Name: Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Array-basierte komparative genomische Hybridisierung zur effizienten Erkennung von Kopienzahlvariationen in schnellneutroneninduzierten Medicago truncatula-Mutanten. Diese Methode unterstützt Forscher bei der Untersuchung von Knöllchenentwicklung und genetischer Regulation in Leguminosen.

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Diese Arbeit wird teilweise durch einen Zuschuss von NSF Pflanzengenomforschung (IOS-1127155) finanziert.

Hinweis: Abbildung 1 zeigt die fünf Schritte für das Array CGH-Protokoll. Sie sind: 1) Vorbereitung der pflanzlichen Stoffen; (2) Isolierung von DNA-Proben von hoher Qualität; (3) Kennzeichnung und Reinigung von DNA-Proben; (4) Hybridisierung, waschen und das Scannen des gesamten Genoms Arrays; und 5) CGH Datenanalyse. M. Truncatula gesamte Genom Tiling Arrays enthalten insgesamt 971.041 einzigartige Oligo-Sonden, die Ausrichtung auf mehr als 50.000 Gene oder gen-Modelle in das Genom (siehe Tabelle der Materialien). Die einzigartige Sonden Abstand ca. alle 150 Basenpaare (bp) in exonic Regionen und 261 bp in intronischen Regionen des Genoms M. Truncatula.
 1. Vorbereitung der pflanzlichen Rohstoffen <ol><li>Scarify Wildtyp (WT; M. Truncatula cv Jemalong A17) und die FN6191 mutierten Samen mit konzentrierter Schwefelsäure für 8 min (siehe Tabelle der Materialien). Entfernen und entsorgen von Schwefelsäure zu einem flüssigen Abfallbehälter.</li>
	<li>Samen mit autoklaviert deionisiertes Wasser dreimal spülen.</li>
	<li>Oberfläche zu sterilisieren Samen mit 20 % Bleichmittel-Lösung für 10 min.</li>
	<li>Samen mit autoklaviert deionisiertes Wasser dreimal spülen.</li>
	<li>Store Samen bei 4 ° C für 3 Tage. Nach Vernalisation, transfer und Keimen der Samen im Boden für eine Woche in einer Wachstums-Kammer mit 16 h/8 h hell/dunkel-Zyklus und 150 µE/m 2/s Intensität Licht.</li>
	<li>Transplantation Sämlinge zu 1 Gallone Töpfe und wachsen sie in einem Gewächshaus mit 16 h/8 h hell/dunkel-Zyklus, 150 µE/m 2/s Lichtintensität für drei bis vier Wochen. Junges Blattproben aus den Werken für die DNA-Isolierung sammeln.</li>
</ol> 2. Isolierung von hoher Qualität DNA-Proben <ol><li>1 g junge Blattgewebe aus einer einzigen Pflanze nehmen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff sofort.</li>
	<li>Eingefrorene Blattgewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel zu feinen Pulver mahlen.</li>
	<li>Isolierung genomischen DNA mit einer DNA-Isolation kit (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Aufschwemmen gereinigte DNA-Proben in 50 µL autoklaviert Doppel entionisiertem H 2 O (DdH 2 O) oder 1 x TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).</li>
	<li>Maßnahme DNA-Konzentrationen mit einem Spektrophotometer (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Bewerten 260 nm/280 nm und 260 nm/230 nm Verhältnisse von DNA-Proben. 
	Hinweis: Sollten qualitativ hochwertige DNA-Proben haben 260 nm/280 nm Verhältnis &#8805; 1,8 und 260 nm/230 nm Verhältnis &#8805; 2.0.</li>
	<li>Weitere bewerten DNA-Proben von läuft sie in 1 % Agarose-Gele. 
	Hinweis: Qualitativ hochwertige DNA-Proben sollten hohes Molekulargewicht und sollte nicht durch RNA kontaminiert werden. Im Idealfall sollte die Endkonzentration von DNA-Proben ~ 150 ng/µL.</li>
</ol> 3. DNA-Kennzeichnung und Reinigung <ol><li>verdünnen 1 µg genomische DNA-Proben mit DdH 2 O zu einem Endvolumen von 20 µL in eine 500 µL Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Hinzufügen 5 µL eine zufällige Grundierung (siehe Tabelle der Materialien) mit dem Schlauch.</li>
	<li>Vortex den Schlauch kurz und steckte es in einem Thermocycler inkubieren und denaturieren DNA bei 98 ° C für 10 min.</li>
	<li>Nehmen Sie das Rohr aus der Thermocycler und steckte ihn sofort in Eiswasser für 5 min. Chill</li>
	<li>Bereiten zwei Kennzeichnung mischt, wie in Tabelle 1 gezeigt.</li>
	<li>Fügen Sie 25 µL des Benennens Mixe 1 und 2 auf Referenz-DNA und DNA-Probe Rohre bzw..</li>
	<li>Mischen die Kennzeichnung Mischung und die DNA durch Pipettieren dreimal und drehen Sie die Rohre kurz.</li>
	<li>Setzen die Röhren in einem Thermocycler, Inkubation bei 37 ° C für 2 h und dann bei 65 ° C für 20 min, das Exo-Klenow-Enzym zu inaktivieren (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Hinzufügen 430 µL 1 x TE-Puffer für jede Röhre.</li>
	<li>Mischen Sie den Inhalt und die Rohre kurz schleudern.</li>
	<li>Übertragung der Lösung in das Rohr in eine Reinigung-Spalte mit einer Sammlung von 2 mL tube (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Zentrifuge der Reinigung Spalte bei 14.000 x g für 10 min.</li>
	<li>Der Pass-through Lösung zu verwerfen.</li>
	<li>Fügen Sie 480 µL 1 x TE-Puffer für jede Spalte.</li>
	<li>Zentrifuge Spalte wieder auf 14.000 x g für 10 min.</li>
	<li>Die Pass-Through-Lösung zu verwerfen.</li>
	<li>Übertragen die beschriftete DNA-Probe, die am unteren Teil der Spalte, die einen neuen Zentrifugenröhrchen bleibt.</li>
	<li>Messen Sie das Volumen der beschrifteten DNA-Probe mit einer Pipette und bringen das Endvolumen zu 80 µL 1 x TE-Puffer.</li>
	<li>Messen die Konzentration von beschrifteten DNA-Probe mit einem Spektralphotometer (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Mischen eine gleiche Menge von beschrifteten Probe DNA und DNA zu verweisen und bringen das Endvolumen zu 160 µL 1 x TE-Puffer.</li>
	<li>Fügen Sie 256 µL 2 x Hybridisierung Puffer, 50 µL der menschlichen DNA Kinderbett-1 und 50 µL 10 × aCGH Blockierungsmittel (siehe Tabelle der Materialien) und mischen sie gut durch dreimal pipettieren.</li>
	<li>Drehen Sie die Rohre kurz und setzen Sie sie in einem Thermocycler bei 98 ° C für 10 min inkubieren</li>
	<li>Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 20 min.</li>
</ol> 4. Hybridisierung, waschen, und Scannen der Genom-Arrays <ol><li>Vorwärmen den Hybridisierung Backofen 67 ° C mindestens 4 h vor Beginn der Hybridisierung.</li>
	<li>Legen Sie eine Dichtung-Folie auf der Basis einer Hybridisierung Kammer.</li>
	<li>Last 490 µL Hybridisierung Lösung von Schritt 3.23 auf der Dichtung Folie.</li>
	<li>Decken die Dichtung Folie mit einem Medicago Truncatula Genom-Microarray-Chip zu eine Hybridisierung Kammer bilden.</li>
	<li>Setzen auf die Hybridisierung Kammer Abdeckungen und die Kammer mit Klemmen fest anziehen.</li>
	<li>Setzen Sie die montierten Hybridisierung Kammer in der Hybridisierung Ofen und inkubieren Sie bei 67 ° C für 40-48 h.</li>
	<li>Bereiten drei Folie beim Abwasch: zwei mit 250 mL Waschpuffer ich bei Raumtemperatur aufbewahrt, und eins mit Waschpuffer II gehalten bei 37 ° c</li>
	<li>Bereiten zwei Folie Gläser waschen: eins mit 70 mL Acetonitril und eins mit 70 mL Stabilisierung und Trockenlösung, halten Sie beide in einer Dampfhaube bei Raumtemperatur (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Die Hybridisierung Kammer aus dem Ofen nehmen und die Kammer Klemmen und abnehmen.</li>
	<li>Bewegen sich die Microarray-Chip und die Dichtung schieben Sie auf eine Folie waschen Schale mit Waschpuffer ich und trennen den Chip aus dem Titeldia.</li>
	<li>Umzug der Microarray-chip auf der zweiten Folie waschen mit Waschpuffer ich Gericht und sanft zirkulieren die Lösung mit einer Stir Bar auf einem Teller magnetische Rühren bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Übertragen der Microarray-chip der dritten Folie waschen Schale mit vorgewärmten waschen Puffer II und waschen Sie es sanft mit Stir Bar auf einem magnetischen rühren Teller bei 37 ° C für 1 min.</li>
	<li>Übertragen den Microarray-Chip auf einer Folie Glas mit Acetonitril in einer Dampfhaube waschen und waschen Sie es für 30 s.</li>
	<li>Übertragen den Microarray-Chip auf einer Folie Glas mit Stabilisierung waschen und trocknen Lösung und waschen Sie es für 30 s.</li>
	<li>Langsam den Chip herausnehmen und trocknen Sie es für 1 min.</li>
	<li>Scannen den Microarray-Chip mit Hilfe eines Scanners (siehe Tabelle der Materialien) unter 2 µm Auflösung. Eingestellten Parameter, mehrere Bilder und ganze Dia-Scans zu speichern. Kanäle 1 und 2 Gewinne auf 100 % eingestellt und den Auto-Gewinn zu stornieren.</li>
</ol> 5. CGH Datenanalyse <ol><li>Extrakt der Cy3 und Cy5 Fluoreszenz Intensitäten für jede Sonde auf dem Array mit Scan-Software (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
	<li>Use Segmentierung Analyse der Software Kopie Nummer Variationen (CNV) zwischen den DNA-Probe und Referenz-DNA zu erkennen. Verwenden Sie eine Schwelle der Segment mittlere Log 2 Probe/Referenz Verhältnis ± 2,5 Standardabweichungen für die Bestimmung der CNV.</li>
	<li>Die Verteilung der Log 2 Probe/Referenz Verhältnisse über das gesamte Genom mit einem Signal-Mapping-Software zu überprüfen (siehe Tabelle der Werkstoffe).</li>
</ol>

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<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Haben wir eine Array-CGH Plattform für die Erkennung und Charakterisierung von schnellen Neutronen Bombardement (FNB)-induzierten Mutanten in M. Truncatula CV Jemalong A17. Um die Verwendung von Array CGH Methode bei der Aufdeckung von Gen-Mutationen zu demonstrieren, führten wir aCGH Analyse des mutierten FN6191, die einen hyper-Nodulation Phänotyp im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen ausgestellt, wenn mit S. Meliloti Sm1021geimpft. Für die Segmentierung Analyse galt ein Segment erhebliche wenn das Log<sub...

Hülsenfrüchte (Fabaceae) sind die drittgrößte Familie der Blütenpflanzen, mit vielen wirtschaftlich wichtige Arten wie Soja (Glycine Max) und Alfalfa (Medicago Sativa). Hülsenfrucht Pflanzen können interagieren mit Stickstoff-fixierenden Bodenbakterien, im allgemeinen genannt Rhizobien Wurzelknöllchen zu entwickeln, in denen die atmosphärische Distickstoff auf Ammoniak für den Einsatz von der Wirtspflanze reduziert wird. Als solche Anbau von Leguminosen Pflanzen erfordert wenig Input von Stickstoffdüngemitteln und trägt somit zu einer nachhaltigen Landwirtschaft. Hülsenfrucht Getreide produzieren Blätter und Samen mit hohem Proteingehalt, dient als ausgezeichnete Futter und Getreide. Kultivierte Leguminosenarten haben jedoch in der Regel komplexe Genom Strukturen, wodurch funktionelle Studien von Genen, die Schlüsselrollen in Leguminosen-spezifische Prozesse umständlich zu spielen. Medicago Truncatula wurde weit als eine Art Modell für Hülsenfrucht Studien angenommen worden, vor allem, weil (1) es hat eine diploide Genom mit einer relativ kleinen haploiden Genomgröße (~ 550 Mbp); (2) Pflanzen können stabil für funktionelle Studien gen umgewandelt werden; und (3) Es ist eng verwandt mit Luzerne (M. Sativa), die Königin der Futterpflanzen und viele andere wirtschaftlich bedeutenden Kulturen für Translationale Studien. Vor kurzem, die Genomsequenz des M. Truncatula cv Jemalong A17 wurde freigegeben1,2. Anmerkung des Genoms zeigt, dass mehr als 50.000 vorhergesagten Genen oder gen-Modelle im Genom vorhanden sind. Um festzustellen, die Funktion der meisten Gene in die M. Truncatula ist Genom eine anspruchsvolle Aufgabe. Um funktionelle Studien von Genen zu erleichtern, eine umfassende Sammlung von Mutanten in den Bereich von mehr als 150.000 M1 Zeilen generiert wurde mit schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in M. Truncatula cv Jemalong A173 ,4. Schnellen Neutronen, einer hochenergetischen Ionisation Mutagen, worden ist bei der Schaffung von Mutanten in vielen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis5,6, Reis (Oryza Sativa)7, Tomate (Solanum verwendet Lycopersicum), Sojaöl (Glycine Soja; G. max)8,9, Gerste (Hordeum Vulgare) und Lotus Japonicus10. Ein Großteil der Mutationen von FNB Mutagenese abgeleitet sind aufgrund von DNA-Löschungen, liegen in der Größenordnung von ein paar Basenpaare an Mega Basenpaare9,11. Viele Phänotyp-Assoziierte Gene wurden erfolgreich identifiziert und charakterisiert,4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. zuvor molekularen Klonen der zugrunde liegenden Gene von FNB Mutanten stützte sich auf eine Karte-basierte Ansatz, der ist zeitaufwendig und begrenzt die Anzahl der Mutanten auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Vor kurzem mehrere kostenlose Ansätze einschließlich Protokoll-basierte Methoden, Genom Fliesen Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) für DNA-Kopie Nummer Variation Erkennung und kompletten Genoms eingesetzt zur Erleichterung der Charakterisierung der Löschung Mutanten in verschiedenen Organismen, einschließlich der Tiere und Pflanzen20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.
Um die Charakterisierung der FNB Mutanten in M. Truncatula, ein Vollständiggenom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) zu erleichtern hat die Plattform entwickelt und validiert. Wie berichtet in tierischen Systeme kann die Array-CGH Plattform Kopie Nummer Variationen (CNV) auf der Ebene der gesamten Genoms in M. Truncatula FNB Mutanten. Darüber hinaus Läsionen können mittels PCR bestätigt werden und Löschung Grenzen durch Sequenzierung identifiziert werden können. Insgesamt ist der Array-CGH-Plattform ein effizientes und effektives Werkzeug bei der Identifizierung von Läsionen in M. Truncatula FNB Mutanten. Hier werden die Array-CGH-Verfahren und PCR Charakterisierung der Löschung Grenzen in einem M. Truncatula FNB Mutant illustriert.
Das folgende Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopienzahl interessieren Variationen in Pflanzen. Als Beispiel diente Medicago Truncatula FN6191 Mutant Löschung Regionen und Kandidatengene zugeordnete mutierten Phänotypen zu identifizieren. M. Truncatula FN6191 Mutant, ursprünglich von einem schnellen Neutronen Bombardierung verursachten Löschung mutierten Sammlung32 isoliert (siehe Tabelle der Materialien), stellte einen hyper-Nodulation Phänotyp nach Inokulation mit dem Boden Bakterium, Sihorhizobium Meliloti Sm1021, im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula Genom-Array, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutiert)</td><td>Im Haus</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (Referenz)</td><td>Im Haus</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Nanotropfen-Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>SureTag DNA-Markierungskit</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Stabilisierungs- und Trocknungslösung</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-Hybridisierungskit</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungskammer Dichtungsschieber</td><td>Agilent</td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Oligo aCGH/ChIP-on-Chip-Waschpuffer 1 und 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungskammer, rostfrei</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Agilent</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Aufreinigungssäulen</td><td>Agilent</td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>Laserscanner</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Nimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>Signalkarte 1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>Signalkarte1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

eine array-basierte comparative genomische hybridisierung plattform für effiziente erkennung der kopie zahl variationen in schnellen neutronen induziert medicago truncatula mutanten

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutanten sind wertvolle genetische Ressourcen für Funktionsstudien gen. Um mutierte Sammlungen zu generieren, können drei Arten von mutagenen genutzt werden, einschließlich biologischer wie T-DNA oder Transposon, chemische wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder physische wie Ionisation Strahlung. Die Art der Mutation beobachtet variiert je nach der Mutagen verwendet. Ionisation Strahlung induzierten Mutanten sind Mutationen löschen, duplizieren oder Neuordnung. Während T-DNA oder Transposon-basierte Mutagenese, auf Arten, die zur Transformation unterliegen beschränkt, kann chemische oder physikalische Mutagenese auf verschiedenste Arten angewendet werden. Allerdings stützt sich die Charakterisierung der Mutationen abgeleitet von chemischen oder physikalischen Mutagenese traditionell auf eine kartenbasierte Klonen Ansatz, ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Hier zeigen wir, dass eine High-Density-Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) Plattform angewendet werden kann, um effizient zu erkennen und zu charakterisieren, Kopie Nummer Variationen (CNV) in Mutanten abgeleitet von schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in Medicago Truncatula, ein Leguminosenarten. Gesamte Genom-Sequenzanalyse zeigt, dass es mehr als 50.000 Gene oder gen Modelle in M. Truncatula. Im vorliegenden, FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula stammen aus mehr als 150.000 Linien, M1, die wertvolle genetische Ressourcen für funktionelle Studien der Gene im Genom darstellen. Die hier beschriebenen aCGH-Plattform ist ein effizientes Werkzeug zur Charakterisierung von FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula.

Abbildung 2 zeigt die Verteilung der normalisierten Log2 Verhältnisse der Mutant versus WT Signale über das gesamte Genom. Analyse der CGH Daten ergab eine ungefähre 22 kb Löschung auf Chromosom 4, das umfasst die gesamte SUNN gen33 und mehrere andere kommentiert Gene in FN6191 Mutant (Abbildung 2, Abbildung 3). Die Kandidat gelöschten Region wurde durch 73...

Dieses Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopie Zahl Variationen in interessieren Pflanzen.

Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Das übergeordnete Ziel dieses Array-basierten vergleichenden genomischen Hybridisierungsprotokolls ist die schnelle Identifizierung von Variationen der Kopienzahl in durch schnellen Neutronenbeschuss induzierten Mutanten der Leguminosenpflanze Medicago truncatula. Diese Methode hilft, zentrale Fragen im Bereich der Leguminosenbiologie zu beantworten. Zum Beispiel die Erleichterung der Identifizierung von Empathogenen an niedrigen Stellen, die an der Regulierung der Knöllchenentwicklung in Leguminosen beteiligt sind.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie von höchstem Ruf und Sensitivität bei der Detektion von Kopienzahlvariationen wie Deletionsmutationen in den Neutronenbeschussmutanten der Hülsenfrucht Medicago truncatula ist. Dieses Verfahren werden von mir und Hongcheng Wang, Host Doctor Fellows vom Genetic Lab, demonstriert. Frieren Sie schnell ein Gramm junges Blattgewebe, das von einzelnen Pflanzen gesammelt wurde, in flüssigem Stickstoff ein.Verwenden Sie dann einen Mörser und Stößel und mahlen Sie das gefrorene Blattgewebe zu feinem Pulver im flüssigen Stickstoff. Extrahieren Sie die genomischen DNA-Proben des Wildtyps und der Mutante aus dem feinen Pulver mit einem DNA-Isolationskit. Verwenden Sie 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen, um ein Mikrogramm jeder Wildtyp- und mutierten genomischen DNA mit doppelt destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 20 Mikrolitern zu verdünnen.Geben Sie dann fünf Mikroliter zufälligen Primer in die Zentrifugenröhrchen. Wirbeln Sie die Röhrchen schnell vor und legen Sie sie nach einem kurzen Schleudern für 10 Minuten in einen Thermocycler, um die DNA-Proben bei 98 Grad Celsius zu denaturieren. Nehmen Sie nach 10 Minuten die Röhrchen aus dem Thermocycler und legen Sie sie sofort für fünf Minuten auf Eiswasser.Bereiten Sie dann zwei Markierungsmischungen vor und fügen Sie 25 Mikroliter der Markierungsmischung als eins bzw. zwei zu den Wildtyp- bzw. mutierten DNA-Röhrchen hinzu. Pipettieren Sie die DNA und die Markierungsmischung dreimal und drehen Sie dann die Röhrchen kurz. Nach dem Schleudern inkubieren Sie die Röhrchen im Thermocycler zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und anschließend 20 Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um das Exo-Klenow-Enzym zu inaktivieren.Fügen Sie dann 430 Mikroliter One X TE Buffer hinzu und mischen Sie den Inhalt in jedem Röhrchen. Schleudern Sie anschließend kurz die Röhrchen und überführen Sie die Lösung in den Röhrchen in Reinigungssäulen mit zwei Milliliter-Sammelröhrchen. Zentrifugieren Sie die Reinigungssäulen 10 Minuten lang bei 14.000 G und verwerfen Sie den Durchfluss.Geben Sie 480 Mikroliter One X TE Buffer in jede Säule und zentrifugieren Sie erneut 10 Minuten lang bei 14.000 mal G. Verwerfen Sie den Durchfluss. Übertragen Sie jede der Wildtyp- und Mutanten-markierten DNAs vom Boden der Säule in neue Zentrifugenröhrchen.Nachdem Sie das Volumen jeder der markierten DNAs mit der Pipette gemessen haben, stellen Sie das endgültige Volumen mit One X TE Buffer auf 80 Mikroliter ein und messen Sie dann die Konzentration der markierten DNAs in einem Spektralphotometer. Mischen Sie anschließend äquivalente Volumina von mutierter und Wildtyp-DNA, um Sonden auf einem Microarray-Chip für eine vergleichende Hybridisierung zu hybridisieren. Bringen Sie das Endvolumen mit One X TE Buffer auf 160 Mikroliter.Bereiten Sie als Nächstes die Hybridisierungslösung vor und pipettieren Sie sie dreimal, um drei Wirkstoffe gut mit der gemischten DNA zu mischen. Nach kurzem Schleudern inkubieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler bei 98 Grad Celsius für 10 Minuten und bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Denken Sie daran, die Temperatur auf 67 Grad Celsius einzustellen, um den Hybridisierungsofen vier Stunden vor der Hybridisierung vorzuheizen.Setzen Sie dann einen Dichtungsschieber auf den Boden der Hybridisierungskammer und laden Sie nach 20 Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius im Thermocycler 490 Mikroliter der Hybridisierungslösung darauf. Um die Hybridisierungskammer zu bilden, decken Sie den Dichtungsschieber mit dem Medicago truncatula Genome Micro-Array-Chip ab, decken Sie dann die Hybridisierungskammer ab und ziehen Sie sie mit den Klemmen fest fest. Inkubieren Sie die zusammengebaute Hybridisierungskammer im Hybridisierungsofen bei 67 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden.Bereiten Sie in der Zwischenzeit zwei Dia-Spülgeschirrs mit 250 Millilitern Washing Buffer One vor, die bei Raumtemperatur gehalten werden. Stellen Sie dann eine Schiebespülung mit dem Waschpuffer Zwei her, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird. Bereiten Sie dann einen Objektträgerwaschbehälter mit 70 Millilitern Acetonitril und einen weiteren Objektträgerwaschbehälter mit 70 Millilitern Stabilisierungs- und Ziehlösung vor.Stellen Sie beide Dia-Spülgläser bei Raumtemperatur in einen Abzug. Nach der Inkubation die Hybridisierungskammer aus dem Hybridisierungsofen nehmen und die Kammerklemmen lösen, um den Deckel zu öffnen. Entfernen Sie dann den Micro-Array-Chip in der Dichtungsschiene und legen Sie sie mit Wash Buffer One auf die Schiebespülschüssel.Isolieren Sie den Micro-Array-Chip von der Abdeckfolie. Übertragen Sie anschließend den Micro-Array-Chip mit Wash Buffer One auf den zweiten Objektträger-Spülteller. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab auf einer magnetischen Rührplatte bei Raumtemperatur fünf Minuten lang vorsichtig um.Legen Sie den Micro-Array-Chip mit dem vorgewärmten Waschpuffer Zwei auf den Objektträger-Waschteller und rühren Sie dann mit dem Rührstab um, um die Lösung eine Minute lang bei 37 Grad Celsius zu waschen. Entfernen Sie den Micro-Array-Chip und legen Sie ihn zum Waschen 30 Sekunden lang in das mit Acetonitril enthaltende Objektträger-Waschglas in einem Abzug. Übertragen Sie den Microarray-Chip mit der Stabilisierungs- und Trocknungslösung in das Objektträger-Waschglas und waschen Sie ihn erneut 30 Sekunden lang.Entfernen Sie vorsichtig den Chip und trocknen Sie ihn eine Minute lang im Abzug. Scannen Sie den Microarray-Chip mit einem Scanner mit einer Auflösung von zwei Mikrometern. Eine Signalkartierungssoftware wurde als Schnittstelle verwendet, um die Verteilung von normalisierten logarithmischen Zwei-Verhältnissen von Mutanten- und Wildtyp-Signalen über acht Chromosomen zu analysieren.Für mutmaßliche Löschungen wird der Wert des Verhältnisses von log zwei gleich oder kleiner als minus zwei Komma fünf Standardabweichung berücksichtigt. Die Segmentierungsanalyse der Software zeigt eine geschätzte 22-Kilobasen-Deletionsregion auf Chromosom vier, die in der Grafik dargestellt ist. Die Analyse der Deletionsgrenzen, die von den Micro-Array-Sonden flankiert werden, zeigt ein reduziertes mittleres normalisiertes logarithmisches Zwei-Verhältnis.Die Grafik zeigt auch sechs weitere annotierte Gene, einschließlich des Son-Gens, das die deletierte Region umfasst. Das Son-Gen ist für die Kontrolle der Knötchen in Metecago truncatula verantwortlich. Als nächstes zeigt die PCR-Amplifikation zur Bestätigung der Deletionsgrenzen ein Ein-Punkt-Fünf-Kilobasen-Produkt, das aus der FN6191-Mutante amplifiziert wurde, jedoch nicht im Wildtyp.Die DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Deletionsverbindung in der FN6191-Mutante zu zeigen, die im schwarzen Pfeil dargestellt ist. Es wurde auch eine Sequenzierung durchgeführt, die die Position der Deletionsgrenzen bestätigte. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 72 Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, denken Sie daran, die Ozonkonzentration in dem Raum, in dem der Eingriff durchgeführt wird, niedrig zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Messungen wie Polymerase-Kettenreaktionen aller Genomsequenzierungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Größe und die Variationen der Kopienzahl im Genom zu beantworten. Das Ereignis und die Validierung dieser Technik haben den Forschern den Weg geebnet, die Variation der Kopienzahl, die sie bei Mutanten induzieren, und die natürlichen Varianten bei Pflanzenarten zu untersuchen, die für eine Insertionsmutagenese nicht geeignet sind, wie z. B. Garden P. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acetonitril, Stabilisierungs- und Trocknungslösung extrem gefährlich sein kann.Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Augenschutz, das Vermeiden des direkten Kontakts mit den Mitteln und vorsichtiges Arbeiten, sind unbedingt erforderlich.

an-array-based-comparative-genomic-hybridization-platform-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

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Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten (Video) | JoVE Journal

Eine Array-basierte Comparative genomische Hybridisierung Plattform für effiziente Erkennung der Kopie Zahl Variationen in schnellen Neutronen induziert Medicago Truncatula Mutanten

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