Name: Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 29 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Isolierung und Kultivierung von Knochenmark-dendritischen Zellen aus Mäusen mit GM-CSF/IL-4. Dieses Protokoll liefert hochreine Zellen für die Tumorimmunitätsforschung.

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Diese Arbeit wurde vom Programm des Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 und TJWJ202021QN034) unterstützt.

Alle Verfahren wurden vom Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee genehmigt.
1. Isolierung des Knochenmarks und Präparation der BM-Zellen
<ol><li>Opfern Sie C57BL/6-Mäuse (18-22 g, 6-8 Wochen alt) durch CO2 -Erstickung. Korrigieren Sie die Maus auf dem Operationstisch der Maus. Desinfizieren Sie die Oberflächen mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut des Beins ab, um die Muskeln und die Oberschenkelarterie freizulegen. Klemmen und reißen Sie die Oberschenkelarterie mit zwei Pinzetten ab und ziehen Sie dann das proximale Ende in Richtung Bauch. HINWEIS: Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es übermäßige Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld.</li>
	<li>Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab.</li>
	<li>Strecken Sie die unteren Gliedmaßen der Maus langsam nach außen, bis das Geräusch einer Hüftgelenksluxation zu hören ist und der Oberschenkelkopfprolaps sichtbar ist.</li>
	<li>Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper mit einer Schere entlang der Innenseite des Hüftkopfes.</li>
	<li>Schneiden Sie die Hinterbeine vom Ende des Kniegelenks ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten.</li>
	<li>Entfernen Sie die am Femur befestigten Muskeln mit Gaze. HINWEIS: Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt. Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist empfindlich, seine Integrität muss erhalten bleiben.</li>
	<li>Den Femur für 2-5 min in 75% Alkohol tauchen.</li>
</ol>2. Induktionskultur des BMDC
<ol><li>Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab. Verwenden Sie eine hämostatische Pinzette, um den mittleren und unteren Teil des Femurs zu klemmen, und einen anderen Satz, um das untere Ende des Femurs zu klemmen. Die hämostatische Pinzette wird seitlich auf den Femur aufgetragen, und der Femur wird von der Epiphysenlinie getrennt. HINWEIS: Die epiphysäre Linie ist nicht leicht sichtbar, bis der Femur bricht. Dies und die nächsten Schritte werden alle in einer sterilen Umgebung durchgeführt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze (Nadel: 0,6 mm x 25 mm), um die Knochenmarkhöhle aus dem Epiphysenlinienbruch zu durchdringen und die Nadel zu drehen, um den Oberschenkelkopf und die Knochenmarkhöhle zu durchdringen. Pulsieren und spülen Sie die Knochenmarkhöhle mit 1 ml des vollständigen Mediums, das GM-CSF/IL-4 enthält, bis der Knochen weiß wird. HINWEIS: Komplettes Kulturmedium: 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin, 55 μM β-Mercaptoethanol, 10 ng/mL GM-CSF und 10 ng/mL IL-4.</li>
	<li>Resuspendiert alle Zellen in 24 ml vollständigem Kulturmedium (~5 x 105 Zellen/ml). Nach dem Mischen wurde das gesamte Medium auf einer 6-Well-Platte mit 4 ml/Well ausgesät und dann bei 37 °C mit 5% CO 2 für2 Tage inkubiert. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, Erythrozyten zu lysen.</li>
	<li>Ersetzen Sie das gesamte Medium nach 2 Tagen durch ein Medium, das GM-CSF/IL-47 enthält. Ersetzen Sie am vierten, sechsten und achten Tag die Hälfte des Mediums durch das vollständige Medium, das 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 enthält. HINWEIS: In diesem Schritt werden suspendierte Zellen wie Erythrozyten und Lymphozyten entfernt.</li>
	<li>Machen Sie jeden Tag Fotos, um das Zellwachstum aufzuzeichnen. Ernten Sie ab dem sechsten Tag eine Zellquelle pro Tag, um die Zellzahl zu zählen und CD11c, CD80 und MHC II-Expression 6,7 nachzuweisen.</li>
</ol>3. Durchflusszytometrische Detektion der Expression von CD11c, CD80 und MHC II
<ol><li>Nach dem Waschen der DCs mit PBS 1 x 106 Zellen in 100 μL FACS-Puffer resuspendieren, 0,5 μg Anti-Maus-CD16/32-Antikörper hinzufügen und 10 Minuten auf Eis inkubieren, um unspezifische Antigenstellen zu blockieren.</li>
	<li>1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 und 0,04 μg APC-MHC II-Antikörper zugeben und 30 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Bei 1.000 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren, den Überstand entfernen, 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzufügen, für 30 min bei 4 °C fixieren und in 300 μL FACS-Puffer wieder suspendieren.</li>
	<li>Durchflusszytometrie durchführen.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li>
<li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401(2020).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786(2021).</li>
<li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+ontogeny%3A+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li>
<li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited%3A+both+CD8alpha%28-%29+and+CD8alpha%28%2B%29+dendritic+cells+are+generated+from+CD4%28low%29+lymphoid-committed+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li>
<li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li>
<li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260(2015).</li>
<li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%3A+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li>
<li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li>
<li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li>
<li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li>
<li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate%3A+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Orthopaedics%22%5BJournal%5D)">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4(2014).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li>
</ol>

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben und dass sie nichts offenzulegen haben.

Menschen und Mäuse haben unterschiedliche DC-Untergruppen, einschließlich klassischer DCs (cDCs, einschließlich cDC1s und cDC2s), plasmazytoider DCs (pDCs) und Monozyten-abgeleiteter DCs (MoDCs) 9,10,11. Es ist allgemein anerkannt, dass cDC1s zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) auf intrazelluläre Krankheitserreger und Krebs und cDC2s Immunantworten auf extrazelluläre Krankheitserreger, Parasiten und Allergene regulieren<...

Dendritische Zellen (DCs) sind die stärksten Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) zur Aktivierung naiver T-Zellen und zur Induktion spezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten-Reaktionen (CTL) gegen Infektionskrankheiten, Allergieerkrankungen und Tumorzellen 1,2,3. DCs sind das primäre Bindeglied zwischen angeborener Immunität und adaptiver Immunität und spielen eine wesentliche Rolle bei der immunologischen Abwehr und der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz. In den letzten 40 Jahren haben viele Forscher versucht, die Untergruppen von DCs und ihre Funktionen bei Entzündungen und Immunität zu definieren. Nach diesen Studien entwickeln sich DCs entlang der myeloischen und lymphatischen Linien aus Knochenmarkzellen. Tumorimpfstoffe haben in den letzten Jahren bedeutende Meilensteine erreicht und haben eine vielversprechende Zukunft. Mechanisch modulieren Tumorimpfstoffe die Immunantwort und verhindern das Tumorwachstum, indem sie zytotoxische T-Lymphozyten mit Hilfe von Tumorantigenen aktivieren. Der auf DCs basierende Impfstoff spielt eine wichtige Rolle in der Tumorimmuntherapie und wurde als eine der vielversprechendsten Anti-Tumor-Therapienidentifiziert 1,4. Darüber hinaus wurden DCs häufig bei der Erprobung neuer molekular ausgerichteter Medikamente und Immun-Checkpoint-Inhibitoreneingesetzt 5.
Forscher benötigen dringend eine hohe Anzahl von hochreinen DCs, um die Rolle von DCs weiter zu untersuchen. DCs sind jedoch in verschiedenen Geweben und Blut selten und machen nur 1% der Blutzellen bei Menschen und Tieren aus. Die In-vitro-Kultur von dendritischen Knochenmarkzellen (BMDC) ist eine wichtige Methode, um große Mengen an DC-Zellen zu erhalten. In der Zwischenzeit wurde das Lutz-Protokoll zur Erzeugung von DCs aus Knochenmark von Forschernhäufig verwendet 6. Obwohl das Protokoll bei der Gewinnung von DC-Zellen wirksam ist, ist es komplex und teuer und beinhaltet die Zugabe hoher Konzentrationen von Zytokinen und die Lyse von roten Blutkörperchen.
In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Isolierung fast aller Knochenmarkzellen aus dem Knochenmark (BM) der Maus und zur Induktion der Differenzierung in BMDC nach 7-9 Tagen Inkubation in vitro, mit einer niedrigeren Konzentration von GM-CSF und IL-4. Dieses Verfahren dauert nur 10 Minuten, um fast alle Knochenmarkzellen zu entnehmen und sie in einem vollständigen Medium zu suspendieren. Kurz gesagt, wir bieten eine effiziente und kostengünstige Kultivierungsmethode für BMDC in dieser Forschung.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC-MHC II</td><td>Biolegend</td><td>116417</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>PE-CD80</td><td>Biolegend</td><td>104707</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>Percp/cy5.5-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117327</td><td></td></tr><tr><td>PRMI-1640</td><td>Thermo</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus GM-CSF</td><td>Solarbio</td><td>P00184</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-4</td><td>Solarbio</td><td>P00196</td><td></td></tr><tr><td>TruStain Fc PLUS (Anti-Maus CD16/32) Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>156603</td><td></td></tr></tbody></table>

wirtschaftliches und effizientes protokoll zur isolierung und kultivierung von aus knochenmark gewonnenen dendritischen zellen aus mäusen

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Die Nachfrage nach dendritischen Zellen (DCs) steigt allmählich mit fortschreitender immunbiologischer Forschung. DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode zur Isolierung von DCs beinhaltet in erster Linie die Induktion der Knochenmarkdifferenzierung (BM) in DCs durch Injektion großer Dosen (>10 ng / ml) von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor / Interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), was das Verfahren komplex und teuer macht. In diesem Protokoll wurden unter Verwendung aller BM-Zellen, die in 10 ng / mL GM-CSF / IL-4-Medium kultiviert wurden, nach 3-4 Halbkulturaustausch bis zu 2,7 x 10 7 CD11c + -Zellen (DCs) pro Maus (zwei Oberschenkelknochen) mit einer Reinheit von 80% -95% geerntet. Nach 10 Tagen in Kultur nahm die Expression von CD11c, CD80 und MHC II zu, während die Anzahl der Zellen abnahm. Die Anzahl der Zellen erreichte nach 7 Tagen Kultur ihren Höhepunkt. Darüber hinaus dauerte diese Methode nur 10 Minuten, um alle Knochenmarkzellen zu ernten, und eine hohe Anzahl von DCs wurde nach 1 Woche Kultur erhalten.

Die 1 x 10 7-1,7 x 107 Zellen wurden aus zwei Oberschenkelknochen extrahiert und in 24 ml Medium resuspendiert, bevor sie in eine 6-Well-Platte gepflanzt wurden (Abbildung 1A). Nach 2 Tagen wurden nicht adhärente Zellen durch vollständigen Wechsel des Kulturmediums entfernt. Vor dem Wechsel des Mediums wurde eine signifikante Anzahl von suspendierten Zellen beobachtet (Abbildung 1B). Nach 3 Tagen Kultur begannen sich kleinzellige Kolonien z...

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Erzeugung von aus Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus der Maus. Verfahren mit tierischen Probanden wurden von der Institution Animal Ethics Committee der Nanjing Medical University genehmigt.One.Introduction. Mit der Zunahme der Tumorimmunitätsforschung steigt die Nachfrage nach DC-Zellen allmählich an.DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode, hauptsächlich die Differenzierung von Knochenmark in DCs zu induzieren, ist kompliziert und kostspielig. Zwei. Isolierung des Knochenmarks und Vorbereitung der BM-Zellen Wir opfern Mäuse und fixieren uns auf dem Operationstisch der Maus.Schneiden Sie die Haut der linken freiliegenden Muskeln und der Oberschenkelarterie ab. Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es starke Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld.Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab. Strecken Sie langsam die unteren Gliedmaßen der Maus nach außen, bis der Vorfall des Hüftkopfes und kann beobachtet werden. Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper.Schneiden Sie das Hinterbein ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten. Entfernen Sie die Muskeln mit Gaze. Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt.Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist zerbrechlich. Legen Sie den Femur für zwei bis fünf Minuten in 75% Alkohol. Drei. Injektionskultur von BMDC Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab.Klemmen Sie den mittleren und unteren Teil des Femurs mit einer hämostatischen Pinzette und klemmen Sie das untere Ende des Femurs mit einer anderen hämostatischen Pinzette ein. Die hämostatische Pinzette wird buchstäblich auf den Femur aufgetragen und der Femur wird von der Epiphysenlinie gebrochen. Verwenden Sie eine ml-Spritze, um die Knochenmarkhöhle aus der Epiphysenlinie zu durchstechen.Verwenden Sie das komplette Medium zwei Teile spülen Sie die Knochenmarkhöhle, bis der Knochen weiß wird. Spülflüssigkeiten sammeln. Ergänzung des kompletten Mediums mit GM CSF/IL-4 bis 24ml und Saat in einer 6-Well-Platte mit 4ml pro Well. Vier. Ergebnisse.Ersetzen Sie nach zwei Tagen alle Medien, die GM-CSF/IL-4 enthalten. Die Hälfte ersetzte das komplette Medium, das GM-CSF/IL-4 enthielt, am vierten und sechsten und achten Tag. Die Anzahl der Zellen erreichte am siebten Tag einen Höhepunkt und nahm dann allmählich ab.DC-Zellen bildeten eine große Anzahl von Synapsen, die eine typische reife DC-Zellmorphologie zeigten. Durchfluss-Submetrische Analysen zeigen, dass das Verhältnis von CD11c am sechsten Tag einen Anstieg des breiten Verhältnisses um 71% auf 96,1% am 10. Tag auferlegte. Die Expression von CD11c, CD80 und MSC2 nahm mit zunehmender Kultivierungszeit allmählich zu. Fünf. Fazit.Kurz gesagt, wir haben ein wirtschaftliches und effizientes Protokoll für die Isolierung und Erzeugung von dendritischen Zellen aus Knochenmark von Mäusen erstellt, das nur 10 Minuten benötigt, um Knochenmarkzellen zu trennen. Eine hohe Anzahl von hochreinen DCs wurde nach sechs bis sieben Tagen Kultur mit 10 ng pro ml, GM-CSF und IL-4 geerntet.

economical-efficient-protocol-for-isolating-culturing-bone-marrow

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

Wir beschreiben ein Protokoll für die Isolierung und Reinigung von Neutrophilen aus Maus-Knochenmark durch Dichtegradientenzentrifugation und Neutrophilen-Kennzeichnung mit CellTracker Farbstoffe. Dies stellt eine einfache, schnelle, reproduzierbare und kostengünstige Methode zur Gewinnung einer großen Anzahl von Neutrophilen für nachgeschaltete funktionelle Studien oder Adoptiv-Transfer-und Tracking-Experimenten.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Wir präsentieren unsere optimierten High-Throughput-Nukleofektion Protokoll als eine effiziente Art der Transfektion von primären humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen entweder mit Plasmid-DNA oder siRNA, ohne dass Zellreifung. Wir fördern den Nachweis für die erfolgreiche siRNA-Silencing von gezielten Gen RIG-I sowohl auf mRNA-und Protein-Ebene.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Lernen Sie eine kostengünstige Methode zur Isolierung und Kultivierung von Knochenmark-dendritischen Zellen aus Mäusen mit GM-CSF/IL-4. Dieses Protokoll liefert hochreine Zellen für die Tumorimmunitätsforschung.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen (Video) | JoVE Journal

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

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