Durchflusszytometrie-basierte Analyse der Aktivierung dendritischer Zellen mit Hilfe von Immunkomplexen

Beginnen Sie mit einer chemisch fixierten Tumorzellsuspension.

Fügen Sie eine optimale Konzentration an tumorbindendem Immunglobulin G hinzu, das an Oberflächenantigene von Tumorzellen bindet und Immunkomplexe oder ICs bildet.

Übertragen Sie die ICs auf eine Kulturplatte, die adhärente dendritische Zellen enthält. Ausbrüten.

Die dendritische Zelle erkennt das IC, internalisiert es und verarbeitet es zu Peptidfragmenten.

Die Fragmente werden auf Moleküle der Haupthistokompatibilitätskomplexe der Klasse II oder MHC-II geladen und zusammen mit dem kostimulatorischen Molekül CD86 auf der Zelloberfläche präsentiert.

Entfernen von Medien. Fügen Sie einen Zelldissoziationspuffer hinzu und pipettieren Sie kräftig, um die Zellen zu lösen.

Übertragen Sie die Zellen in ein Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einer Blockierungslösung, um unspezifische Wechselwirkungen zu blockieren.

Overlay mit einem Fluorophor-markierten Antikörper-Cocktail, der auf MHC-II und CD86 abzielt.

Fügen Sie einen DNA-bindenden Farbstoff hinzu und inkubieren Sie kurz, um abgestorbene Zellkerne zu färben.

Identifizieren Sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie die lebenden Zellen, die MHC-II und CD86 koexprimieren, was die IC-vermittelte Aktivierung dendritischer Zellen bestätigt.

Fixieren Sie die Zellen zunächst 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1,8% gepuffertem Paraformaldehyd. Aussaat der Zellsuspension in jeder Vertiefung einer U-förmigen 96-Well-Platte. Fügen Sie anschließend unterschiedliche Verdünnungen von tumorbindenden Antikörpern in jede Vertiefung hinzu. Danach inkubieren Sie die Zellen 15 bis 20 Minuten lang auf Eis.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation mit 150 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung und zentrifugieren Sie sie dann 5 bis 10 Minuten lang bei 4 Grad Celsius bei 400 mal g. Nach der Zentrifugation den Überstand ausstoßen und die Zellen zweimal waschen. Löse die Zellen in 100 Mikrolitern FACS-Puffer auf, der Fluorophor-konjugierte Sekundärantikörper enthält. Anschließend die Platte 15 bis 20 Minuten auf Eis inkubieren.

Nach 15 bis 20 Minuten fügen Sie 200 Mikroliter FACS-Puffer hinzu, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 400 mal g für 5 bis 10 Minuten. Dekantieren Sie den Überstand. Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Tumorbindung zu analysieren und die minimale Konzentration von Immunglobulin G zu bestimmen, die zur Beschichtung der Zellen erforderlich ist.

Sobald die Zellen mit einer minimalen Immunglobulin-G-Konzentration beschichtet sind, fügen Sie den CFSE-markierten Tumorimmunkomplex zu den aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen im Verhältnis 1:5 hinzu. Inkubieren Sie die Mischung dann 12 bis 16 Stunden über Nacht in vollem Medium. Durchführung einer FACS-Analyse der aus Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellaktivierung.