Messung der Verformbarkeit und Heterogenität der Erythrozyten im Blut durch Ektacytometry

Das übergeordnete Ziel dieser Technik ist es, die Verformbarkeit und zelluläre Heterogenität der roten Blutkörperchen durch Ektazytometrie zu messen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Ektazytometrie zu beantworten, z. B. wie deformierbar Erythrozyten sind, wie heterogen eine Blutprobe ist und wie sich das Experiment in Abhängigkeit von der Krankheit verändert. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind Zugänglichkeit, Bequemlichkeit und Zuverlässigkeit bei der Messung der Verformbarkeit und Heterogenität von Populationen roter Blutkörperchen.

Die Techniken können nützlich sein, um das Ansprechen auf die Therapie bei Patienten mit Sichelzellenanämie zu überwachen. Denn die Verformbarkeit und Heterogenität der roten Blutkörperchen korrelieren mit der Zusammensetzung und Konzentration des Hämoglobins. Diese Methoden können auf andere Krankheiten angewendet werden, die durch eine verminderte Verformbarkeit der roten Blutkörperchen gekennzeichnet sind, wie z. B. Diabetes, bei denen eine verminderte Verformbarkeit der roten Blutkörperchen zu mikrovaskulären Erkrankungen beitragen könnte.

Beginnen Sie damit, das nullosmolare Rohr mit der niedrigosmolaren PVP-Lösung und das 500 osmolare Rohr mit der hochosmolaren PVP-Lösung zu verbinden. Achten Sie darauf, dass der Bob vollständig in den Becher abgesenkt ist. Starten Sie die Software und bereiten Sie das Gerät vor, indem Sie Hardwareprüfung und dann Instrument-E/A auswählen. Lassen Sie das Gerät den Ansaugzyklus abschließen.

Sobald der Zyklus abgeschlossen ist, heben Sie den Bob aus dem Becher und trocknen Sie den Bob und den Becher vollständig mit einem fusselarmen Reinigungstuch ab. Mischen Sie eine frisch entnommene Vollblutprobe vorsichtig, indem Sie das Fläschchen mehrmals umdrehen. Pipettieren Sie dann 25 Mikroliter Vollblut in fünf Milliliter isoosmolarer PVP-Lösung.

Nach dem Verschließen des Fläschchens vorsichtig mischen, indem Sie es erneut mehrmals umdrehen. Wählen Sie Verformbarkeit aus dem Hauptmenü der Software, erstellen Sie dann eine neue Analyse und fügen Sie die experimentellen Details hinzu. Heben Sie als Nächstes den Deckel des Ektazytometers an und vergewissern Sie sich, dass der Bob vollständig in den Becher abgesenkt ist und sich der Becher dreht.

Pipettieren Sie einen Milliliter PVP-Blutlösung in den Raum zwischen dem Becher und dem Bob. Heben Sie dann den Bob leicht an, um die Probe nach unten zu bringen. Warten Sie, bis sich alle Blasen aus der Lösung bewegt haben, und schließen Sie dann den Deckel zum Ektazytometer.

Stellen Sie die Verstärkung auf 200 ein, indem Sie den Pfeil entlang der Bildlaufleiste in der Software bewegen. Wenn die Temperatur stabil bei 37 Grad Celsius liegt und das Beugungsbild stabil ist, drücken Sie Start. Beobachten Sie die Beugungsmuster während der Datenerfassung, um sicherzustellen, dass sie kreisförmig, elliptisch oder rautenförmig bleiben.

Wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist, drucken Sie den Bericht, und bereinigen Sie ihn. Ein Beugungsmuster, das aus gesundem Blut als Reaktion auf Scherspannung gewonnen wurde, zeigt das erwartete elliptische Muster. Der Dehnungsindex wird anhand der hier gezeigten Gleichung berechnet.

Wenn die Probe aspiriert wird, spülen Sie den Raum zwischen Becher und Bob, indem Sie deionisiertes Wasser in den Raum spritzen, während das Gerät im Reinwaschgang verbleibt. Sobald der Reinigungszyklus abgeschlossen ist, heben Sie den Bob aus dem Becher und trocknen Sie den Bob und den Becher mit einem fusselarmen Reinigungstuch vollständig ab. Die richtige Trocknung ist von entscheidender Bedeutung, da Restwasser die roten Blutkörperchen lysiert und zu Interferenzen führt.

Wählen Sie Exportieren aus, um den Bericht zu speichern. Klicken Sie zuletzt auf die Schaltfläche im Hauptmenü der Software, um zur Hauptseite zurückzukehren. Nachdem Sie wie zuvor eine weitere Probe in das Ektazytometer geladen haben, stellen Sie sicher, dass ein stabiles Beugungsbild auf dem Bildschirm vorhanden ist.

Passen Sie die Kameraverstärkung an, indem Sie ein Lineal entlang des Bildschirms bewegen, bis eine Beugungshöhe von 3,8 cm erreicht wird. Verwenden Sie ein Lineal, um die Höhe des Bildes auf dem Computerbildschirm zu überprüfen. Drücken Sie dann auf Start und beobachten Sie die Datenerfassung wie zuvor.

Dieses Bild zeigt ein 3,8 cm großes Beugungsmuster, das aus dem Blut eines Patienten mit Sichelzellenanämie gewonnen wurde. Wiederholen Sie nach der Reinigung des Ektazytometers wie zuvor gezeigt den Vorgang, um Beugungsmuster in einer Höhe von 4,5 cm und 5,4 cm zu erhalten. Eine Verzerrung des Beugungsmusters tritt in heterogenen Blutproben auf, weil starre rote Blutkörperchen nicht richtig mit verformbaren Zellen ausgerichtet sind, was zu einem rautenförmigen Beugungsmuster führt.

Dieses Verzerrungsmuster wird zunehmend erkennbar, wenn die Kameraverstärkung angepasst wird, um größere Beugungsmuster zu erzeugen. Für die osmotische Gradientenektazytometrie beginnen Sie mit der Zugabe von 250 Mikrolitern Vollblut in ein Fläschchen mit fünf Millilitern isoosmolarem PVP und mischen Sie es vorsichtig. Wählen Sie Osmoscan aus dem Hauptmenü der Software.

Legen Sie dann das Fläschchen mit der Blut-PVP-Lösung unter die Nadel auf der linken Seite des Geräts. Senken Sie die Nadel ab, bis sie den Boden der Durchstechflasche berührt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch richtig mit den nieder- und hochosmolaren Lösungen für die Gradientenerzeugung verbunden ist.

Schließen Sie den Deckel des Ektazytometers und öffnen Sie die Tür in der unteren Hälfte, um einen Blick auf das Blut zu ermöglichen, das in den Schlauch eintritt. Klicken Sie auf Neue Analyse, und geben Sie die experimentellen Details ein. Nachdem Sie die Kameraverstärkung auf 200 eingestellt haben, lassen Sie das Gerät laufen, bis Blut aus dem Schlauch unter dem Instrument in den Becher gelangt.

Wenn auf dem Computerbildschirm ein stabiles Beugungsmuster angezeigt wird, starten Sie die Datenerfassung, indem Sie im Dialogfeld auf die Schaltfläche Jetzt starten klicken. Lassen Sie das Ektazytometer Daten bis zu etwa 500 Milliosmolen pro Kilogramm erfassen, und stoppen Sie dann das Gerät. Drucken Sie den Bericht.

Entfernen Sie als Nächstes das alte PVP-Blutfläschchen und ersetzen Sie es durch ein sauberes Fläschchen mit deionisiertem Wasser. Bringen Sie die Nadel nach unten, so dass sie den Boden des Fläschchens berührt, und drücken Sie dann die Spültaste im Dialogfeld, um das Verlaufssystem zu spülen. Sobald die Spülung abgeschlossen ist, drücken Sie die Option "Reinigen" im Dialogfeld auf dem Computermonitor und wählen Sie "Exportieren", um den Bericht zu speichern.

Trocknen Sie den Bob und die Tasse wie zuvor. Homogene Blutpopulationen, wie sie bei gesunden Probanden gefunden werden, erzeugen bei der Messung der Beugungsgrößen keine unterschiedlichen Verformbarkeitskurven. Im Gegensatz dazu zeigen heterogene Blutpopulationen, wie z. B. Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie, eine signifikante Abnahme der Verformbarkeitsmaße in Abhängigkeit von der Größe des Beugungsmusters.

Wenn im Sichelblut der Grad der Beugungsmusterverzerrung in Abhängigkeit von EI max gemessen wird, korreliert er mit Hämoglobin S und der adulten Hämoglobinvariante, Hämoglobin A2. Die Transfusion korrigiert die Verzerrung, was durch ihre umgekehrte Beziehung zum Prozentsatz des normalen Hämoglobins bei Erwachsenen im Blut angezeigt wird. Unabhängig davon, ob der Grad der Beugungsmusterverzerrung als Funktion der Scherspannung gemessen wird, die erforderlich ist, um die Hälfte der maximalen Verformbarkeit zu erreichen, oder als Funktion von EI max, korreliert er mit dem fetalen Hämoglobin. Wichtige Parameter der osmotischen Gradientenektazytometrie, wie EI max, EI min und O min, liefern zusätzliche Informationen über die zelluläre Hydratation, das Oberflächen-Volumen-Verhältnis bzw. die osmotische Fragilität.

Einmal gemeistert, können diese Techniken in etwa einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. die Mikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Verformbarkeit einzelner Erythrozyten zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Verformbarkeit und Serumheterogenität in Blutproben misst.