Name: Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Ribonukleoprotein-Komplexen aus Zelllysaten mittels Immunpräzipitation. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer mRNA-Ziele von RNA-Bindeproteinen für die posttranskriptionelle Genregulation.

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Department of Defense (Idea Award W81XWH-07-0406) - Zum Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Um Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Um Ulus Atasoy University of Missouri Institutional Funds - Um Ulus Atasoy

Versuchsvorbereitung Vor Beginn Experiments ist es kritisch, alle Reagenzien, Behältern und Geräten RNase frei zu haben. Saures Glaswaren mit RNase-Inhibitor (RNaseZAP, Ambion) durch Spülen mit DEPC-behandeltem Wasser. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien wie RNase free bestätigt werden. Ein. Bereiten mRNP Lysate <ol><li> Züchten und zu ernten exponentiell wachsenden Gewebezellen zwischen 2-5 mg Gesamtprotein für jede RIP erzeugen. <ol class="lalpha"><li> Zwei P150 Kulturschalen sind in der Regel ausreichend. </li><li> Für jede RBP untersucht, müssen zelluläre Gesamt-Anzahl und Proteinmengen optimiert, um entsprechende Ziel-mRNA und RBP Wechselwirkungen zu maximieren. </li><li> RIP für qRT-PCR-Analyse erfordert möglicherweise weniger Zelllysat (ca. 400 pg Gesamtprotein) aufgrund seiner Amplifikation und Detektion Verfahren besonders für hohe Fülle RBPs wie HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Pellet-Zellen über Zentrifugation bei 200 xg für 8-10 min bei 4 ° C, dann dreimal mit eiskaltem PBS. </li><li> Nach dem letzten Waschen sanft Fingern an die Unterseite des Rohres und resuspendieren Zellpellet in gleichen Volumina von vorbereiteten Polysomen Lysepuffer (PLB) mit RNase und Proteaseinhibitoren. <ol class="lalpha"><li> Es wird empfohlen, zu messen, die genaue Volumen des Zellpellets. </li></ol></li><li> Gently Pipette Mischung (nicht vortexen) auseinander zu brechen Klumpen von Zellen und inkubieren Lysat auf Eis für 5 min. </li><li> Zentrifuge bei 13.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um das Lysat von Schutt zu löschen. </li><li> Sofortüberweisung Überstand gelöscht, um vorgekühlten Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Keep on ice und bei -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Sofortige Einfrieren rundet das richtige Lyse der Zellen und verhindert unerwünschte Bindung. Fahren Sie mit dem RIP sofort folgende Beispiel Tauwetter und halten Proben auf Eis RNA-Abbau zu vermeiden. &lt;/ Li&gt; <li> Das Lysat kann gelagert werden bis zu sechs Monaten bei -80 ° C. Vermeiden wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen, wie dies an Protein und / oder mRNA-Abbau führen kann. </li></ol></li><li> Quantifizieren Proteinkonzentration im Lysat unter Verwendung von Standard Bradford Protein Assay. </li></ol> 2. Coat Protein A Sepharose Beads mit Antikörper und Wash <ol><li> Pre-Protein A-Sepharose Dünung (PAS)-Perlen über Nacht in NT2 Puffer (3-4 Volumina) mit 5% BSA. Lagerung bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Langzeitlagerung von bis zu mehreren Monaten bei 4 ° C ist möglich, wenn mit 0,1% Natriumazid ergänzt. </li><li> Protein Sepharoseperlen sollte basierend auf Isotyp des Antikörpers RBP Target ausgewählt werden. Proteine ​​A, G und A / G haben alle spezifischen Isotyp Ziele und unterscheiden sich in Ziel-Affinität. Protein A-Sepharose Kügelchen wurden basierend auf Isotyp Spezifität und Affinität für Protein HuR Antikörper verwendet. </li></ol></li><li> Vor Gebrauch entfernen überschüssiges NT2-Puffer, sodass die endgültige Perlen Puffer beträgt 1:1. </li><li> Verwendung von 1,5 ml RNAse-frei Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen 100 ul PAS Aufschlämmung und stell 30 ug Antikörper für jede einzelne IP-Reaktion (dh spezifische RBP und Isotyp-Kontrolle). </li><li> Fügen 100-200 ul NT2 Puffer Antikörper Beadgemisch. <ol class="lalpha"><li> Gemisch kann für mehrere Wochen bei 4 ° C gelagert werden, wenn sie mit 0,1% Natriumazid ergänzt. </li><li> Ein Isotyp-passenden Antikörper oder ganzen normalen Seren von derselben Spezies sollten parallel als ein Antikörper gegen Hintergrund Steuerung RNA verwendet werden. </li></ol></li><li> Fügen entsprechenden Antikörper zu Wulst-Mix und über Nacht inkubieren, Tumbling Ende über Ende bei 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimieren Antikörpertiter für spezifische Protein untersucht (1, 5, 10 oder 30 ug Antikörper ist normalerweise ausreichend). </li></ol></li><li> Planen Antikörper-beschichteten Kügelchen unmittelbar vor der Verwendung durch Waschen mit 1 mleiskalter NT2-Puffer 5 mal. <ol class="lalpha"><li> Waschen Beadgemisch durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 1-2 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die maximale Menge an Überstandes mit Hand Pipette oder Aspirator aber vorsichtig sein, zu verhindern, dass Pellets. </li><li> Waschen hilft bei der Entfernung ungebundenen Antikörper sowie RNase Verunreinigungen von Antikörper-Gemisch. </li></ol></li><li> Nach der letzten Wäsche abgeschlossen wurde, resuspendieren die Perlen in 700 ul eiskaltem NT2 Puffer durch Behandlung mit verschiedenen RNase-Inhibitoren gefolgt, um die Ziel-mRNAs, einschließlich 10 ul RNase Out bei 40 U / ul, 10 ul 100 mM zu schützen DTT und 15 ul EDTA (15 mM). Bringt Volumen 1.000 ul mit NT2 Puffer. <ol class="lalpha"><li> Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe werden nicht verwendet aufgrund Hemmwirkung von EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Immunpräzipitation und RNA Niederschlag <ol><li> Optional Preclear Schritt:<ol class="lalpha"><li> In den Hintergrund zu reduzieren, können Perlen und Kontroll-Antikörper vor, klare Lysat verwendet werden. Dies kann die Signal in der Ausgabe. </li><li> Dieser Schritt kann es notwendig sein Hintergrund zu reduzieren, wenn dabei IP mittels Microarray gefolgt. Es ist im Allgemeinen nicht notwendig, IP mittels qRT-PCR gefolgt. </li><li> Preclear mit 15 ug Isotypenkontrolle für 30 min / 4 ° C Taumeln Ende über Ende. </li><li> Fügen Sie 50 ul vorgequollenen PAS Perlen nicht mit Antikörper beschichtet ab Schritt 2,1. </li><li> Inkubieren 30 min / 4 ° C unter Rotation Ende über Ende </li><li> Zentrifugieren bei 10000 × g bei 4 ° C. Speichern Überstand für IP. </li></ol></li><li> Fügen Sie 100 ul der isolierten geklärte Lysat (ca. 2-5 mg) auf vorbereitete Antikörper-Mix. <ol class="lalpha"><li> Verdünnen Lysat wird dazu beitragen, Hintergrund und unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> Anzahl der Lysat-Eingang kann je nach Nachweismethode und Fülle von RBP or Effizienz der RBP Antikörper, wie in Schritt 1.1.c. beachten </li></ol></li><li> (Optional) sofort mischen Rohr durch leichtes flicking mehrfach durch kurze Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4 ° C bis Pellet Perlen und umgehend entfernen 100 ul des Überstandes als Gesamteingangsleistung mRNA Darstellung für qPCR Analyse unter Verwendung von Standard-Techniken RNA-Isolierung. <ol class="lalpha"><li> Dieser Schritt ist zu bestätigen, dass Eingangs-Lysat RNA ist optimal für IP und sollte nur als Prüfschritt oder als Schritt zur Problembehandlung nach RIP mit schlechter RNA Ergebnisse durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Wrap Rohr in Parafilm eindeutige Abdichtung und Inkubieren bei 4 ° C für 2 bis 4 Stunden zu gewährleisten, Taumeln Ende über Ende. <ol class="lalpha"><li> Timing der Inkubation sollte basierend auf dem Soll Fülle optimiert werden und sollte minimiert werden, um komplexe Umlagerung oder Zersetzung zu vermeiden. Für einige RBPs kürzere Inkubationen kann mehr optimal. </li></ol></li><li> Pellet Perlen bei 5.000 xgfoder 5 min bei 4 ° C und bis auf Potenzialanalyse Überstand durch Western blot. Shop Aliquots bei -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Aliquote des Überstandes mit hohen Mengen an restlichem Zielprotein kann auf ein Versagen des Proteins durch Sepharosebeads ausgefällt werden. </li></ol></li><li> Wie zuvor beschrieben, zu waschen Perlen 5 mal mit 1 ml eiskaltem NT2 Puffer und Zentrifugation (5.000 × g für 5 min bei 4 ° C) und dann mit der Hand zu entfernen Pipette oder einem Aspirator Überstand. <ol class="lalpha"><li> Strengere Waschverfahren kann verwendet werden, um Hintergrund durch Ergänzung NT2 Puffer mit Natriumdeoxycholat, Harnstoff oder SDS verringern. </li><li> Die Proben auf Eis so viel wie möglich und arbeiten schnell, um den Abbau der Ziel-mRNA zu minimieren. </li></ol></li><li> Optional: Speichern eines kleines Aliquot (10%) der Beadgemisch oder führen eine zusätzliche Probe parallel zur Kontrolle der Effizienz von IP Zielprotein mittels Western Blot-Analyse.</li></ol> 4. DNase und Proteinase K Behandlungen <ol><li> Nach dem Waschen resuspendieren Perlen mit 100 ul NT2-Puffer mit 5 ul RNase-freie DNase 1 (2 U / ul) ergänzt. </li><li> Halten bei 37 ° C für 5-10 min. 1 ml NT2 Puffer und Zentrifuge bei 5.000 xg für 1 min bei Raumtemperatur. <ol class="lalpha"><li> Eine kleine (~ 10%) Aliquot von Perlen verwendet werden, um die IP-Effizienz durch SDS-PAGE-Analyse zu überprüfen. </li></ol></li><li> Resuspendieren PAS Pellet in 100 ul NT2-Puffer, 5 ul Proteinase K (10 mg / ml) und 1 ul 10% SDS. </li><li> Inkubieren der resuspendierten Kügelchen Mischung für 30 min bei 55 ° C in einem Wasserbad leicht auf jeder flicking 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinase K wird in der Veröffentlichung der RNP-Komponenten unterstützen. </li></ol></li><li> Pellet Perlen bei 5.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und den Überstand (~ 100 ul). </li><li> Fügen Sie 200 ul NT2 Puffer Perlen, Zentrifugenfuge 5.000 xg für 2 min bei RT, sammeln Überstand (~ 200 ul) und discard Perlen. </li><li> Kombinieren Überstände (100 ul und 200 ul) und 300 ul untere Schicht der Säure Phenol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (oder 37 ° C im Shaker) und Zentrifuge bei 16.000 xg bei RT für 1 min. </li><li> Sammeln Sie 250 ul der oberen Schicht (nicht stören Schnittstelle), fügen Sie 25 ul Natriumacetat bei pH 5,2, 625 ul 100% EtOH und 5 ul glycoblue und gut mischen. </li><li> Bewahren Sie über Nacht bei -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Um eine einwandfreie Rückgewinnung der RNA zu gewährleisten, wird die Zugabe von glycoblue die Sichtbarkeit des RNA-Pellet, indem sie als Träger-Molekül zu erhöhen. </li></ol></li><li> Am folgenden Tag Spin Mischung Rohre durch Inversion 3-5 mal, bei 12.000 × g bei 4 ° C für 30 min und der Überstand verworfen. </li><li> 1 ml 70% EtOH auf die blaue Pellet und mischen durch Umdrehen oder Vortexen. </li><li> Zentrifuge 12.000 × g bei 4 ° C für 2 min. </li><li> Discard Überstand abzentrifugieren und 12.000 × g für 1 Minute bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie alle verbleibenden 70% EtOH mit einer Pipette und an der Luft trocknen Pellet bei RT für 5 min. </li><li> Resuspendieren in 20-40 ul RNase / DNase-freiem Wasser oder einem anderen geeigneten Volumen benötigt. <ol class="lalpha"><li> Probe ist nun bereit für weitere Downstream-Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray. </li><li> Nanodrop Spektrophotometrie kann bei der Beurteilung Probenkonzentration verwendet werden, jedoch mit wertvollen Proben kann es von Vorteil sein, nanodropping Proben zu vermeiden, da es sein kann, verschwenderisch und relativ ungenau. Wir schlagen vor, die Normalisierung Proben Housekeeping-Gen-Transkripte auf Reinheit und IP Effizienz für Edelsteine ​​oder geringe Ausbeute Proben zu beurteilen. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Wenn das Verfahren optimiert und richtig ausgeführt, sollte der Immunpräzipitation ergeben signifikante Anreicherung von mRNA Ziele. Typisch, Abhängig von der RBP und seine mRNA Target (s), so sehen wir die Anreicherung von etwa 10 - bis 50-fache, wenn sie durch qRT-PCR untersucht. Viele Ziele RBPs kann en masse entdeckt werden mittels Microarray-Analyse. Jedoch ist dieses Verfahren anfällig für Degradation wie bei qRT-PCR verglichen. Abhängig von der RBP, die Anzahl von Zielen und den Wirkungsgrad der Reaktion kann Mikroarray offenbaren hunderte neuer Targets, oder es kann nur ein paar zu entdecken, wenn überhaupt. Beispielsweise einer der besseren dadurch RNA-Bindeproteinen HuR, post-transkriptionell reguliert die Expression und Translation von Genen viele wichtige physiologische 1, 2. Isolierung des HuR-ribonucleo-Komplexes mittels RIP-Chip in Brustkrebs-Zelllinien, beispielsweise offenbart Anreicherung von mehreren wichtigen bekannten HuR Ziele, einschließlich β-Actin-PCR unter Verwendung qRT wie in Abbildung 1 gezeigt. In beiden Krebszelllinien β-Aktin 12 angereichert - bis 15-fache. Normalerweise, wenn richtig durchgeführt sehen wir eine deutliche enrichment von β-Aktin in einer Vielzahl von Zelllinien. Allerdings, wenn die RIP nicht verraten keinen wesentlichen Bereicherung für β-Aktin deutet auf ein Problem mit dem RIP und das Verfahren kann wiederholt werden muss. Außerdem ergab Mikroarray-Analyse von immunpräzipitierten Proben aus diesen Zellinien deutliche Expression Teilmengen HuR Targets in verschiedenen Östrogenrezeptor (ER) positiven MCF-7 Krebszellen gegenüber ER negativen MB-231 Brustkrebs-Zelllinien, wie in 2 gezeigt, ein. Diese Ziele lassen sich in mehrere Kategorien: bekannte und unbekannte HuR Ziele, die entweder verbunden waren oder nicht im Zusammenhang mit Krebs. Zum Beispiel sind sowohl CALM2 und CD9 Krebsgene die nicht zuvor als HuR Targets identifiziert. Verwendung des Mikroarrays und Bestätigung mit qRT-PCR, CALM2 und CD9 erwiesen sich 5 - bis 180-fache in HuR Pellet angereichert, die eine Wechselwirkung zwischen dem prominenten HuR Protein und dieser Zielgene. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Abbildung 1&quot; /&gt; Abbildung 1. Immunpräzipitation und RIP in MB-231 (ER-) und MCF-7 (ER +) Brustkrebszellen. Immunpräzipitationen wurden von MB-231 oder MCF-7 Zelllysaten unter Verwendung von Anti-HuR monoklonalen Antikörper (3A2) und IgG1 Isotyp-Kontrolle. A. IP Western of HuR zeigte erwartete Größe band von 3A2 erkannt. Panel auf der rechten Seite zeigt Mengen von HuR im Eingang Lysate aus beiden Zelllinien verwendet, mit β-Tubulin als Ladekontrolle. B. Überprüfung durch quantitative RT-PCR zeigte fünfzehn und elf-fache Anreicherung von β-Aktin, ein bekannter HuR Ziel, in den 3A2 IPs von MB-231 und MCF-7, bzw.. Alle ΔΔCT Werte wurden auf GAPDH normalisiert. Experimente wurden in doppelter Ausführung (n = 2) erfolgt. <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. HuR RIP-CHIP identifiziert verschiedene genetische Profile in ER + und ER-Brustkrebszellen.HuR Immunpräzipitationen wurden von MB-231 MCF-7 oder Zelllysaten unter Verwendung HuR Antikörper und IgG1 Isotyp-Kontrolle hybridisiert Illumina Sentrix Arrays (47.000 Gene) durchgeführt. Steuersignale wurden abgezogen. Die Ergebnisse stellen die kumulativen Daten aus 12 verschiedenen Arrays. Experimente wurden in dreifacher Ausführung (n = 3) für jede Zelllinie mit passenden Kontrollen durchgeführt. Waagen sind log2.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Aufgrund der Natur dieses Experiments, Optimierung und Erfahrung wird die einzigen Möglichkeiten, um erfolgreich gewährleistet beschaffen die beabsichtigten Ergebnisse sein. In vielen Schritte dieses Verfahrens sind die Temperatur und effiziente Handhabung der Reagenzien und Produkte von entscheidender Bedeutung. Die richtige Planung und Ausführung der Technik wird dazu beitragen, sicherzustellen, dass das Experiment innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens an den optimalen Temperaturen empfohlen wurde durchgeführt. Ein Hauptproblem mit RNA Isolation Experimenten ist die Empfindlichkeit von RNAs den Abbau durch RNasen. Alle Reagenzien müssen RNase frei und gelagert oder verwendet in RNase-freiem Container sein. Dies ist ein entscheidender Schritt bei der Sicherstellung der Integrität Ihrer mRNA Probe. Selbst wenn das Experiment korrekt durchgeführt wird, kann jedoch das gewünschte Ergebnis nicht durch die Art der Wechselwirkung zwischen dem RBP und seiner Ziel-mRNAs erreicht werden. Ein potentielles Problem wird mit einer geringen oder gar kein Signal von der RNA durch die RIP-Chip isoliert.Obwohl es Signals von Gesamt-RNA sein kann, kann dies das Ergebnis einer unzureichenden Bindungsprotein ist heruntergezogen werden, die Perlen sein. Der erste Schritt bei der Fehlerbehebung ist zu bestätigen, dass die zelluläre Lysat verwendet adäquaten Ausdruck der spezifischen RBP hat. Nach Bestätigung kann Protein nach der endgültigen NT2 Waschen isoliert werden gewaschen und in Laemmli-Puffer oder einer anderen geeigneten denaturierenden Puffer und erhitzt bei 95 ° C für 5 min. Western-Blot-Analyse kann an diesen Proben in Koordination mit Eingangs Lysat sowie negative Kontrollen verwendet werden, um eine ausreichende Pulldown von assoziierten Protein. Darüber hinaus, weil Lysieren der Zelle ist erforderlich, um diese Komponenten zugreifen zu können, kann das Potential für abnorme und unerwünschte Wechselwirkungen zwischen normalerweise getrennten Proteine ​​und mRNA eingeführt werden. Diese Interaktionen könnten binden und &quot;tanken&quot; Ihre Ziel-mRNAs oder Proteine ​​durch unspezifische Wechselwirkungen. Zusätzlich Proteine ​​in diesen unterschiedlichen conditions kann in mehreren Varianten falten und ihre Bindungsmotive kann nicht zugegriffen werden, um ihre Ziel-mRNAs, die Verhinderung ihrer Wechselwirkungen. Beide stärken die Bedeutung der Zusammenarbeit effizient als auch die Nutzung der optimalen Temperaturen aufgeführt, um diese unerwünschte Wechselwirkungen zu begrenzen. Darüber hinaus wird die Optimierung der Waschbedingungen für jeden spezifischen Zielproteins kritisch sein, um die Reinheit der Wechselwirkung maximieren. Mehr stringenten Waschbedingungen erforderlich sein. Zum Beispiel kann der Waschpuffer mit SDS oder einer entsprechenden Menge an Harnstoff um unspezifische Wechselwirkungen und Hintergrund im Signalausgang reduzieren ergänzt werden. Dies wird völlig abhängig von der angestrebten Experimentator RBP sowie die Ziel-mRNA in ihrer einzigartigen physiologischen Bedingungen. Einige Bedingungen nicht geeignet sein für bestimmte mRNA-Analyse-Tools, die zur Vorbereitung von Proben von Bedeutung. Schließlich, obwohl RIP ist bei der Anreicherung von RNA erfolgreiche-RBP Interaktionen, ein gut bekanntes Problem mit RIP (CHIP)-Methode ist die Unfähigkeit, die spezifischen bindenden Domänen des RBP auf die vorübergehende mRNA Targets zu identifizieren. Mehrere Vernetzung Techniken können durch RIP einzigartige Sequenz Ziele zu isolieren verwendet befolgt werden, allerdings neigt die Verwendung von kurzwelligem UV-auf Nukleinsäure-Schäden führen. Ein neues Verfahren PAR-CLIP oder photoaktivierbaren Ribonukleosid Vernetzen und immuoprecipitation bekannt beschäftigt langwelligen UV bis in Thiouridin naszierende RNA, die eine Identifizierung der eindeutigen Bindungsstellen von sowohl stabil als auch transient RNA-Wechselwirkungen zu integrieren. Insgesamt hat RIP-Chip als hervorragendes Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-bindende Proteine ​​und ihre mRNA Zielsetzungen unserer Gruppe sowie viele andere Forschergruppen etabliert. Obwohl sensible Natur und Praxis wird ordnungsgemäße Durchführung dieses Verfahrens ergeben die Isolierung dieser RNP-Komplexe, die bis vor kurzem INACC habenessible für die Entdeckung und Analyse.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1 M Dithiothreit </td><td> Fischer </td><td> BP172-5 </td><td> DTT </td></tr><tr><td> DNase 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNase-frei </td></tr><tr><td> Ethylendiamin Tetraccetic Säure </td><td> Fischer </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> Glykogen </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Fischer </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Fischer </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Unten finden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polysom ​​Lysis Buffer </td><td> * Unten finden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Protein A-Sepharose Kügelchen </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Fischer </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> RNase Out RNase Inhibitor </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / ul </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Fischer </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Fischer </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Fischer </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Vanadyl-Ribonucleosid-Komplexe </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reagent Aufarbeitung </td></tr><tr><td> Planen Reagenzien in RNase / DNase-frei, DEPC behandeltem Glaswaren </td></tr><tr><td> Polysomen Lysepuffer </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 Einheiten / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 400 uM VRC </td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor-Cocktail Tablette </td></tr><tr><td> 5 ml Lysepuffer Polysomen </td></tr><tr><td> Fügen Sie 50 ul 1 M HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 ul 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 ul 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 ul NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml RNase-DNase-freie H 2 O </td></tr><tr><td> 50 ul 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 ul 100 U / ml RNase Out </td></tr><tr><td> 200 ul Protease-Inhibitor-Cocktail (gelöst laut Hersteller) </td></tr><tr><td> 10 ul 200 mM VRC (zum Zeitpunkt der Verwendung) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% NP40 </td></tr><tr><td> 1 l Puffer NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml 5 M NaCl </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 ul NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml RNase-DNase-freie H 2 O </td></tr></tbody></table>

verfahren zur isolierung und identifizierung von mrnas, micrornas und protein-komponenten des ribonucleoprotein komplexe aus zellextrakten mit rip-chip

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Als Folge der Entwicklung von High-Throughput-Sequenzierung und effiziente Mikroarray-Analyse hat die globale Genexpressionsanalyse sich eine einfache und leicht zugängliche Form der Datenerfassung. In vielen Forschungs-und Krankheitsmodelle jedoch nicht steady state Ebenen der Zielgen-mRNA nicht immer direkt mit steady state Protein-Spiegel korrelieren. Post-transkriptionelle Genregulation ist eine wahrscheinliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen den beiden. Angetrieben durch die Bindung von RNA-bindende Proteine ​​(RBP), wirkt posttranskriptionale Regulierung mRNA Lokalisierung, Stabilität und Translation durch Bilden einer Ribonucleoprotein (RNP)-Komplex mit Ziel-mRNAs. Identifizierung dieser unbekannten de novo mRNA Targets aus Zellextrakten in der RNP-Komplex schwenkbar ist, um das Verständnis Mechanismen und Funktionen des RBP und deren resultierende Wirkung auf die Protein-Ausgang. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren genannt RNP Immunpräzipitations-Mikroarray (RIP-Chip), die für die Identifizierung von s ermöglichtpezifische mRNAs in der Ribonukleoproteinkomplex verbunden sind, unter wechselnden experimentellen Bedingungen, zusammen mit Optionen weiter zu optimieren, um ein Experiment für den einzelnen Forscher. Mit diesem wichtigen experimentelles Werkzeug, können die Forscher erkunden die komplizierten Mechanismen mit post-transkriptionellen Genregulation sowie andere ribonucleoprotein Wechselwirkungen verbunden.

Eine Schritt für Schritt-Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von RNA assoziiert Komplexe durch RIP-Chip.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

Infolge der Entwicklung des Hochdurchsatz-Sequenzierens und einer effizienten Microarray-Analyse ist die globale Genexpressionsanalyse zu einer einfachen und ...

Das Ziel dieses Videos ist es, die Methode zur Isolierung und Identifizierung von RNA- und Proteinbestandteilen ribonukleoproteiner Komplexe aus Zelllysaten mittels Immunpräzipitation zu demonstrieren. Hallo, mein Name ist Garrett Dom und ich bin Doktorand in der Abteilung für Molekularbiologie, Mikrobiologie und Immunologie an der University of Missouri, wo ich unter der Betreuung von Dr. Eli Sso forsche. Durch die Fortschritte in der Hochdurchsatzsequenzierung und der effizienten Microarray-Analyse ist die globale Genexpressionsanalyse zu einer einfachen und leicht verfügbaren Form der Datenerhebung in vielen Forschungs- und Krankheitsmodellen geworden.Allerdings korrelieren die Stufen der mRNA des Zielgens nicht immer direkt mit den Proteinmengen im Gleichgewichtszustand. Eine posttranskriptionelle Genregulation ist eine wahrscheinliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen beiden. Verursacht durch die Wechselwirkungen von RNA-bindenden Proteinen.Die posttranskriptionale Regulation beeinflusst die mRNA-Lokalisation, -Stabilität und -Translation, indem sie einen ribonukleoproteinkomplex mit Ziel-mRNAs bildet. Die Identifizierung dieser unbekannten de-novo-mRNA-Ziele aus zellulären Extrakten innerhalb dieses Komplexes ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen und Funktionen des RNA-bindenden Proteins sowie dessen resultierender Auswirkungen auf die Proteinausbeute. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die als Ribo-Protein-Immuno-Präzipitation oder RIP bezeichnet wird und die Identifizierung spezifischer mRNAs ermöglicht, die im Ribonukleoproteinkomplex assoziiert sind.Bevor das Experiment beginnt, ist es entscheidend, alle Reagenzien, Behälter und Utensilien bereitzuhalten. Behandeln Sie gläserne Geräte, die RNA-frei sein sollen, mit einem RNase-Inhibitor wie RNA ZAP von Ambion und spülen Sie sie anschließend mit DPCI-behandeltem Wasser ab. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien als RNA-frei bestätigt sind. Der erste Schritt des Verfahrens besteht darin, den ribonukleoproteinkomplex aus dem zellulären Lysat zu gewinnen. Dazu werden exponentiell wachsende Gewebezellen geerntet, um für jede Probe zwei bis fünf Milligramm Gesamtprotein zu erhalten. Üblicherweise sind zwei P150-Kulturschalen ausreichend.Hier ernten wir die menschlichen Brustkrebszelllinien MB 2 31 und MC seven und untersuchen die Ribonukleo-Interaktionen des RNA-bindenden Proteins. Dabei ist zu beachten, dass für jedes untersuchte RNA-bindende Protein die Gesamtzellzahl und Proteinkonzentration optimiert werden müssen, um die Wechselwirkungen zwischen dem entsprechenden Ziel-mRNA und dem RNA-bindenden Protein zu maximieren. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 U/min für etwa acht bis 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um sie zu pelletieren, und waschen Sie sie anschließend dreimal mit eiskaltem PBS. Nach dem letzten Waschschritt klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des Röhrchens und resuspendieren das Zellpellet in gleichen Volumina des vorbereiteten Polysomen-Lysepuffers mit RNasen- und Proteaseinhibitoren.Es wird empfohlen, das exakte Volumen des Zellpellets abzumessen, vorsichtig pipettieren, um Zellklumpen aufzubrechen, und das Lysat fünf Minuten auf Eis zu inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 13.000 ×g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Lysat von Zelltrümmern zu befreien, und überführen Sie das klare Überstand sofort in vorab gekühlte RNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen. Diese auf Eis halten und bei minus 80 Grad Celsius lagern.Dieses Lysat kann bis zu sechs Monate bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden. Wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen sollten vermieden werden, da sie zu einer Degradation von Proteinen und/oder mRNA führen können. Es ist am besten, die Immunpräzipitation unmittelbar durchzuführen.Führen Sie eine schnelle Quantifizierung der Proteinkonzentration und des Lysats mit einem standardmäßigen Bradford-Protein-Assay durch. Als Nächstes müssen wir die Materialien zur Isolierung unseres spezifischen Zielproteins vorbereiten. Quellen Sie zunächst das Protein vor. Sphero-Perlen über Nacht in NT2-Puffer mit 5 % BSA ergänzt bei vier Grad Celsius lagern. Verwenden Sie NT2-Puffer im Verhältnis vier zu eins mit PAS-Perlen. Eine Langzeitlagerung von bis zu mehreren Monaten bei vier Grad Celsius ist möglich.Wenn vor der Verwendung mit 0,1 % Natriumazid versetzt, entfernen Sie überschüssiges NT2-Puffer, sodass das endgültige Verhältnis von Kügelchen zu Puffer eins zu eins beträgt. Verwenden Sie 1,5-Milliliter-RNA-freie Mikrozentrifugenröhrchen, entnehmen Sie 100 Mikroliter SRO-Speed-Slurry und geben Sie 30 Mikrogramm Antikörper pro einzelne IP-Reaktion hinzu. Beispielsweise verwenden wir in unserem Experiment einen Who-are-Antikörper, der ein Maus-IgG1-Antikörper ist.Daher ist auch unser Kontrollantikörper ein IgG. Als Nächstes geben Sie 100 bis 200 Mikroliter NT2-Puffer zur Antikörper-Perlen-Mischung hinzu. Zusätzlich sollte parallel ein isotyp-matcher Antikörper oder normales Serum des gleichen Tierstamms als Antikörperkontrolle gegen Hintergrund-RNA verwendet werden.Fügen Sie den geeigneten Antikörper zur Bead-Mischung hinzu und inkubieren Sie über Nacht unter Schütteln bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie die mit Antikörper beschichteten Beads unmittelbar vor der Verwendung vor, indem Sie sie fünfmal mit je einem Milliliter eiskaltem NT2-Puffer waschen; waschen Sie die Beads durch Zentrifugation bei 13.000 × g für ein bis zwei Minuten bei vier Grad. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer manuellen Pipette oder einem Aspirator.Dieses Waschen hilft, ungebundene Antikörper sowie RNA-Kontaminanten aus der Antikörperlösung zu entfernen. Sobald der letzte Waschschritt abgeschlossen ist, resuspendieren Sie die Perlen in 700 Mikrolitern eiskaltem T2-Puffer und geben anschließend verschiedene RNA-Inhibitoren zur Schutz der Ziel-mRNAs hinzu, darunter 10 Mikroliter RNAs, 10 Mikroliter 100 Millimolar DTT und 15 Mikroliter EDTA. Stellen Sie das Volumen mit NT2-Puffer auf 900 Mikroliter ein.Anschließend werden wir den Zielkomplex immunpräzipitieren. Wir empfehlen dringend die Verwendung eines Vorklärschritts, um das Hintergrundsignal in Ihrer RNA-Analyse nach dem RIP-Verfahren zu reduzieren; führen Sie den Vorklärschritt mit 15 Mikrogramm Isotypkontrolle 30 Minuten bei vier Grad Celsius durch. Geben Sie 50 Mikroliter vorquellende PAS-Beads, die nicht mit Antikörper beschichtet sind, hinzu.30 Minuten bei vier Grad Celsius unter Rühren inkubieren und anschließend in der Zentrifuge bei vier Grad Celsius mit 10.000 G zentrifugieren. Zwei Pellets erhalten. Das Überstand für IP aufbewahren.Fügen Sie anschließend 100 Mikroliter des isolierten, geklärten Lysats mit etwa zwei bis fünf Milligramm Protein der vorbereiteten Antikörpermischung hinzu. Das Verdünnen des Lysats hilft, die Hintergrundreaktion zu verringern. Wickeln Sie das Gefäß mit Parafilm ab, um einen dichten Verschluss zu gewährleisten, und inkubieren Sie es vier Stunden lang bei vier Grad Celsius unter Rütteln. Zentrifugieren Sie anschließend das Pellet fünf Minuten lang bei 5.000 × g und vier Grad Celsius und heben Sie das Überstandsvolumen für eine mögliche Analyse auf, indem Sie es bei minus 80 Grad Celsius lagern, wie zuvor beschrieben. Waschen Sie die Kügelchen fünfmal mit je einem Milliliter eiskaltem T2-Puffer unter Zentrifugation.Entfernen Sie anschließend den Überstand mit einer manuellen Pipette oder einem Aspirator. Um den Hintergrund zu verringern, können strengere Methoden angewendet werden, indem dem NT2-Puffer Natriumdesoxycholat, Harnstoff oder SDS zugesetzt wird. Halten Sie die Proben so oft wie möglich auf Eis und arbeiten Sie schnell, um den Abbau der Ziel-mRNA zu minimieren.Schließlich verwenden wir DNA- und Proteinase-K-Behandlungen, gefolgt von einer RNA-Fällung, um die ribonukleären Protein-RNAs zu isolieren, nachdem die Beads mit 100 Mikrolitern N NT zwei Puffer, ergänzt mit fünf Mikrolitern RNAs-freiem DNAs ein, gewaschen und resuspendiert wurden. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für fünf bis 10 Minuten. Geben Sie ein Milliliter N NT zwei Puffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 5.000 ×g für fünf Minuten.Verwerfen Sie das Überstand-REES-Spin-Protein und das Pellet der SROs und geben Sie 100 Mikroliter NT2-Puffer mit fünf Mikrolitern Proteinase K (10 Milligramm pro Milliliter) und einem Mikroliter 10 % SDS hinzu. Inkubieren Sie die resuspendierte Perlenmischung 30 Minuten lang in einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad, wobei Sie alle 10 Minuten vorsichtig schwenken. Die Proteinase K unterstützt die Freisetzung der ribonukleoproteinhaltigen Komponenten. Zentrifugieren Sie die Perlen ab.Zentrifugieren Sie mit 5.000 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur und sammeln Sie den Überstand, dessen Volumen etwa 100 Mikroliter betragen sollte. Geben Sie als Nächstes zwei Perlen in 200 Mikroliter NT2-Puffer und zentrifugieren Sie bei 5.000 × g für zwei Minuten. Sammeln Sie anschließend ungefähr 200 Mikroliter des Überstands und entsorgen Sie die Perlen.Vereinigen Sie Super Natin und geben Sie 300 Mikroliter saure Phenol-Unterschicht hinzu, mischen Sie kurz im Vortex. Eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren und dann eine Minute bei Raumtemperatur mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. Sammeln Sie 250 Mikroliter der oberen Schicht.Seien Sie sehr vorsichtig, um die Grenzfläche nicht zu stören, da dies eine Kontamination verursachen würde. Geben Sie zum RNA-Probe 25 µL Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5,2, 625 µL gekühlten 100 %igen Ethanol und 5 µL GlycoBlue hinzu und mischen Sie gut. Lagern Sie über Nacht bei minus 20 Grad Celsius. Zusätzlich, um eine ordnungsgemäße Rückgewinnung der RNA sicherzustellen. Die Zugabe von GlycoBlue erhöht die Sichtbarkeit des RNA-Pellets, indem es als Trägermolekül wirkt; am folgenden Tag die Röhrchen durch dreimaliges bis fünfmaliges Umstülpen mischen, dann bei 12.000 × g und vier Grad Celsius 30 Minuten lang zentrifugieren und das Überstand entfernen. Ein Milliliter gekühlter 70 %iger Ethanol wird dem blauen Pellet zugegeben und durch Umstülpen oder Vortexen gemischt, anschließend zentrifugieren.Probe bei 12.000 G bei vier Grad Celsius für zwei Minuten zentrifugieren. Überstand verwerfen und erneut bei 12.000 G für eine Minute bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Reste von 70 % Ethanol mit einer Pipette entfernen und das Pellet lufttrocknen.Fügen Sie Raumtemperatur fünf Minuten lang hinzu. Wieder in 20 bis 40 Mikroliter RNAse-, DNA-freiem Wasser suspendieren. Die Probe ist nun bereit zur Quantifizierung mittels NanoDrop-Spektrometrie und weiteren downstream-Anwendungen wie der quantitativen Echtzeit-PCR oder Microarray-Analyse. Nach RNA-Isolierung, Microarray und quantitativer Echtzeit-PCR wurden die mRNA-Ziele des RNA-bindenden Proteins who are und deren resultierende Anreicherung aus der Immunpräzipitation ermittelt.Die Bestätigung durch Western Blot zeigt eine saubere Isolierung des gesuchten Proteins. Die quantitative PCR demonstriert die Anreicherung des mRNA-Ziels Beta-Aktin im Vergleich zu IgG-Kontrollen. Während die Microarray-Analyse eindeutige genetische Profile zwischen den Brustkrebszelllinien MC7 und MB231 aufzeigt, hat sich die ribonukleoproteinspezifische Immunpräzipitation insgesamt als hervorragendes Werkzeug zur Isolierung und Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen RNA-bindenden Proteinen und ihren mRNA-Zielsequenzen etabliert – sowohl in unserer Gruppe als auch in vielen anderen Forschungsgruppen. Obwohl dieses Verfahren von Natur aus sensibel ist, führt eine korrekte Durchführung zu einer Isolierung dieser Ribonukleoprotein-Komplexe, die bis vor Kurzem für Entdeckung und Analyse unzugänglich waren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Dieses Manuskript beschreibt einen Ansatz zur Isolierung ausgewählter verwandter RNPs, die in eukaryotischen Zellen gebildet werden, durch eine spezifische Oligonukleotid-gerichtete Anreicherung. Wir demonstrieren die Anwendbarkeit dieses Ansatzes, indem wir ein verwandtes RNP isolieren, das an die retrovirale 5'-untranslatierte Region gebunden ist, die aus DHX9/RNA-Helikase A besteht.

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RNA-Protein-Wechselwirkungen sind das Herzstück vieler zellulärer Prozesse. Hier beschreiben wir eine in vivo Methode, um spezifische RNA zu isolieren und neue Proteine zu identifizieren, die mit ihr assoziiert sind. Dies könnte ein neues Licht darauf werfen, wie RNAs in der Zelle reguliert werden.

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Ein Tandem RNA Isolierung (Reise) für die Verwertung von endogen gebildeten mRNA-Protein-komplexe Vorgehensweise wird. Speziell, RNA-Protein-komplexe sind vernetzt in VivoPolyadenylated RNAs sind isoliert aus Extrakten mit oligo(dT) Perlen und besonderen mRNAs werden mit modifizierten RNA antisense Oligonukleotide erfasst. Proteine gebunden, mRNAs werden vom Immunoblot Analyse erkannt.

Ein Oligonukleotid-basierte Tandem RNA Isolierung Vorgehensweise eukaryotischen mRNA-Protein-komplexe

Ein detailliertes Protokoll zur Anwendung der Klick Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie um Proteine binden beide Codierung und Forensisches identifizieren RNAs wird vorgestellt.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

Hier beschreiben wir eine schrittweise Strategie zur Isolierung kleiner RNAs, zur Anreicherung von microRNAs und zur Vorbereitung von Proben für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz. Anschließend wird beschrieben, wie Sequenzlesevorgänge verarbeitet und mithilfe von Open-Source-Tools an microRNAs ausgerichtet werden.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anreicherung endogener RNA-Bindungsstellen oder "Footprints" von RNA:Protein(RNP)-Komplexen aus Säugetierzellen vor. Dieser Ansatz umfasst zwei Immunpräzipitationen von RNP-Untereinheiten und wird daher als RNA-Immunpräzipitation im Tandem (RIPiT) bezeichnet.

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

Hier beschreiben wir die Immunpräzipitation von Ribosomen und zugehöriger RNA aus ausgewählten Populationen erwachsener männlicher Mauskeimzellen mit dem RiboTag-System. Strategische Züchtung und sorgfältige Immunpräzipitation führen zu sauberen, reproduzierbaren Ergebnissen, die über das Keimzelltranslatom informieren und Einblicke in die Mechanismen mutierter Phänotypen geben.

RiboTag Immunpräzipitation in den Keimzellen der männlichen Maus

Lernen Sie die Isolierung von Ribonukleoprotein-Komplexen aus Zelllysaten mittels Immunpräzipitation. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer mRNA-Ziele von RNA-Bindeproteinen für die posttranskriptionelle Genregulation.

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip (Video) | JoVE Journal

Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von mRNAs, microRNAs und Protein-Komponenten des Ribonucleoprotein Komplexe aus Zellextrakten mit RIP-Chip

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