Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

L'obiettivo generale di questo metodo è la rilevazione di depositi di aggregati proteici sia in ambito clinico che scientifico. Viene descritta la colorazione con acido acetico epta, formil tiofene, e l'analisi di tessuti da modelli animali di malattia da prioni e morbo di Alzheimer. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'amiloide, come la presenza di piccole quantità di aggregati proteici e le loro variazioni conformazionali intrinseche.

Il vantaggio di questa tecnica è che è più selettiva e più sensibile rispetto ad altre tecniche convenzionali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di varie malattie da misfolding proteico a causa della possibilità di adattare le sonde alla tecnica di visualizzazione desiderata. In generale, le persone che non conoscono questo metodo hanno difficoltà perché l'hFTAA richiede una concentrazione di colorazione così bassa.

L'HFTAA mostra anche una lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione più lunga rispetto ai coloranti convenzionali. Preparare la soluzione luminescente di oligotiofene coniugato risospendendo l'hFTAA liofilizzato in due millimolari di idrossido di sodio per preparare una soluzione madre di un milligrammo per millilitro. Trasferire la soluzione madre in un flaconcino di vetro e conservare a quattro gradi Celsius.

Se si utilizzano sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina, deparaffinare in xilene durante la notte. Il giorno della colorazione, immergere le sezioni in bagni consecutivi di etanolo al 99%, etanolo al 70%, dH2O e PBS per dieci minuti ogni volta. Quindi, lasciare asciugare le sezioni di tessuto in condizioni ambientali.

Mentre il tessuto si asciuga, preparare una soluzione di lavoro di hFTAA diluendo il brodo da uno a 10.000 in PBS. Quando il tessuto è asciutto, aggiungere goccioline della soluzione di lavoro hFTAA a ciascuna sezione di tessuto per coprirla. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

Risciacquare la soluzione colorante con 500 microlitri di PBS e quindi immergere il vetrino nel bagno PBS per 10 minuti. Dopo aver lasciato asciugare la sezione in condizioni ambientali, montare utilizzando un mezzo di montaggio a fluorescenza. Lasciare che il supporto di montaggio si stabilizzi durante la notte.

Il rilevamento dell'amiloide può essere eseguito direttamente dopo il montaggio o anche senza montaggio. Tuttavia, se l'obiettivo dell'esperimento è raccogliere informazioni spettrali di alta qualità, è preferibile l'incubazione notturna. Aprire il software del microscopio, assegnare un nome al progetto, selezionare l'immagine spettrale e avviare l'acquisizione.

Seleziona l'oggetto di interesse attraverso l'oculare utilizzando il filtro di eccitazione a 436 nanometri e sposta il percorso della luce verso la fotocamera. Nel gestore dati del caso, selezionare il tipo di campione spettrale, etichettare il campione e premere acquisisci. Si aprirà la finestra di acquisizione.

In Imaging spettrale, aprire il menu delle impostazioni, selezionare le proprietà di acquisizione e impostare l'intervallo spettrale da 460 a 700, la qualità della velocità alla massima velocità e il tipo di misurazione per gassare i filtri stretti del laser. Chiudi la finestra di dialogo. Nel menu immagine, selezionare live completo.

Nella barra dell'icona, disattiva le frange. Seleziona un'area di cui creare l'immagine e assicurati che il valore di memoria di picco sia inferiore a 800 megabyte. Impostare il tempo di esposizione su un valore che fornisca una luminosità totale dell'immagine compresa tra 1.000 e 3.000.

Nella barra dell'icona, premi la fotocamera colorata. L'acquisizione avrà inizio. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, premere Salva nella finestra di dialogo Acquisisci immagine spettrale e Nuova cella nella finestra di dialogo Gestione dati del caso.

Dal gestore dati del caso, aprire l'immagine raccolta utilizzando il pulsante Avvia analisi. Si aprirà la finestra di analisi dei dati. Le informazioni spettrali possono essere raccolte da ogni pixel dell'immagine selezionando le ROI utilizzando la finestra di dialogo di visualizzazione spettrale.

Scegli Definisci e seleziona le ROI dalle aree pertinenti dell'immagine. Salvate i dati spettrali come file di testo utilizzando il pulsante Lib. Il file txt salvato può essere importato in qualsiasi software di analisi di sua scelta.

Apri il software del microscopio e inizia configurando il microscopio confocale. Imposta l'intensità del laser su 0,2%, il foro stenopeico su un'unità Airy, la dimensione del fotogramma su 1, 024 per 1, 024 pixel, la velocità di scansione come sette in media su 16 scansioni e la profondità di bit su otto bit. Per raccogliere lo spettro di emissione, selezionare la modalità lambda e il laser ad argon impostato su 488 nanometri.

Raccogli l'emissione tra 499 e 691 nanometri utilizzando 22 canali nel rivelatore di gasp a 32 canali. Impostate il guadagno su 755. Fare clic sul pulsante live e modificare la tavolozza in un indicatore di intervallo e regolare il guadagno per consentire pixel rossi non sovraccarichi.

Fare clic sul pulsante di arresto e quindi acquisire l'immagine con il pulsante a scatto. Per ottenere immagini a canale singolo, selezionare l'opzione di configurazione intelligente. Seleziona FITC e Alexa 532.

Selezionare l'unmixing lineare e applicare. Regolate il guadagno per consentire l'assenza di pixel sovraccarichi. Per FITC, imposta il guadagno su 693 e per Alexa 532, imposta il guadagno su 433 durante la modalità live.

Fare clic sul pulsante di arresto e quindi acquisire l'immagine con il pulsante a scatto. Impostare il microscopio in modalità FLIM. Imposta il foro stenopeico su 20, la lunghezza d'onda di eccitazione su 490 nanometri e l'intensità del laser su 0,5%Utilizza laser pulsati a 40 megahertz.

Nel software FLIM, impostare il conteggio dei fotoni oltre i 550 nanometri. Nella finestra dei parametri di visualizzazione, seguire il conteggio dei fotoni fino a quando il conteggio massimo è di circa 4.000 conteggi di fotoni. Salvare il file ed esportarlo come immagine SPC.

Questa immagine mostra i corpi di Mallory-Denk costituiti da aggregati di cheratina negli epatociti epatici controcolorati con DAPI. Qui, le inclusioni positive per P62 sono mostrate nel tessuto muscolare scheletrico sporadico del corpo di inclusione. Questa immagine mostra un'inclusione amiloide del polipeptide amiloide delle isole nel pancreas umano.

Qui viene mostrato un deposito amiloide di catene leggere di immunoglobuline nell'intestino umano. Questa immagine mostra depositi di aggregati di proteine priotiche di scrapie ovina nel cervello di topo. Qui sono mostrati gli aggregati di proteine prioniche in un cervello di topo infettato con la malattia del dimagrimento cronico.

Questa immagine mostra placche di amiloide-A-beta nel cervello di topo APP23. E questa immagine mostra la patologia A-beta nel cervello del topo APP-PS1. Questi strisci di biopsia grassa da campioni diagnostici di amiloide da transtiretina in pazienti umani sono stati classificati da uno a quattro in base al punteggio standard Congo Red.

Le aree gialle mostrano depositi di amiloide transtiretina colorati con hFTAA e il blu è l'autofluorescenza dal tessuto adiposo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di colorare a una concentrazione sufficientemente bassa. Ricorda inoltre di utilizzare filtri passa-lungo per ottenere il massimo contrasto ed evitare anche l'autofluorescenza e la fluorescenza con colorazione di fondo.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza per identificare la proteina aggregata e per identificare le proteine coaggregate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'amiloidosi per esplorare le strutture degli aggregati proteici e alla chimica organica per progettare nuove sonde per questi bersagli. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la colorazione LCO per l'imaging ciascuno con tecniche diverse.