RNA-Pulldown-Verfahren, RNA-Ziele eine lange nicht-kodierende RNA zu identifizieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in kultivierten Zellen oder im Gewebe die molekularen RNA-Partner einer langen nicht-kodierenden RNA von Interesse zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, die biologischen Funktionen einer langen nicht-kodierenden RNA zu entschlüsseln, indem sie neue, signifikante Erkenntnisse über die RNA-Regulation durch lange nicht-kodierende RNAs liefert. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie für die meisten Anwendungen geeignet ist, da wir sie optimiert haben, zum einen für mehrere lange nicht-kodierende RNAs und zum anderen sowohl für kultivierte Zellen als auch für Gewebeextrakte.

Unsere Methode basiert auf der Mischung aus zwei vorangegangenen Methoden, der ChIRP, die für Chromatin Isolation by RNA Purifications steht, und der CHART, der Capture Hybridization Analysis of RNA Targets. Die Besonderheit unserer Methode besteht darin, dass die Oligonukleotidsonden unter Verwendung bioinformatischer Modellierung einer Sekundärstruktur einer langen nicht-kodierenden RNA entworfen wurden und ihr Ziel darin bestand, die RNA-Ziele zu identifizieren. Das Verfahren wird von zwei Technikerinnen aus meinem Team, Benedicte Boyer und Severine Guillen, vorgeführt.

Nach der Kultivierung von GH4C1-Zellen gemäß dem Textprotokoll entfernen Sie das Medium von einer Zellkulturplatte und verwenden Sie ein Volumen PBS, um die Zellen zu spülen. Fügen Sie 10 Milliliter 1%PFA in PBS hinzu, um die Zellen zu fixieren. Vernetzen Sie dann die Zellen unter Rühren bei Raumtemperatur für 10 Minuten.

Die PFA-Wirkung wird durch Zugabe von 1 Milliliter 1,25 molaren Glycins gestillt und die Probe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Verwerfen Sie dann die Lösung durch Aspiration und spülen Sie die Platte mit 10 Millilitern PBS zweimal für jeweils fünf Minuten aus. Fügen Sie als Nächstes einen Milliliter PBS hinzu, verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu sammeln, und übertragen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen.

Schleudern Sie die Probe bei 510 g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang. Entfernen Sie dann so viel Überstand wie möglich und lagern Sie die Pellets auf unbestimmte Zeit bei minus 80 Grad Celsius. Um eine Gewebevernetzung durchzuführen, tauchen Sie fünf Milligramm frisch gewonnenes Hypophysengewebe der Maus in ein 10-faches Volumen von 1 % PFA in PBS und rühren Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Quälen Sie das PFA durch Zugabe von 0,05 Millilitern 1,25 molare Glycinlösung ab und rühren Sie das Gewebe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das Medium und verwenden Sie 0,5 Milliliter PBS, um das Gewebe zweimal zu spülen. Nachdem Sie so viel Überstand wie möglich entfernt haben, lagern Sie das vernetzte Gewebe auf unbestimmte Zeit bei minus 80 Grad Celsius.

Bereiten Sie dann den Lysepuffer vor, um die Proben ohne vorheriges Auftauen zu lysieren. Verwenden Sie den Puffer, um Proben in etwa einem Milliliter pro 100 Milligramm Zellpellet oder Gewebe zu resuspendieren. Legen Sie die lysierten Proben in ein vier Grad Celsius heißes Wasserbad und starten Sie die Beschallungsreihe optimiert nach dem Textprotokoll.

Unmittelbar nach der Beschallung zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Übertragen Sie dann die Überstände in neue Röhrchen. Die Beschallungsreihe muss so optimiert werden, dass sie effizient genug ist, um die Viskosität der DNA zu reduzieren, ohne andere fragmentierte RNAs zu erhalten.

Um eine Hybridisierung an den beschallten Proben durchzuführen, fügen Sie den Röhrchen und dem Vortex zwei Volumina Hybridisierungspuffer hinzu. Von jeder Probe werden 20 Mikroliter in Zentrifugenröhrchen überführt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Geben Sie 100 Pikosolen biotinylierter Oligonukleotidsonden zu jeder Probe.

Anschließend werden die Proben vier bis sechs Stunden lang unter mäßigem Rühren auf einem Röhrchenrotator bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation fügen Sie den Proben 50 Mikroliter magnetische Streptavidin-Kügelchen hinzu, die mit 200 Einheiten pro Milliliter einer RNase-Inhibitor-Lösung und einem 5 Mikroliter pro Milliliter Protease-Inhibitor-Cocktail ergänzt werden. Inkubieren Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur unter mäßigem Rühren auf dem Röhrchenrotator über Nacht.

Führen Sie am nächsten Tag eine RNA-Isolierung durch, indem Sie die Röhrchen auf eine magnetische Halterung legen und den Überstand entsorgen. Geben Sie dann 900 Mikroliter Waschpuffer zu den Kügelchen und legen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Rotator. Legen Sie dann die Proben auf den Magneten, entsorgen Sie den Puffer und wiederholen Sie den Waschgang fünfmal.

Nach dem Entfernen der letzten Wäsche geben Sie 95 Mikroliter Proteinase K-Puffer und fünf Mikroliter Proteinase-K mit 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase-K in die Probe. Tauen Sie dann die Eingangsproben auf Eis auf und fügen Sie 75 Mikroliter Proteinase K-Puffer und fünf Mikroliter Proteinase-K hinzu. Inkubieren Sie die Proben 45 Minuten lang bei 50 Grad Celsius und dann 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Kühlen Sie die Proben drei Minuten lang auf Eis, legen Sie sie dann auf den Magneten, sammeln Sie den Überstand mit den RNAs und entsorgen Sie die Kügelchen. Verwenden Sie ein RNA-Aufreinigungskit, um die RNAs aufzureinigen. Lagern Sie schließlich die RNAs bei minus 80 Grad Celsius und führen Sie RT und qPCR durch und erstellen DNA-Bibliotheken gemäß dem Textprotokoll

Basierend auf der bioinformatischen Modellierung der hier dargestellten lncRNA-Sekundärstruktur wurden Sonden gegen zwei lncRNAs, Ratten Neat1 oder Malat1 für GH4C1-kultivierte Zellen und Maus Neat1 für Hypophysengewebeextrakte, entwickelt. Die relative Anreicherung von Neat1 oder Malat1 wurde für unspezifische und spezifische Sonden relativ zu den Eingangsproben berechnet. Diese Abbildung zeigt die Effizienz der spezifischen Sonden zum Abbau von Neat1 in der GH4C1-Hypophysenzelllinie der Ratte und in Hypophysengewebeextrakten der Maus.

Als das Protokoll für spezifische Oligonukleotide oder SO-Sonden auf Malat1 gerichtet wurde, wurde eine effiziente Sonde zusammen mit einer ineffizienten Sonde erzeugt, die verworfen wurde. Nach RNA-Pulldowns und RT-qPCR waren die RNAs, die mit Neat1 in GH4C1-Zellextrakten assoziiert sind, auch mit Neat1 in Hypophysengewebeextrakten assoziiert. Tatsächlich wurde nach dem Neat1-RNA-Pulldown festgestellt, dass Malat1 sowohl in der GH4C1-Zelllinie als auch in Gewebeextrakten aus Hypophysenmäusen von Neat1 angegriffen wird.

Darüber hinaus war Neat1 signifikant angereichert, nachdem ein Malat1-RNA-Pulldown mit der Sonde in GH4C1-Zellen durchgeführt wurde. Die enge Verwandtschaft zwischen den beiden lncRNAs stimmt mit der potenziellen co-regulatorischen Rolle von Neat1 und Malat1 überein, die von Malat1-Knock-out-Mäusen vorgeschlagen wurde, die Variationen in der Neat1-RNA-Expression aufweisen. Einmal gemeistert, ermöglicht diese Technik in zwei oder drei Tagen die Erfassung der RNA-Ziele einer gewünschten langen nicht-kodierenden RNA

Beim bioinformatischen Ansatz ist es wichtig, mehrere Anti-Sense-Sonden zu entwerfen und dann ihre Effizienz experimentell zu vergleichen, da die Sondeneffizienz durch Zelllysatpräparate verändert werden kann. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um das gesamte RNA-Interaktom einer langen nicht-kodierenden RNA von Interesse bereitzustellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die RNA-Partner einer langen nicht-kodierenden RNA mit effizienten, spezifischen Sonden erfassen können, die mit verfügbaren Regionen der langen nicht-kodierenden RNA hybridisieren, wie durch bioinformatische Modellierung ihrer Sekundärstruktur bestimmt.