Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen
1. Juli 2022
Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.
Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Erzeugung von aus Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus der Maus. Verfahren mit tierischen Probanden wurden von der Institution Animal Ethics Committee der Nanjing Medical University genehmigt.One.Introduction. Mit der Zunahme der Tumorimmunitätsforschung steigt die Nachfrage nach DC-Zellen allmählich an.
DCs sind jedoch in allen Geweben selten. Die traditionelle Methode, hauptsächlich die Differenzierung von Knochenmark in DCs zu induzieren, ist kompliziert und kostspielig. Zwei. Isolierung des Knochenmarks und Vorbereitung der BM-Zellen Wir opfern Mäuse und fixieren uns auf dem Operationstisch der Maus.
Schneiden Sie die Haut der linken freiliegenden Muskeln und der Oberschenkelarterie ab. Schneiden Sie die Oberschenkelarterie nicht direkt ab. Andernfalls verursacht es starke Blutungen und kontaminiert das Sichtfeld.
Schneiden Sie alle Muskeln um den Oberschenkelknochen ab. Strecken Sie langsam die unteren Gliedmaßen der Maus nach außen, bis der Vorfall des Hüftkopfes und kann beobachtet werden. Trennen Sie die unteren Gliedmaßen vom Körper.
Schneiden Sie das Hinterbein ab, um einen freien und vollständigen Femur zu erhalten. Entfernen Sie die Muskeln mit Gaze. Zerreißen Sie die Muskeln nicht direkt.
Der Oberschenkelknochen von Mäusen ist zerbrechlich. Legen Sie den Femur für zwei bis fünf Minuten in 75% Alkohol. Drei. Injektionskultur von BMDC Spülen Sie den Restalkohol mit PBS ab.
Klemmen Sie den mittleren und unteren Teil des Femurs mit einer hämostatischen Pinzette und klemmen Sie das untere Ende des Femurs mit einer anderen hämostatischen Pinzette ein. Die hämostatische Pinzette wird buchstäblich auf den Femur aufgetragen und der Femur wird von der Epiphysenlinie gebrochen. Verwenden Sie eine ml-Spritze, um die Knochenmarkhöhle aus der Epiphysenlinie zu durchstechen.
Verwenden Sie das komplette Medium zwei Teile spülen Sie die Knochenmarkhöhle, bis der Knochen weiß wird. Spülflüssigkeiten sammeln. Ergänzung des kompletten Mediums mit GM CSF/IL-4 bis 24ml und Saat in einer 6-Well-Platte mit 4ml pro Well. Vier. Ergebnisse.
Ersetzen Sie nach zwei Tagen alle Medien, die GM-CSF/IL-4 enthalten. Die Hälfte ersetzte das komplette Medium, das GM-CSF/IL-4 enthielt, am vierten und sechsten und achten Tag. Die Anzahl der Zellen erreichte am siebten Tag einen Höhepunkt und nahm dann allmählich ab.
DC-Zellen bildeten eine große Anzahl von Synapsen, die eine typische reife DC-Zellmorphologie zeigten. Durchfluss-Submetrische Analysen zeigen, dass das Verhältnis von CD11c am sechsten Tag einen Anstieg des breiten Verhältnisses um 71% auf 96,1% am 10. Tag auferlegte. Die Expression von CD11c, CD80 und MSC2 nahm mit zunehmender Kultivierungszeit allmählich zu. Fünf. Fazit.
Kurz gesagt, wir haben ein wirtschaftliches und effizientes Protokoll für die Isolierung und Erzeugung von dendritischen Zellen aus Knochenmark von Mäusen erstellt, das nur 10 Minuten benötigt, um Knochenmarkzellen zu trennen. Eine hohe Anzahl von hochreinen DCs wurde nach sechs bis sieben Tagen Kultur mit 10 ng pro ml, GM-CSF und IL-4 geerntet.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine kostengünstige und effiziente Methode zur Isolierung und Gewinnung von hochreinen dendritischen Zellen aus dem Knochenmark von Mäusen vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine 7-tägige Kultur mit GM-CSF/IL-4.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Dendritische Zellen (DCs) sind entscheidend für die Tumorimmunforschung.
- DCs kommen in Geweben selten vor, was ihre Isolierung erschwert.
- Herkömmliche Methoden zur Differenzierung von DCs sind komplex und kostspielig.
- Die vorliegende Studie zielt darauf ab, das Verfahren zur Erzeugung von DCs aus Knochenmark zu vereinfachen.
Zweck der Studie
- Eine kosteneffektive Methode zur Isolierung von DCs entwickeln.
- Die Effizienz der DC-Generierung aus murinem Knochenmark verbessern.
- Forschungsarbeiten zur Tumorimmunität durch die Bereitstellung hochreiner DCs unterstützen.
Verwendete Methoden
- Gewinnung des Knochenmarks von Mäusen.
- Kultur von Knochenmarkzellen mit GM-CSF/IL-4.
- Bestimmung der Zellreinheit und -lebensfähigkeit.
- Zustimmung durch den Institutsinternen Tierversuchsausschuss.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von hochreinen, aus dem Knochenmark stammenden DCs.
- Nachgewiesene Effizienz des neuen Protokolls.
- Potenzial für eine breitere Anwendung in der Tumorimmunforschung.
- Verkürzung von Zeit und Kosten im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
Schlussfolgerungen
- Die entwickelte Methode ist eine gangbare Alternative für die DC-Generierung.
- Dieser Ansatz kann weitere Forschungen in der Immunologie erleichtern.
- Zukünftige Studien könnten Anwendungen in verschiedenen therapeutischen Kontexten untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll behebt den Engpass bei der Versorgung mit dendritischen Zellen für die Immunologie- und Tumorimmunforschung, indem es eine kostengünstige Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung dendritischer Zellen aus Knochenmark von Mäusen bereitstellt. Es ermöglicht die skalierbare Erzeugung phänotypisch charakterisierter DCs bei reduziertem Reagenzienverbrauch und geringerer manueller Arbeitszeit und unterstützt so die frühe Validierung von Zielstrukturen sowie mechanistische Untersuchungen in Immuntherapie-Pipelines. Der Ansatz verbessert die Vorhersagekraft präklinischer Modelle, indem er ein reproduzierbares, krankheitsrelevantes System zur Bewertung immunmodulatorischer Effekte bereitstellt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der dendritischen Zellfunktion in Antigenpräsentation und T-Zell-Aktivierungswegen.
- Operativer Wert: Reduziert die Kosten und Komplexität der DC-Generierung durch standardisierte GM-CSF/IL-4-Differenzierung.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch phänotypische Charakterisierung der Expression von CD11c, CD80 und MHC II über die Zeit.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt Populationen von dendritischen Zellen mit hoher Reinheit (80 %–95 % CD11c+), die für standardisierte Immunassays geeignet sind.
- Operativer Wert: Liefert bis zu 2,7 × 107 Zellen pro Maus und ermöglicht damit Hochdurchsatz-Screening-Formate.
- Wissenschaftlicher Wert: Stellt ein konsistentes biologisches System zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf die Reifung dendritischer Zellen und deren Immunfunktion bereit.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt ein krankheitsrelevantes System zur Modellierung der Dendritischen-Zell-Antworten in Kontexten der Tumorimmunität.
- Operativer Wert: Ermöglicht die präklinische Bewertung immunmodulatorischer Wirkstoffe mit definierten zellulären Inputgrößen.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die mechanistische Risikominimierung, indem der Phänotyp dendritischer Zellen mit funktionellen Ergebnissen in Kokultursystemen verknüpft wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis zur präklinischen Evaluierung ein und liefert eine regenerierbare Quelle dendritischer Zellen für immunfokussierte Assays.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu dendritischen zellabhängigen Immunwegen und Target-Bindung.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative zelluläre Ergebnisse zur Beurteilung immunmodulatorischer Aktivität.
- Analytik: Ermöglicht die durchflusszytometrische Messung von CD11c, CD80 und MHC II als Parameter für die Reifung.
- Translationale Forschung: Verbindet die in-vitro-Generierung dendritischer Zellen mit präklinischen Modellen der Immunaktivierung und Toleranz.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft ein standardisiertes, skalierbares Protokoll zur Herstellung dendritischer Zellen in verschiedenen Immunologieprojekten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung durch phänotypisch definierte dendritische Zell-Eingaben.
- Operationaler Wert: Verringert Zeit und Kosten durch eine 10-minütige Knochenmarkentnahme und geringe Zytokindosierung (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem zuverlässige dendritische Zellmodelle für die Immuntherapie-Screening bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung immunmodulatorischer Kandidaten unter Verwendung standardisierter Immun-Effektorzellen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von murinem Knochenmark und aseptischen Zellkultivierungstechniken.
- Hängt vom Zugang zu 6-Loch-Platten, hämolytischen Pinzetten und der Durchflusszytometrie zur phänotypischen Validierung ab.
- Erfordert die Standardisierung der Zytokinkonzentration und des Mediumwechselzeitplans zwischen verschiedenen Anwendern.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Übertragung auf andere Mausstämme oder genetische Hintergründe.
- Ist durch das Kulturzeitfenster von 7–10 Tagen und den damit verbundenen Rückgang der Zellviabilität nach dem Peak begrenzt.
