Durchflusszytometrie-basierte Analyse der Aktivierung dendritischer Zellen mit Hilfe von Immunkomplexen

Beginnen Sie mit einer chemisch fixierten Tumorzellsuspension.

Fügen Sie eine optimale Konzentration an tumorbindendem Immunglobulin G hinzu, das an Oberflächenantigene von Tumorzellen bindet und Immunkomplexe oder ICs bildet.

Übertragen Sie die ICs auf eine Kulturplatte, die adhärente dendritische Zellen enthält. Ausbrüten.

Die dendritische Zelle erkennt das IC, internalisiert es und verarbeitet es zu Peptidfragmenten.

Die Fragmente werden auf Moleküle der Haupthistokompatibilitätskomplexe der Klasse II oder MHC-II geladen und zusammen mit dem kostimulatorischen Molekül CD86 auf der Zelloberfläche präsentiert.

Entfernen von Medien. Fügen Sie einen Zelldissoziationspuffer hinzu und pipettieren Sie kräftig, um die Zellen zu lösen.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einer Blockierungslösung, um unspezifische Wechselwirkungen zu blockieren.

Overlay mit einem Fluorophor-markierten Antikörper-Cocktail, der auf MHC-II und CD86 abzielt.

Fügen Sie einen DNA-bindenden Farbstoff hinzu und inkubieren Sie kurz, um abgestorbene Zellkerne zu färben.

Identifizieren Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie die lebenden Zellen, die M