Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Das Ziel dieses Videos ist es, die Methode zur Isolierung und Identifizierung von RNAs und Proteinkomponenten von Ribonukleoproteinkomplexen aus Zellextrakten mit Hilfe von Immunpräzipitationsmethoden zu demonstrieren. Hallo, mein Name ist Garrett Dom und ich bin Doktorand in der Abteilung für Molekular- und Mikrobiologie und Immunologie an der University of Missouri und studiere bei Dr. Eli sso. Seit den Fortschritten in der Hochdurchsatz-Sequenzierung und der effizienten Microarray-Analyse ist die globale Genexpression und -analyse in vielen Forschungs- und Krankheitsmodellen zu einer einfachen und leicht verfügbaren Form der Datenerfassung geworden.

Die Spiegel der Zielgen-mRNA im Studienzustand korrelieren jedoch nicht immer direkt mit den Steady-State-Proteinspiegeln. Die posttranskriptionelle Genregulation ist eine wahrscheinliche Erklärung für die Divergenz zwischen den beiden. Angetrieben durch die Wechselwirkungen von RNA-bindenden Proteinen.

Die posttranskriptionelle Regulation beeinflusst die Lokalisierung, Stabilität und Translation von mRNAs, indem sie einen Rippennukleoproteinkomplex mit Ziel-mRNAs bildet. Die Identifizierung dieser unbekannten Denovo-mRNA-Ziele aus zellulären Extrakten in diesem Komplex ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen und Funktionen des RNA-bindenden Proteins und ihrer daraus resultierenden Wirkung auf die Proteinproduktion. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die als Riboprotein, Immunimmunpräzipitation oder RIP bezeichnet wird und die Identifizierung spezifischer mRNAs ermöglicht, die mit dem Ribonukleoproteinkomplex assoziiert sind.

Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, ist es wichtig, alle Reagenzien, Behälter und Utensilien zu haben. RNAs-freie Behandlung von Glaswaren mit R-Nase-Inhibitoren wie RNA ZAP aus Amion, gefolgt von einer Spülung mit dpci-behandeltem Wasser, stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien als RNA-frei bestätigt werden. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, den Rippennukleoproteinkomplex aus der zellulären Lysat-Ernte exponentiell wachsender Gewebezellen zu gewinnen, um zwischen zwei und fünf Milligramm Gesamtprotein für jede verwendete Probe zu produzieren, normalerweise sind zwei P-1-50-Kulturschalen ausreichend.

Hier ernten wir MB 2, 31 und MC, sieben humane Brustkrebszelllinien und untersuchen die Ribon-Nukleo-Wechselwirkungen des RNA-bindenden Proteins. Für jedes untersuchte RNA-bindende Protein müssen die Gesamtzellzahl und die Proteinmengen optimiert werden, um die entsprechenden Wechselwirkungen zwischen Ziel-mRNA und RNA-bindendem Protein zu maximieren. Pelletzellen durch Zentrifugation bei 1000 U/min für etwa acht bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius, dann dreimal mit eiskaltem PBS waschen Nach dem letzten Waschen schnippen Sie vorsichtig mit dem Boden des Röhrchens und resuspendieren Sie das Zellpellet in gleichen Volumina des vorbereiteten polysomalen Lysepuffers mit RNAs und Proteaseinhibitoren.

Es wird empfohlen, das genaue Volumen des Zellpellets abzumessen, die Mischung vorsichtig zu pipettieren, um Zellklumpen aufzubrechen, und das Lysat fünf Minuten lang auf Eis zu inkubieren. Zentrifugieren Sie 20 Minuten lang bei 13.000 g bei vier Grad Celsius, um das Lysat von Rückständen zu befreien, und übertragen Sie den geklärten Überstand sofort auf vorgekühlte RNAs. Kostenlose Mikrozentrifugenröhrchen halten sich auf Eis und lagern bei minus 80 Grad Celsius.

Dieses Lysat kann bis zu sechs Monate bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Auftauzyklen, da dies zu einem Protein- und/oder mRNA-Abbau führen kann. Es ist am besten, die IP sofort zu machen.

Führen Sie eine schnelle Quantifizierung der Protein- und Lysatkonzentration mit einem Standard-Bradford-Proteinassay durch. Als nächstes müssen wir die Materialien für die Isolierung unseres spezifischen Proteins von Interesse vorbereiten. Erstes Pre-Swell-Protein.

Ein Sphero kügelt über Nacht in N NT zwei Puffer ergänzt mit 5%BSA bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie NT zwei Puffer im Verhältnis vier zu eins mit PAS-Kügelchen. Eine Langzeitlagerung von bis zu mehreren Monaten bei vier Grad Celsius ist möglich.

Wenn Sie vor der Verwendung mit 0,1 % Natriumazi ergänzt werden, entfernen Sie überschüssigen NT-Zwei-Puffer, so dass das endgültige Verhältnis von Kügelchen zu Puffer eins zu eins ist. Entfernen Sie mit 1,5 Millilitern RNA-freien Mikrozentrifugenröhrchen 100 Mikroliter SRO-Speed-Slurry und fügen Sie 30 Mikrogramm Antikörper für jede einzelne IP-Reaktion hinzu. In unserem Experiment verwenden wir zum Beispiel einen Wer-Antikörper, bei dem es sich um einen IgG-Antikörper der Maus handelt.

Daher ist unser Kontrollantikörper auch ein IgG-Antikörper. Als nächstes fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter NT-Zwei-Puffer zur Antikörper-Bead-Mischung hinzu. Zusätzlich sollte ein Isotyp-angepasster Antikörper oder ein ganzes normales Serum derselben Spezies parallel als Antikörperkontrolle gegen Hintergrund-RNA verwendet werden.

Fügen Sie den entsprechenden Antikörper zu einer Bead-Mischung hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht, wobei sie bei vier Grad Celsius eintaumelt. Bereiten Sie antikörperbeschichtete Kügelchen unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie die Kügelchen mit einem Milliliter eiskaltem NT und zwei Puffern fünfmal waschen, indem Sie bei 13.000 g für ein bis zwei Minuten bei vier Grad zentrifugieren. Überstand vorsichtig mit einer Handpipette oder einem Aspirator entfernen.

Dieses Waschen hilft, ungebundene Antikörper- und RNA-Verunreinigungen aus der Antikörpermischung zu entfernen. Sobald die letzte Wäsche abgeschlossen ist, werden die Kügelchen und 700 Mikroliter eiskalter T-Zwei-Puffer reanimiert, gefolgt von einer Behandlung mit verschiedenen RNAs-Inhibitoren, um die Ziel-mRNAs zu schützen, einschließlich 10 Mikroliter RNAs, 10 Mikroliter 100 millimolares DTT und 15 Mikroliter EDTA. Bringen Sie das Volumen mit NT zwei Puffer auf 900 Mikroliter.

Als nächstes werden wir den Zielkomplex immunpräzipitieren. Wir empfehlen dringend, einen Pre-Clear-Schritt zu verwenden, um das Hintergrundsignal in Ihrer RNA-Analyse nach dem Rip-Verfahren zu reduzieren: Pre-Clear mit 15 Mikrogramm Isotypkontrolle für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Fügen Sie 50 Mikroliter gequollene PAS-Kügelchen hinzu, die nicht mit Antikörpern beschichtet sind.

30 Minuten bei vier Grad Celsius mit Rotation inkubieren und darüber hinaus in der Zentrifuge bei 10.000 g bei vier Grad Celsius. Zwei Pellets. Speichern Sie das Super Natin für ip.

Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter isoliertes klares Lysat mit etwa zwei bis fünf Milligramm Protein zu einer vorbereiteten Antikörpermischung hinzu. Das Verdünnen von Lysat trägt dazu bei, den Hintergrund zu reduzieren, das Wickelrohr und das Paraform, um eine dichte Decke zu gewährleisten, und inkubiert bei vier Grad Celsius für vier Stunden und taumelt in den nächsten Pelletperlen bei 5.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und spart Supernat für die potenzielle Analyse, indem es bei minus 80 Grad Celsius gelagert wird, wie zuvor beschrieben. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit einem Milliliter eiskaltem und T zwei Puffern und zentrifugieren Sie sie.

Entfernen Sie dann Super Natin mit einer Handpipette oder einem Aspirator. Strengere Verfahren können verwendet werden, um den Hintergrund zu reduzieren, indem NT-Zwei-Puffer mit Natriumdesoxycoat, einer Uria oder SDS ergänzt wird. Bewahren Sie die Proben so weit wie möglich auf Eis auf und arbeiten Sie schnell, um den Abbau der Ziel-mRNA zu minimieren.

Schließlich werden wir DNA- und Proteinase-K-Behandlungen verwenden, gefolgt von RNA-Fällung, um die Ribon-Kernprotein-RNAs nach dem Waschen von Resuspendierungskügelchen mit 100 Mikrolitern N NT zu isolieren, zwei Puffer, ergänzt mit fünf Mikrolitern RNAs, freie DNAs, eins. Bewahren Sie die Proben fünf bis 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf. Fügen Sie einen Milliliter N NT mit zwei Puffern hinzu und schleudern Sie fünf Minuten lang bei 5.000 g.

Verwerfen Sie das SUPERNAT Reese-Spin-Protein, ein SRO-Pellet und 100 Mikroliter NT, zwei Puffer mit fünf Mikrolitern Proteinase K bei 10 Milligramm pro Milliliter und einem Mikroliter 10 % SDS, inkubieren Sie die resuspendierte Bead-Mischung 30 Minuten lang in einem 55 Grad Celsius heißen Wasserbad und schnippen alle 10 Minuten sanft. Proteinase K hilft bei der Freisetzung der Bestandteile des Rippennukleoproteins. Pellet-Perlen.

Fügen Sie 5.000 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzu und sammeln Sie den Supernamen, der etwa 100 Mikroliter Volumen haben sollte. Fügen Sie mit den nächsten zwei Kügelchen 200 Mikroliter NT mit zwei Puffern hinzu und erhitzen Sie zwei Minuten lang eine Zentrifuge von 5.000 g. Sammle etwa 200 Mikroliter Super Natin und entsorge die Kügelchen.

Kombinieren Sie Super Natin und fügen Sie 300 Mikroliter sauren Phenolwirbel der unteren Schicht hinzu. Eine Minute bei Raumtemperatur und eine Minute lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur zentrifugieren. Sammeln Sie 250 Mikroliter der oberen Schicht.

Seien Sie sehr vorsichtig, um die Schnittstelle nicht zu stören, da dies zu Verunreinigungen führt. In der RNA-Probe werden 25 Mikroliter Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,2, 625 Mikroliter gekühltes, 100%iges Ethanol und fünf Mikroliter Glykoblau-Mischung hinzugefügt. Gut über Nacht bei minus 20 Grad Celsius lagern.

Zusätzlich, um eine ordnungsgemäße Rückgewinnung der RNA zu gewährleisten. Die Zugabe von Glykoblau erhöht die Sichtbarkeit des RNA-Pellets, indem es am nächsten Tag als Trägermolekül fungiert, mischt die Röhrchen durch drei- bis fünfmaliges Umdrehen, dreht sich dann bei 12.000 G bei vier Grad Celsius für 30 Minuten und verwirft das Super-Natin. Geben Sie einen Milliliter gekühltes, 70%iges Ethanol zu dem blauen Pellet und mischen Sie es durch Inversions- oder Vortexzentrifuge.

Probe bei 12.000 g bei vier Grad Celsius für zwei Minuten. Supernat verwerfen und eine Minute lang bei 12.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Entfernen Sie alle Rückstände von 70 % Ethanol mit einer Pipette und trocknen Sie das Pellet an der Luft.

Fünf Minuten lang Raumtemperatur hinzufügen. Erneut ausgeben in 20 bis 40 Mikrolitern RNAs, DNA-freiem Wasser. Die Probe ist nun bereit für die Quantifizierung mittels NanoDrop-Spektrometrie und weitere nachgelagerte Anwendungen wie quantitative Echtzeit-PCR oder Microarray-Analyse nach RNA-Isolierung, Microarray und quantitative Echtzeit-PCR, um die mRNA-Ziele des RNA-bindenden Proteins, die vorhanden sind, und ihre daraus resultierende Anreicherung aus der Immunpräzipitation aufzudecken.

Die Bestätigung durch Western Blot zeigt eine saubere Isolierung dessen, wer Protein ist. Die quantitative PCR zeigt die Faltenanreicherung des mRNA-Ziels Beta-Aktin im Vergleich zu IgG-Kontrollen. Während die Microarray-Analyse einzigartige genetische Profile zwischen MC 7 und MB 2 31 zeigt, hat sich die Immunpräzipitation des Rippennukleoproteins der Brustkrebszelllinien insgesamt als hervorragendes Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-bindenden Proteinen und ihrer MR etabliert. Ein Ziel unserer Gruppe sowie vieler anderer Forschungsgruppen, obwohl es in Natur und Praxis empfindlich ist, wird die ordnungsgemäße Ausführung dieses Verfahrens zur Isolierung dieser Rippennukleoproteinkomplexe führen, die bis vor kurzem für Entdeckungen und Analysen unzugänglich waren.