Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Das übergeordnete Ziel dieses Methodenartikels ist es, die detaillierten Protokolle vorzustellen, die unser Labor zur Untersuchung der molekularen Erkennung doppelsträngiger RNAs durch chemisch modifizierte Peptid-Nukleinsäuren verwendet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der RNA-Chemischen Biologie zu beantworten, beispielsweise die Detektion und gezielte Ansteuerung von RNA-Strukturen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Designprinzipien auf die gezielte Ansteuerung beliebiger RNA-Duplexstrukturen übertragbar sind.

Die Durchführung des Verfahrens übernimmt Desiree Toh, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie vier µL einer 35 %igen Glycerinlösung zu zuvor vorbereiteten RNA-PNA-Proben hinzufügen und vorsichtig mischen. Geben Sie mithilfe einer Mikropipette und Gel-Ladespitzen vorsichtig je 20 µL jeder Probe auf ein zuvor vorbereitetes Polyacrylamidgel, und achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuschließen.

Führen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 250 Volt fünf Stunden lang laufen. Nach fünf Stunden schalten Sie die Stromversorgung aus und nehmen die Glasplatte vom Gel-Apparat ab. Entfernen Sie anschließend das Dichtungsband des Gels und zerlegen Sie die Glasplatte.

Entfernen Sie das Gel vorsichtig von der Glasplatte und legen Sie es in einen Behälter, der mit 350 Millilitern deionisiertem Wasser gefüllt ist. Geben Sie vorsichtig 35 Mikroliter Bromidethidium zum Behälter hinzu und stellen Sie diesen für 30 Minuten auf den Plattenschüttler mit niedriger Geschwindigkeit. Nachdem Sie die Bromidethidium-Lösung entsorgt haben, spülen Sie das Gel mit 1,5 bis zwei Litern destilliertem Wasser ab.

Scannen Sie dann das Gel mit einem Imaging-System, das über einen grünen Laser von 532 Nanometern verfügt und einen Emissionsfilter bei 610 Nanometern verwendet. Quantifizieren Sie die Bandenintensitäten im Gel mithilfe einer kostenlosen Software. Überführen Sie die geeignete Menge an mit 2-Aminopurin markierter doppelsträngiger RNA in ein sauberes 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Anschließend die RNA-Lösungen mit einem Vakuumkonzentrator eindampfen. Danach die geeigneten Volumina der gezielten PNA für verschiedene Konzentrationen aus dem zuvor hergestellten Hauptansatz in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Die PNA-Lösungen anschließend mittels des Vakuumkonzentrators eindampfen.

Fügen Sie 975 Mikroliter Inkubationspuffer zu dem Röhrchen mit der getrockneten RNA hinzu und mischen Sie gründlich, um sicherzustellen, dass die gesamte RNA gelöst ist. Nach einer kurzen Zentrifugation der RNA-Lösung führen Sie eine Annealing-Behandlung durch, indem Sie das Röhrchen für 10 Minuten in einen vorgeheizten Wärmeblock stellen. Schalten Sie anschließend den Wärmeblock aus und lassen Sie die Probe auf Raumtemperatur abkühlen.

Fügen Sie 75 Mikroliter RNA zu jedem der Röhrchen mit dem getrockneten PNA hinzu und mischen Sie gründlich. Nachdem die Proben mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen wurden, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Überführen Sie nun die entsprechenden Mengen an 2-Aminopurin-markierter einzelsträngiger RNA in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Überführen Sie die geeigneten Volumina der gezielten PNA für verschiedene Konzentrationen aus dem Hauptansatz in die jeweiligen Röhrchen mit einzelsträngiger RNA. Nach dem Trocknen der Proben geben Sie 75 Mikroliter Inkubationspuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen gründlich. Führen Sie für jede Probe eine Annealing-Behandlung durch, indem Sie jedes Röhrchen 10 Minuten lang in einen vorgewärmten Heizblock stellen.

Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Danach überführen Sie 70 Mikroliter jeder Probe in eine quadratische Küvette mit einem Zentimeter Lichtweg. Stellen Sie die Küvette in ein Fluoreszenzspektrophotometer und messen Sie die Emission im Wellenlängenbereich von 330 bis 550 Nanometern.

Nach Abschluss der Messung den Puffer aus der Küvette entfernen. Die Küvette mit destilliertem Wasser spülen und mit Stickstoffgas trocknen. Nach Wiederholung der Messung für alle Proben die Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Wellenlänge auftragen.

Überführen Sie die entsprechenden Mengen an einzelsträngiger RNA in separate 1,5-Milliliter-Röhrchen. Anschließend pipettieren Sie die entsprechenden Volumina der gezielten PNA aus dem Hauptansatz in die jeweiligen Röhrchen mit der einzelsträngigen RNA. Nach dem Trocknen der Proben geben Sie 130 Mikroliter Inkubationspuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen gründlich.

Unterziehen Sie jede Probe einem Annealing, indem Sie jedes Röhrchen für 10 Minuten in einen vorgewärmten Heizblock geben. Nachdem die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Überführen Sie nun 130 Mikroliter jeder Probe in eine Acht-Mikrozelle-Küvette, wobei eine Zelle Inkubationspuffer enthält.

Unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrophotometers die Absorption jedes Proben bei 260 Nanometern messen. Die Messung bei steigender Temperatur von 15 auf 95 Grad Celsius und anschließend bei fallender Temperatur von 95 auf 15 Grad Celsius mit einer Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit von 0,5 Grad Celsius pro Minute durchführen. PNA-Oligomere wurden nach zwei Reinstufen mittels umgekehrter Phasen-HPLC erhalten.

Die Identität der PNA kann mittels MALDI/TOF-Analyse bestätigt werden. Die Daten der nichtdenaturierenden PAGE deuten darauf hin, dass die mit Q und L modifizierte PNA ausschließlich die doppelsträngige RNA-Region mit einem C-G-Paar erkennen kann. Diese spezifische und verstärkte Erkennung erfolgt durch die Bildung zweier Basentripel: T-A-U-L-G-C und Q-C-G zwischen PNA und RNA.

Eine Fluoreszenz-Titrationsstudie mit 2-Aminopurin zeigte, dass ein mit Q und L modifiziertes PNA an eine gezielte doppelsträngige RNA bindet, jedoch nicht an einzelsträngige RNA. PNAs, die Q-Reste enthalten, zeigen keine thermischen Schmelzübergänge, was auf einen fehlenden Bindungsvorgang an einzelsträngige RNA aufgrund des sterischen Konflikts im Watson-Crick-ähnlichen Q-G-Paar hindeutet. Im Vergleich zu unmodifiziertem PNA P1 weisen die PNAs P4 und P5, die L-Reste enthalten, eine niedrigere Schmelztemperatur für die entsprechenden RNA-PNA-Duplexe auf, bedingt durch den sterischen Konflikt im Watson-Crick-ähnlichen L-G-Paar.

Die mittels UV-Absorption erfassten thermischen Schmelzdaten stimmen mit den 2-Aminopurin-Fluoreszenz-Titrationsdaten überein, die ebenfalls zeigen, dass ein PNA, das Q- und L-Reste enthält, nicht stark an einzelsträngige RNA bindet. Die Einbindung einer Q-Base ist stärker destabilisierend als die einer L-Base, da die Q-Base beim Ausbilden eines Watson-Crick-ähnlichen Q-G-Paares einen stärkeren sterischen Hinderungsgrund aufweist. Wenn die Methoden einmal beherrscht sind, können die verschiedenen Experimente innerhalb einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden.

Nach dieser Methode können weitere Verfahren wie die Untersuchung und gezielte Ansteuerung von RNA-Strukturen in Zellen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob wir RNA-Strukturen nachweisen und die Funktionen von RNA mithilfe doppelsträngig bindender RNA-PNAs regulieren können. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der RNA-Biologie und der Krankheitsforschung den Weg, therapeutische Ansätze zu entwickeln, die gezielt auf die Struktur von RNA abzielen.