Technische Demonstration von Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Die folgende Kurzpräsentation ist ein Video, das das Hybridisierungsprotokoll für das 27-K-Sub-Megabasen-Ting-Array zeigt. Dieses Array oder Smart Array besteht aus 26.946 einzeln sequenzierten Back-Klonen, die auf einem einzigen Objektträger gedruckt wurden. Sie werden in doppelter Ausführung gespottet, so dass insgesamt 54.000 Elemente pro Objektträger in einem Bereich von 18 x 54 Millimetern gedruckt werden.

Die resultierenden Daten sind vergleichbar mit Oligo-Arrays mit hoher Dichte, ohne dass eine bioinformatische Dateninterpretation erforderlich ist. Ein großer Vorteil der Verwendung eines großen Insert-Arrays, wie z. B. Back-Klone, besteht darin, dass nur 100 Nanogramm Proben-DNA ohne Amplifikation verwendet werden können. Dies ermöglicht die Analyse einer Vielzahl von Proben, wie z. B. DNA aus Blut, gefrorenem Gewebe, sortierten Zellen und FFPE-Material.

Das Smart Array hat sich im klinischen Umfeld als nützlich erwiesen. In der BC Cancer Agency lässt sich die Analyse mehrerer Patientenproben problemlos in die durchschnittliche Arbeitswoche integrieren. Für die Zytogenetik.

Die meisten Schritte, die bei der Array-CGH verwendet werden, ähneln denen der herkömmlichen CGH oder Fische. Ermöglicht eine schnelle Einführung des Protokolls in etablierten Laboren. Die Qualität der DNA hat den größten Einfluss auf die Ergebnisse in Arrays.

CGH-Hybridisierung, schlechte Qualität oder kontaminierte DNA wirken sich negativ auf die PSI-Integration in das Produkt aus, was zu schwachen Bildern oder Rauschen in den Daten führt. Das NanoDrop-Spektralphotometer ist ein hervorragendes Werkzeug, um die DNA-Qualität vor der Hybridisierung zu beurteilen. Zur Quantifizierung des DNA-Sets, des NanoDrop zur Messung von Nukleinsäure und des Modus zur Messung von DNA 50 Blind, der NanoDrop mit 1,5 Mikrolitern der gleichen Lösung wie Ihre resuspendierte Probe.

In diesem Fall handelt es sich um Wasser Tris. Es hat sich gezeigt, dass EDTA potenziell negative Auswirkungen auf die Eingliederung von PS D hat. Entfernen Sie das leere Tuch mit einem Kim-Tuch und fügen Sie 1,5 Mikroliter Ihres Probenmessgeräts hinzu und zeichnen Sie Ihre Probenkonzentration auf.

Der Wert von zwei 60 über zwei 80 auf dem NanoDrop ist ein guter Indikator für die DNA-Qualität, wobei ein Verhältnis von 1,8 optimal ist. Die Double-Ratio-Methode zwei 60 über zwei 80 und zwei 60 über zwei 30 bietet eine noch bessere Möglichkeit, die Reinheit Ihrer Proben zu bestimmen. Der NanoDrop zeigt eine Kurve an, die die Absorption relativ zur Wellenlänge darstellt.

Eine glatte Kurve ohne Peaks ist ein Hinweis auf eine gute Qualität. Wischen Sie den NanoDrop ab und reinigen Sie ihn mit Wasser und einem Kim-Tuch, oder wenn die Probe begrenzt ist, pipettieren Sie die Probe vom Sockel. Dieses Protokoll ist für 100 bis 400 Nanogramm Probe optimiert. 200 Nanogramm ist die Zielmenge für DNA von guter Qualität: Um die Probe zu markieren, sind die folgenden Reagenzien und Geräte erforderlich.

Puffer SCI: drei SCI, fünf zufällige ERs, 10-mal DNTP-Mix, Referenz-DNA, steriles Wasser 0,2 Mikroliter, sterile PCR-Röhrchen, Eis-Heatblock bei 100 Grad Celsius, Inkubator bei 45 Grad Celsius. Richten Sie ein Reaktionsröhrchen für Referenz-DNA und ein Reaktionsröhrchen ein. Die DNA-Proben werden mit Sci-Fi bzw. SCI drei markiert.

In einer Forschungsumgebung bevorzugen wir die Verwendung von CY drei für unsere Proben-DNA, da es widerstandsfähiger gegen den Ozonabbau ist. Kombinieren Sie Ihr DNA-Wasser und den Kanalpuffer mit der Probe und wiederholen Sie den Vorgang für die Referenz-DNA. In unserem Labor kombinieren wir den 10-fachen Puffer mit dem zufälligen Optimus.

Um eine fünffache Lösung herzustellen, fügen Sie steriles Wasser zu einem Gesamtvolumen von 17 Mikrolitern hinzu. Übertragen Sie die Röhren in einen Heizblock und denaturieren Sie sie fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius. Sofort auf Eis übertragen.

Fügen Sie vier Mikroliter 10-fache DNTP-Mischung hinzu. Füge die seitlichen Augen hinzu. Geben Sie zwei Mikroliter SCI mit drei markierten DCTP zur DNA-Probe.

Fügen Sie zwei Mikroliter SciFi-markiertes DCTP zur Referenz-DNA hinzu. 2,5 Mikroliter Kanal hinzufügen und mischen. Die Lösung kann entweder von Hand gemischt oder vortext werden.

Schleudern Sie die Lösung kurz bis zum Boden des Röhrchens mit einem schnellen Impuls in einer Tischzentrifuge. In einen Ofen geben und über Nacht bei 37 Grad inkubieren. Die Hybridisierungszeit über Nacht kann zwischen 14 und 24 Stunden eingestellt werden, ohne den Markierungsprozess negativ zu beeinflussen.

Um einen Laborplan mit einer MicroCon YM 30-Säule zu erstellen, geben Sie 100 Mikroliter gefangenes 1D-NA in die Säule. Achten Sie darauf, die Membran nicht mit einer eingeklemmten Pipettenspitze zu berühren. Es ist bekannt, dass DNA-Batch-zu-Batch-Varianz auch dann auftritt, wenn sie von großen Händlern gekauft wird.

Es wird empfohlen, große Chargen vor der Verwendung zu kaufen und zu testen. Für jede Probenhybridisierung gibt es nun zwei Röhrchen, eine blaue und eine rote Farbe. Kombinieren Sie die Röhrchen für jede Probe und mischen Sie sie durch Pipettieren.

Übertragen Sie dann die gesamte Lösung auf die MicroCon-Membran. Legen Sie die Säule in das mitgelieferte MicroCon-Röhrchen und drehen Sie sie 10 Minuten lang bei 13.000 g. Die MicroCon-Säule ist eine Größenausschlusssäule und fängt die DNA mit den eingebauten Nebenfarbstoffen ein und lässt die nicht eingebauten Farbstoffe durch die Membran spülen.

Um alle verbleibenden nicht eingebauten Nukleotide oder Seiten zu waschen, fügen Sie der Membran 200 Mikroliter steriles destilliertes Wasser hinzu. Erneut bei 13.000 g für 10 Minuten drehen. Entsorgen Sie das Röhrchen und geben Sie 45 Mikroliter Hybridisierungslösung auf die Oberseite der MicroCon-Konzentratorsäule

Die Hybridisierungslösung, die wir verwenden, ist Dig Easy von Roche Scientific; der Lösung können auch fünf Mikroliter Heringssperma zugesetzt werden. Traditionell wurde dies verwendet, um eine nicht kompetitive Bindung an die Gleitoberfläche zu blockieren. Durch das Aufkommen neuer Bindemittel konnte dieser Schritt entfallen.

Manchmal wird es jedoch zugesetzt, um die Viskosität der Hybridisierungslösung zu erhöhen. Drehen Sie die MicroCon-Säule um und setzen Sie sie in ein neues beschriftetes Röhrchen ein. Drehen Sie die Tube drei Minuten lang bei 3000 g.

Die Lösung sammelt sich auf dem Boden des neuen Röhrchens. 1,5 Mikroliter der Lösung werden für die Quantifizierung der SD-Inkorporation verwendet. Legen Sie das Feld NanoDrop auf Microarray-Analyse fest.

Der NanoDrop mit 1,5 Mikrolitern dig. Einfache Hybridisierung Puffer. Messen Sie den Rohling mit dem NanoDrop.

Der Messwert sollte Null sein. Entfernen Sie das leere Tuch mit einem Kim-Tuch und fügen Sie 1,5 Mikroliter Ihres Probenmaßes hinzu und notieren Sie Ihre Probeneinarbeitung. Der NanoDrop liefert Ihnen eine PICA-Mol-Konzentration pro Mikroliter sowohl der S3- als auch der Sci-Fi-Farbstoffeinbauproben mit den unten aufgeführten Eingliederungen.

Drei ole pro Mikroliter sollten als zu wenig Fluor-Vierer angesehen werden Um fortzufahren, zeigt der NanoDrop ein Diagramm der Absorption in Abhängigkeit von der Wellenlänge an. Es sollten zwei Peaks zu sehen sein, je einer für die seitlichen Augen wischen und den NanoDrop mit Wasser und einem kim Tuch reinigen. Legen Sie den Deckel auf einen Diawärmer oder Heizblock und heizen Sie ihn auf 45 Grad Celsius vor, um die Hybridisierungstemperatur aufrechtzuerhalten.

Geben Sie 42 Mikroliter Sondenlösung auf den 22 Millimeter x 60 Millimeter großen Deckglas. Achten Sie darauf, dass sich keine Luftblasen in der Lösung befinden. Ein schneller Trick, um eine hartnäckige Blase zu entfernen, besteht darin, einen frischen Deckslip zu nehmen und die Blase mit einer scharfen Ecke zum Platzen zu bringen.

Richten Sie den Objektträger über dem Deckglas und der Sondenlösung aus. Senken Sie eine Kante des Objektträgers ab, um den Kontakt mit der Hybridisierungslösung zu ermöglichen. Senken Sie eine Kante weiter ab, bis der Deckglas mit Oberflächenspannung an der Schiene befestigt ist.

Drehen Sie die Folie um. Legen Sie den Objektträger in eine Hybridisierungskassette, wärmen Sie ihn auf 45 Grad Celsius vor und geben Sie 10 Mikroliter Wasser in die untere Rille, um die Luftfeuchtigkeit zu kontrollieren. Dieser Schritt sollte geübt werden, da der Dig Easy bei niedrigeren Temperaturen kristallisiert und Hintergrund auf der Folie hinterlässt.

Dies ist besonders wichtig, wenn sich die Lösung auf dem Objektträger befindet, da es sich um eine sehr dünne Flüssigkeitsschicht handelt. Verschließen Sie zu diesem Zeitpunkt die Kassette und inkubieren Sie sie 36 bis 40 Stunden lang bei 45 Grad Celsius. Die Entfernung des Objektträgers aus der Hybridisierungskassette ist entscheidend.

Dig, kristallisiert leicht bei Raumtemperatur. Der Objektträger sollte sofort eingetaucht und der Deckglas in der Waschlösung entfernt werden. Alle Waschlösungen sollten vorgefertigt sein und einen pH-Wert von sieben haben. Ein nicht neutraler pH-Wert kann die Seitenaugen beeinträchtigen.

Die Waschlösung auf 45 Grad Celsius vorwärmen. Geben Sie etwa 60 Milliliter der Waschlösung in ein Copeland-Glas, bevor Sie die Hybridisierungskammer öffnen. Öffne die Kammer.

Entfernen Sie den Objektträger mit einer Pinzette und geben Sie den Objektträger in die Waschlösung. Warten Sie bei befestigtem Deckglas 10 bis 20 Sekunden und nehmen Sie das Deckglas mit einer Pinzette heraus. Er hätte von der Rutsche fallen sollen.

Dies ist ein wichtiger Schritt, da er das Kristallisieren des dig easy Puffers verhindert und mögliche Kratzer auf dem Objektträger durch mechanisches Entfernen des Deckglases reduziert. Waschen Sie den Objektträger dreimal in Waschlösung. Jeweils eine Minute mit Rühren.

Spülen Sie den Objektträger dreimal aus. Nach der letzten Wäsche sollten keine Blasen aus dem Sicherheitsdatenblatt in der Waschlösung sichtbar sein. Lassen Sie den Objektträger in der Waschlösung, bis er zum Zentrifugen bereit ist.

einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen bei 700 g eine Minute lang zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass das Falcon-Rohr vor dem Gebrauch trocken ist. Scannen Sie den Objektträger sofort, da die Signalintensität mit der Zeit abnimmt.

Abhängig von den Ozonwerten in der Umgebung ist jeder Scanner anders, aber es gibt einige allgemeine Richtlinien, die zu befolgen sind. Für die Bildgebung von Objektträgern. Die Ozonkonzentration in der Umgebung ist während des Scanvorgangs kritisch.

Sci-Fi-Chips sind ozonempfindlich und werden während einer langen Scanzeit schnell abgebaut. Es wurde gezeigt, dass fünf Teile pro Milliarde Ozon S fünf beeinflussen. Dies entspricht einer leichten Verkehrsverschmutzung an einem klaren Tag.

Ozonmessgeräte werden empfohlen, um die Ozonwerte in der Umgebung aufzuzeichnen. Für jeden Kanal S3 und SCI five wird ein separates Image erstellt. Die Kanäle können ausgeglichen werden, indem die Belichtung, die Zeit, die Anregung, der Eingang oder die Aufnahmeempfindlichkeit des Scanners geändert werden.

Diese Bilder sind nun bereit für die Analyse.