Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zika-Virusinfektion im sich entwickelnden menschlichen Gehirn unter Verwendung von aus Stammzellen gewonnenen zerebralen Organoiden zu modellieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Biologie zu beantworten, z. B. welche Zellen infiziert werden können und welche Proteine am Infektionsweg beteiligt sind. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie eine frühe Infektion des Menschen nachahmt, in Hochdurchsatz-Assays eingesetzt werden kann und mit gezielten genetischen Techniken wie CRISPR kombiniert werden kann.

Diese Methode kann Einblicke in den Mechanismus der Zika-Virusinfektion geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Wirkstoffscreenings und Viruspseudotypisierung angewendet werden. Bringen Sie die Kulturen mit regelmäßigen Methoden zur Stammzellerhaltung auf einen Konfluenz zwischen 50 % und 70 %.

Untersuchen Sie die Kulturen mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie bei 10- bis 20-facher Vergrößerung und stellen Sie sicher, dass das Volk eine gesunde Morphologie ohne nachweisbare Differenzierung aufweist. Bringen Sie das Xeno-freie Stammzellerhaltungsmedium in einem heißen Wasserbad auf 37 Grad Celsius und tauen Sie zwei Milliliter enzymatisches Ablösereagenz und ein 50-Mikroliter-Fläschchen des Stammgesteinsinhibitors bei Raumtemperatur auf. Bereiten Sie als Nächstes eine U-Bodenplatte mit extrem niedrigem Aufsatz, eine Mehrkanalpipette p200 und ein 25-Milliliter-Reagenzreservoir vor.

Als nächstes aliquotieren Sie 45 Milliliter des Mediums in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 45 Mikroliter des Gesteinsinhibitors hinzu und mischen Sie den Inhibitor gründlich ein, indem Sie die Mischung triterieren, gefolgt von zwei bis vier in den Versionen. Vakuumieren Sie zwei Vertiefungen einer Platte mit sechs Vertiefungen, die Stammzellen enthalten, und fügen Sie schnell einen Milliliter enzymfreies Ablösereagenz in jede Vertiefung hinzu, dann inkubieren Sie die Platte vier Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Anschließend wird die behandelte Vertiefung vakuumaspiriert und ein Milliliter enzymatisches Ablösereagenz in jede Vertiefung gegeben. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um alle aggregierten Zellen aufzubrechen.

Untersuchen Sie anschließend die Zellen unter dem Mikroskop. Wenn noch große Zellcluster sichtbar sind, inkubieren Sie die Platte für zwei weitere Minuten bei 37 Grad Celsius. Wiederholen Sie den Schritt, bis die Cluster mit bloßem Auge nicht mehr sichtbar sind.

Sobald die Zellen richtig dissoziiert sind, geben Sie einen Milliliter Xeno-freies Stammzellerhaltungsmedium in jede Vertiefung, um die Dissoziationsenzyme zu deaktivieren. Ziehen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen und entnehmen Sie ein kleines Aliquot für die Zellzählung. Zählen Sie während der Zentrifugation die Zellen und bestimmen Sie das Re-Suspensionsvolumen, das erforderlich ist, um 60.000 Zellen pro Milliliter Suspension zu erreichen.

Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und suspendieren Sie die Zellen bei 60.000 Zellen pro Milliliter in Medien, die den Gesteinsinhibitor enthalten. Mischen Sie die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig fünf bis 10 Mal, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. Geben Sie die Zellsuspension sofort in das Reagenzreservoir und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette p200, um 150 Mikroliter in jede Vertiefung einer extrem niedrigen Aufsatzplatte Ihrer unteren 96-Well-Platte zu übertragen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte eine Minute lang bei 150 x G und legen Sie die Platte dann in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Stören Sie die Platte 48 Stunden lang nicht. Bereiten Sie ab dem zweiten Tag 17 Milliliter Medium mit 17 Mikrolitern des Stammgesteinsinhibitors in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen vor.

Erwärmen Sie die Mischung in einem heißen Wasserbad auf 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Organoidplatte aus dem Inkubator und ziehen Sie mit einer Mehrkanalpipette p200 langsam 75 Mikroliter Medium von den Rändern der Vertiefungen in der ersten Reihe auf. Stoßen Sie es dann schnell wieder in die Vertiefung aus, um lose Zellen und Organoide herauszuheben.

Wiederholen Sie diesen Dispergiervorgang für jede Reihe. Warten Sie 15 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Organoide auf den Boden jeder Vertiefung gesunken sind, und saugen Sie dann langsam und vorsichtig 75 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung mit der Mehrkanalpipette p200 an und geben Sie es in ein Abfallreservoir ab. Als nächstes werden Medien, die den Gesteinsinhibitor enthalten, in ein Reagenzreservoir überführt, 150 Mikroliter Medium in jede Organoid-Vertiefung dosiert und dann die Zellen bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Erwärmen Sie 17 Milliliter frisches Kulturmedium auf 37 Grad Celsius, diesmal ohne jeglichen Gesteinsinhibitor. Wiederholen Sie mit einer Mehrkanalpipette p200, die auf 100 Mikroliter eingestellt ist, den zuvor gezeigten Dispergiervorgang und warten Sie 15 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Organoide auf den Boden ihrer Vertiefungen gesunken sind. Saugen Sie dann vorsichtig 125 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung an und ersetzen Sie es durch 150 Mikroliter erwärmtes Medium.

Legen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Bereiten Sie das Medium nach dem hier gezeigten Rezept vor und filtrieren Sie anschließend die angemischte Lösung in einem 500-Milliliter-Filter steril. Vom vierten Tag bis zur Infektion der Zellen am 24. Tag führen Sie alle zwei Tage eine regelmäßige Wartung mit neuronalem Induktionsmedium durch.

Nach dem Filtern erwärmen Sie 17 Milliliter des neuronalen Induktionsmediums auf 37 Grad Celsius und lagern den Rest bei vier Grad Celsius. Mit einer Mehrkanalpipette p200, die auf 100 Mikroliter eingestellt ist, dispergieren Sie alle Vertiefungen der Organoidplatte, wie zuvor gezeigt wurde. Warten Sie 15 Sekunden, um sicherzustellen, dass die Organoide auf den Boden ihrer Vertiefungen gesunken sind.

Aspirieren Sie vorsichtig 125 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 125 Mikroliter frisches neuronales Induktionsmedium. Wiederholen Sie dieses Meisterstück der Induktion jeden zweiten Tag, bis die Organoide für eine Zika-Virusinfektion bereit sind. Bringen Sie Earles 1x ausgewogene Salzlösung, 1x PBS und neuronales Induktionsmedium auf 37 Grad Celsius in ein heißes Wasserbad.

Als nächstes verdünnen Sie das Zika-Virus in einer bekannten Konzentration in 1x Earle-Lösung auf die Zielmultiplizität der Infektion, die typischerweise zwischen 0,1 und 10 liegt. Entfernen Sie mit einer p200-Pipette vorsichtig das gesamte Medium aus jeder Organoid-Vertiefung. Waschen Sie dann die Organoide schnell mit 200 Mikrolitern erwärmtem 1x PBS.

Beim Entfernen des Mediums aus jeder Vertiefung ist es wichtig, dass man das Organoid nicht berührt oder in die Pipette saugt. Dies kann zu irreparablen Schäden am Organoid führen. In diesem Fall ist es am besten, das Organoid zu verwerfen.

Entfernen Sie anschließend vorsichtig die restliche Flüssigkeit aus jeder Organoid-Vertiefung mit einer Einkanalpipette p200. Geben Sie dann schnell 50 Mikroliter entweder 1x Earle-Lösung für eine Scheininfektion oder Zika-Virus-Lösung in jede Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass jedes Organoid vollständig eingetaucht ist, wenn es fertig ist, und stellen Sie die Platte für zwei Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Nachdem eine Virusexposition abgeschlossen ist, waschen Sie jede Vertiefung der Organoide mit 200 Mikrolitern PBS. Lassen Sie die Organoide 15 Sekunden lang absetzen und entfernen Sie dann das PBS mit einer Einkanalpipette p200. Geben Sie zum Schluss 200 Mikroliter frisches neuronales Induktionsmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die Platte wieder in den Inkubator ein.

Die Färbung mit DAPI, Phosphovimentin, TBR2 und MAP2 kann kombiniert werden, um die kortikalen Strukturen zu zeigen, die sich innerhalb der Organoide bilden. Zu diesen Strukturen gehören die ventrikuläre Zone, die subventrikuläre Zone, die intermediäre Zone und die kortikale Platte innerhalb jeder Rosette. Die Kultivierung der Organoide bis zum Tag 108 ermöglicht es, die späteren Entwicklungsstadien zu beobachten.

Während die kortikale Schichtung bei dieser Art von Organoiden nicht so ausgeprägt ist, findet der natürliche Wechsel zur Gliogenese ähnlich wie in vivo statt. Drei Tage nach der Zika-Virus-Infektion wird ein Unterschied in der Größe der Organoide sichtbar. Das Ausmaß dieses Unterschieds hängt von der viralen Vielfalt der Infektion ab, die auf die Organoide angewendet wird.

Dieser Unterschied in der Größe der Organoide nimmt in der folgenden Woche zu, bis die infizierten Organoide auseinanderzubrechen beginnen. Nach drei Tagen kommt es auch zu einer Zunahme von Zelltrümmern in den infizierten Vertiefungen im Vergleich zu den Scheinbrunnen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sichere Laborpraktiken zu befolgen, da lebensfähige infektiöse Materialien verwendet werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunhistochemie oder RNAC durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Biologie der neuronalen Entwicklungsinfektion mit dem Zika-Virus zu beantworten.