Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen
July 1st, 2022
Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.
Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Erzeugung von aus Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus der Maus. Verfahren mit tierischen Probanden wurden von der Institution Animal Ethics Committee der Nanjing Medical University genehmigt.One.Introduction. Mit der Zunahme der Tumorimmunitätsforschung steigt die Nachfrage nach DC-Zellen allmählich an.
DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode, hauptsächlich die Differenzierung von Knochenmark in DCs zu induzieren, ist kompliziert und kostspielig. Zwei. Isolierung des Knochenmarks und Vorbereitung der BM-Zellen Wir opfern Mäuse und fixieren uns auf dem Operationstisch der Maus.
Schneiden Sie die Haut der linken freiliegenden Muskeln und der Oberschenkelarterie ab. Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es starke Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld.
Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab. Strecken Sie langsam die unteren Gliedmaßen der Maus nach außen, bis der Vorfall des Hüftkopfes und kann beobachtet werden. Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper.
Schneiden Sie das Hinterbein ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten. Entfernen Sie die Muskeln mit Gaze. Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt.
Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist zerbrechlich. Legen Sie den Femur für zwei bis fünf Minuten in 75% Alkohol. Drei. Injektionskultur von BMDC Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab.
Klemmen Sie den mittleren und unteren Teil des Femurs mit einer hämostatischen Pinzette und klemmen Sie das untere Ende des Femurs mit einer anderen hämostatischen Pinzette ein. Die hämostatische Pinzette wird buchstäblich auf den Femur aufgetragen und der Femur wird von der Epiphysenlinie gebrochen. Verwenden Sie eine ml-Spritze, um die Knochenmarkhöhle aus der Epiphysenlinie zu durchstechen.
Verwenden Sie das komplette Medium zwei Teile spülen Sie die Knochenmarkhöhle, bis der Knochen weiß wird. Spülflüssigkeiten sammeln. Ergänzung des kompletten Mediums mit GM CSF/IL-4 bis 24ml und Saat in einer 6-Well-Platte mit 4ml pro Well. Vier. Ergebnisse.
Ersetzen Sie nach zwei Tagen alle Medien, die GM-CSF/IL-4 enthalten. Die Hälfte ersetzte das komplette Medium, das GM-CSF/IL-4 enthielt, am vierten und sechsten und achten Tag. Die Anzahl der Zellen erreichte am siebten Tag einen Höhepunkt und nahm dann allmählich ab.
DC-Zellen bildeten eine große Anzahl von Synapsen, die eine typische reife DC-Zellmorphologie zeigten. Durchfluss-Submetrische Analysen zeigen, dass das Verhältnis von CD11c am sechsten Tag einen Anstieg des breiten Verhältnisses um 71% auf 96,1% am 10. Tag auferlegte. Die Expression von CD11c, CD80 und MSC2 nahm mit zunehmender Kultivierungszeit allmählich zu. Fünf. Fazit.
Kurz gesagt, wir haben ein wirtschaftliches und effizientes Protokoll für die Isolierung und Erzeugung von dendritischen Zellen aus Knochenmark von Mäusen erstellt, das nur 10 Minuten benötigt, um Knochenmarkzellen zu trennen. Eine hohe Anzahl von hochreinen DCs wurde nach sechs bis sieben Tagen Kultur mit 10 ng pro ml, GM-CSF und IL-4 geerntet.
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Überblick
Dieser Artikel stellt eine wirtschaftliche und effiziente Methode zur Isolierung und Erzeugung hochreiner dendritischer Zellen aus Knochenmark von Mäusen vor. Das Protokoll umfasst eine 7-tägige Kultur mit GM-CSF/IL-4.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Dendritische Zellen (DCs) sind entscheidend für die Forschung zur Tumorimmunität.
- DCs sind in Geweben selten, was ihre Isolierung erschwert.
- Traditionelle Methoden zur DC-Differenzierung sind komplex und kostspielig.
- Diese Studie zielt darauf ab, den Prozess der Erzeugung von DCs aus Knochenmark zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer kostengünstigen Methode zur Isolierung von DCs.
- Verbesserung der Effizienz der DC-Erzeugung aus Mausknochenmark.
- Unterstützung der Forschung zur Tumorimmunität durch Bereitstellung hochreiner DCs.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Knochenmark aus Mäusen.
- Kultur von Knochenmarkzellen mit GM-CSF/IL-4.
- Bewertung der Zellreinheit und -lebensfähigkeit.
- Genehmigung durch den Institutional Animal Ethics Committee.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung hochreiner dendritischer Zellen aus Knochenmark.
- Nachgewiesene Effizienz des neuen Protokolls.
- Potenzial für eine breitere Anwendung in der Tumorimmunitätsforschung.
- Reduzierung von Zeit und Kosten im Vergleich zu traditionellen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist eine praktikable Alternative zur DC-Erzeugung.
- Dieser Ansatz kann weitere Forschungen in der Immunologie erleichtern.
- Zukünftige Studien können Anwendungen in verschiedenen therapeutischen Kontexten untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the bottleneck in dendritic cell supply for immunology and tumor immunity research by providing an economical, high-yield method for isolating bone marrow-derived dendritic cells from mice. It enables scalable generation of phenotypically characterized DCs with reduced reagent consumption and hands-on time, supporting early-stage target validation and mechanistic studies in immunotherapy pipelines. The approach improves predictive confidence in preclinical models by delivering a reproducible, disease-relevant system for evaluating immune modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell function in antigen presentation and T-cell activation pathways.
- Operational Value: Reduces cost and complexity of DC generation using standardized GM-CSF/IL-4 differentiation.
- Scientific Value: Supports functional target validation through phenotypic characterization of CD11c, CD80, and MHC II expression over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces high-purity dendritic cell populations (80%-95% CD11c+) suitable for standardized immune assays.
- Operational Value: Yields up to 2.7 x 107 cells per mouse, enabling high-throughput screening formats.
- Scientific Value: Provides a consistent biological system for assessing compound effects on dendritic cell maturation and immune function.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates a disease-relevant system for modeling dendritic cell responses in tumor immunity contexts.
- Operational Value: Supports preclinical evaluation of immunomodulatory agents with defined cellular inputs.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking dendritic cell phenotype to functional outcomes in co-culture systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a renewable source of dendritic cells for immune-focused assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on dendritic cell-dependent immune pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cellular outputs for assessing immunomodulatory activity.
- Analytics: Enables flow cytometry-based measurement of CD11c, CD80, and MHC II as maturation readouts.
- Translational Research: Connects in vitro dendritic cell generation to preclinical models of immune activation and tolerance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for dendritic cell production across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through phenotypically defined dendritic cell inputs.
- Operational Value: Reduces time and cost via 10-minute bone marrow harvest and low cytokine dosing (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable dendritic cell models for immunotherapy screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates using standardized immune effector cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow isolation and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to 6-well plates, hemolytic forceps, and flow cytometry for phenotypic validation.
- Necessitates standardization of cytokine concentration and medium exchange schedule across users.
- Involves adaptation considerations when translating to other mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the 7–10 day culture window and associated decline in cell viability post-peak.
