe in eine Küvette mit acht Mikrozellen, wobei eine Zelle Inkubationspuffer enthält.

Messen Sie mit einem UV-Vis-Spektralphotometer die Absorption jeder Probe bei 260 Nanometern. Messen Sie bei steigender Temperatur von 15 auf 95 Grad Celsius, gefolgt von abnehmender Temperatur von 95 auf 15 Grad Celsius mit einer Rampengeschwindigkeit von 0,5 Grad Celsius pro Minute. PNA-Oligomere wurden nach zwei Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigungen erhalten.

Die Identität der PNAs kann durch eine MALDI/TOF-Analyse bestätigt werden. Die nicht-denaturierenden PAGE-Daten deuten darauf hin, dass die Q- und L-modifizierte PNA nur die doppelsträngige RNA-Region mit einem C-G-Paar erkennen kann. Diese spezifische und verbesserte Erkennung erfolgt durch die T-A-U-L-G-C und die Q-C-G PNA RNA zwei basierten Triple-Formationen.

Eine Studie zur 2-Aminopurin-Fluoreszenztitration zeigte, dass eine Q and L-modifizierte PNA an eine gezielte doppelsträngige RNA, aber nicht an eine einzelsträngige RNA bindet. PNAs, die Q-Reste enthalten, zeigen keine thermischen Schmelzübergänge, was auf eine fehlende Bindung an einzelsträngige RNA aufgrund des sterischen Zusammenstoßes im Watson-Watson-Crick-ähnlichen Q-G-Paar hindeutet. Im Vergleich zu unmodifiziertem PNA P1 zeigen die PNAs P4 und P5, die L-Reste enthalten, eine niedrigere Schmelztemperatur für die entsprechenden RNA-PNA-Duplexe, was auf den sterischen Zusammenstoß im Watson-Crick-ähnlichen L-G-Paar zurückzuführen ist.

Die gemessenen thermischen Schmelzdaten der UV-Absorption stimmen mit den Daten der 2-Aminopurin-Fluoreszenztitration überein, die auch zeigen, dass eine PNA, die Q- und L-Reste enthält, nicht stark an einzelsträngige RNA bindet. Die Einbeziehung einer Q-Basis ist destabilisierender als eine L-Basis, da eine Q-Basis einen signifikanteren sterischen Zusammenstoß bei der Bildung eines Watson-Crick-ähnlichen Q-G-Paares hat. Einmal gemeistert, können die verschiedenen Experimente in einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie das Sondieren und Targeting von RNA-Strukturen in Zellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. ob wir RNA-Strukturen nachweisen und die RNA-Funktionen durch die Verwendung von doppelsträngigen RNA-bindenden PNAs regulieren können. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie und -Krankheit, um die auf RNA-Struktur ausgerichtete therapeutische Entwicklung zu erforschen.