Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Das Protokoll wird zur Sättigungsmutagenese einer Proteinbindungsstelle verwendet. Wenn Ihre Proteinbindungsstelle nicht bekannt ist, kann sie mit diesem Protokoll identifiziert werden. Die Technik ist für die Krankheitsdiagnose und -therapie relevant.

Ich glaube, dass sein volles Potenzial in den biomedizinischen Wissenschaften noch voll ausgeschöpft werden muss. Diese Methode kann weit auf jedes Protein oder jede Reaktion angewendet werden, bei der gewünschte Moleküle von unerwünschten Molekülen getrennt werden können. Stellen Sie sicher, dass die Bibliothek richtig randomisiert ist, und stellen Sie sicher, dass bei jedem Bindungs- und Trennschritt die Anreicherung der gewünschten Moleküle hoch ist.

Es umfasst mehrere Schritte und viele Details, die besser demonstriert werden, als in Worten erklärt. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie sich damit vertraut machen, wie Sie eine zufällige Bibliothek vorbereiten, einen beginnenden RNA-Pool synthetisieren und eine Bindungsreaktion auf separate gewünschte und unerwünschte Moleküle durchführen, um eine hohe Affinität und spezifische Bindemittel zu erhalten. Synthetisieren Sie zunächst den Vorwärtsprimer und den Reverse Primer durch chemische Synthese auf einem DNA-Synthesizer.

Synthetisieren Sie auch eine zufällige Bibliothek Oligonukleotid-Vorlage mit 31 randomisierten Positionen. Mischen Sie in einer PCR-Röhre eine mikromolare DNA-Zufallsbibliotheksvorlage, einmikromolarer Vorwärtsprimer mit T7-RNA-Polymerase-Promotor und Reverseprimer, 20-Millimolar-Tris bei pH-Wert acht, 1,5-Millimolar-Magnesiumchlorid, 50-Millimolar-Kaliumchlorid, 1-Mikrogramm pro Milliliter acetyliertes Rinderserumalbumin, zwei Einheiten Taqpolymerase und 200 Mikromolar-Kaliumchlorid, je 1 Mikrogramm pro Milliliter-Acetylat-Serumalbumin, zwei Einheiten Taqpolymerase und 200 Mikromolar-Kaliumchlorid. Richten Sie die PCR-Maschine mit fünf Zyklen denaturieration, glühenund, gefolgt von einem Erweiterungszyklus, um den Promotor an die DNA-Bibliothek anzuhängen.

Richten Sie eine 100-Mikroliter-Transkriptionsreaktion ein, die T7-Transkriptionspuffer, einMikromolar-Zufallsbibliothekspool-DNA, Fünf-Millimolar-DTT, zwei Millimolar-GTP, je ein Millimolar VON ATP, CTP und UTP sowie zwei Einheiten pro Mikroliter-T7-RNA-Polymerase pro Mikroliter enthält. Legen Sie nun ein Acrylglasschild und Handschuhe an. Einführung von Radioaktivität durch Zugabe von 5 Mikrolitern oder weniger alpha-32P UTP in die Transkriptionsreaktion für die Autoradiographie.

Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch in einem Mikrozentrifugenrohr für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Um die RNA zu gelreinigen, bereiten Sie ein 10%denaturierendes Polyacrylamid-Gel vor. Proben in die Brunnen des Gels laden.

Setzen Sie das Gel einem Röntgenfilm aus, und identifizieren Sie die Position der Transkripte auf dem Gel und schneiden Sie die Gelscheibe aus. Die Gelscheibe in ein Zentrifugenrohr geben und mit einer Homogenisatorspitze in kleinere Stücke brechen. Fügen Sie Proteinase K Puffer hinzu, um die Gelstücke einzutauchen.

Lassen Sie das Rohr mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Nutator. Drehen Sie dann in einer Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um den Gelschutt zu entfernen und die Pufferlösung wiederherzustellen. Fügen Sie mit dem Überstand, dem Wirbel und der Zentrifuge ein gleiches Volumen Phenol-Chlorform in die Röhre.

Wiederholen Sie die Extraktion mit Phenol-Chloroform noch einmal und dann mit Chloroform ein anderes Mal. Als nächstes mischen Sie die wässrige Phase des Proteinase-K-Puffers mit 1/10 Volumen von dreimolarem Natriumacetat bei pH 5,2, 10 Mikrogramm tRNA oder 20 Mikrogramm Glykogen und zwei bis drei Mengen Ethanol bei minus 20 Grad Celsius. Lassen Sie die Röhre bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde.

Drehen Sie das Rohr mit der Lösung für fünf bis zehn Minuten bei vier Grad Celsius in einer Mikrozentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie 70% Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu spülen. Drehen Sie für zwei bis fünf Minuten.

Das Ethanol vorsichtig ansaugen und das RNA-Pellet lufttrocknen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter Wasser, das mit DEPC behandelt wird, hinzu, um das RNA-Pellet zu sonlubilisieren. Lassen Sie die Probe bei minus 20 Grad Celsius zur Lagerung.

Um Protein und RNA in einem Reaktionsvolumen von 100 Mikrolitern zu binden, bereiten Sie zunächst 10-Millimolar Tris-Hydrochlorid bei pH 7,5 vor, das 50-Millimolar-Kaliumchlorid, Einmillimolar-DTT, 09-Mikrogramm-pro-Mikroliter Rinderserumalbumin, 5-Einheiten pro Mikroliter RNAsin, 15-Mikrogramm-pro-Mikroliter-TRNA und ein-Milligramm-EDTA-Liter enthält. Dann fügen Sie 30 Mikroliter rekombinantes Protein PTB und 10 Mikroliter RNA aus dem entsprechenden Pool hinzu. Die Rohre mit den Bindungsreaktionen etwa 30 Minuten bei 25 Grad Celsius in einen Temperaturblock legen.

Als nächstes fraktionieren Sie die gebundene RNA aus der ungebundenen RNA durch vier Runden der Selektion und Verstärkung. Filtern Sie zunächst die 100-Mikroliter-Probe bei Raumtemperatur durch einen Nitrozellulosefilter, der an einem Vakuumkrümmer befestigt ist. Der RNA-Protein-Komplex verbleibt auf dem Filter.

Mit einer sterilen Rasierklinge den Filter in Fragmente hacken und in ein Zentrifugenrohr geben. Tauchen Sie die Filterstücke in den Proteinase-K-Puffer ein und legen Sie sie mindestens drei Stunden oder über Nacht auf einen Becher, um die RNA zurückzugewinnen. Um die RNA-Probe zu deproteinisieren, fügen Sie ein gleiches Volumen an Phenol-Chlorform, Wirbel und dann Zentrifugieren mit hoher Geschwindigkeit für fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzu.

Erhalten Sie die wässrige Phase, und extrahieren Sie mit Chloroform wieder. Danach den Überstand mit 1/10 Volumen von dreimolarem Natriumacetat bei pH 5,2 und zwei bis drei Volumen absolutem Ethanol mischen. Lassen Sie das Rohr in einem minus 80-Grad-Gefrierschrank für 30 Minuten, und zentrifugieren Sie es dann mit hoher Geschwindigkeit für 10 Minuten.

Wiederholen Sie die Wasch- und Trocknungsschritte mit 70% Ethanol und lassen Sie die RNA in DEPC-behandeltem Wasser auflösen. Führen Sie nach der ersten Runde des Filterbindungstestes drei weitere Runden durch. Als Nächstes führen Sie zwei Runden Transkription, Bindung und Verstärkung durch, um die proteingebundenen RNA-Fraktionen von den ungebundenen Fraktionen zu trennen.

Vorguss eines nativen 5%polyacrylamidgel mit 60-zu-eins Acrylamid-bis-Acrylamid-Verhältnis im 5x TBE Puffer. Richten Sie dann die RNA-Protein-Bindungsreaktion ein. Legen Sie das Gel in ein Elektrophoresegerät, das mit einem 5x TBE Puffer gefüllt ist, in einem kalten Raum bei vier Grad Celsius.

Tragen Sie 250 Volt für 15 Minuten auf und pipette die Bindungsreaktion in verschiedene Brunnen. Dann die gebundene RNA weiter aus der ungebundenen RNA fraktionieren, indem die Elektrophorese ein bis zwei Stunden lang bei 250 Volt betrieben wird. Als Nächstes setzen Sie das Gel einem Röntgenfilm aus, und identifizieren Sie die Position der gebundenen RNA mithilfe der Autoradiographie.

Schneiden Sie die Gelscheibe mit der gebundenen RNA aus und legen Sie sie in eine Röhre ein. Die Gelscheibe zerkleinern und drei Stunden oder über Nacht in den Proteinase-K-Puffer eintauchen. Wiederholen Sie die Extraktion mit Phenol-Chloroform und Chloroform wie zuvor beschrieben.

Synthetisieren Sie cDNA aus der gelösten RNA. Bereiten Sie 20 Mikroliter Reaktion vor, darunter zwei Mikroliter 10x RT Puffer, zwei Mikroliter AMV-Reverse-Transkriptase, ein Mikroliter Reverse Primer, fünf Mikroliter Wasser und 10 Mikroliter der gelösten RNA. Bei 42 Grad Celsius 60 Minuten inkubieren.

Verstärken Sie die cDNA mit 20 bis 25 PCR-Zyklen, wie zuvor beschrieben. Wiederholen Sie den Prozess der RNA-Synthese, Proteinbindung und Trennung von proteingebundenen und ungebundenen Fraktionen. Um die Proteinbindung zu analysieren, verwenden Sie den Gel-Mobilitäts-Shift-Assay oder den Filterbindungstest, um Bindungsaffinität und Spezifität für ausgewählte Pools oder einzelne Sequenzen innerhalb jedes Pools zu bestimmen.

Verwenden Sie Autoradiographie oder einen Phosphor-Imager, um Bänder im gebundenen und ungebundenen Bruch zu erkennen und zu quantifizieren. Setzen Sie das Protokoll mit klonendem und Sequenzausrichtung fort. In dieser Studie wurde eine erfolgreiche Selektionsverstärkung erreicht.

Das Säugetier-Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein mit 300-fach höherer Proteinkonzentration zeigt kaum nachweisbare Bindung an die Pool-Null-Sequenz, aber eine hohe Affinität für den ausgewählten Sequenzpool. Selection-Amplifikation erfolgreich identifiziert auf RNA-bindenden Proteinen mit bevorzugter oder Konsensbindungsstelle. Die Zugabe der rekombinanten PTB, die an eine vorgelagerte Drei-Prime-Spleißstelle bindet, führt zur Aktivierung der alternativen oder nachgelagerten Drei-Prime-Spleißstelle.

Im Gegensatz dazu führt die Zugabe von rekombinantem hnRNP C zur Unterdrückung der beiden Drei-Prim-Spleiß-Standorte. Die Zugabe des rekombinanten allgemeinen Spleißfaktors U2AF65 umgekehrt die hnRNP C-vermittelte Drei-Prime-Spleiß-Site-Repression. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine gute randomisierte Bibliothek und die richtigen Bindungsbedingungen, die bei jedem Bindungsschritt eine hohe Faltenanreicherung bieten, für den Erfolg notwendig sind.

Geeignete funktionelle Assays und In-vivo-Tests können verwendet werden, um das Ergebnis dieses Ansatzes zu validieren. Im Bereich der Genexpression wurden mit dieser Technik Funktionen zahlreicher Proteine untersucht. Es ist wichtig, Handschuhe und radioaktive Dichtung zum Schutz zu verwenden, während Sie mit Polyacrylamid und Radioaktivität arbeiten.