Name: Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Erfahren Sie eine verbesserte Methode zur Isolierung intakter Schließzellen aus Pflanzenblättern für physiologische und biochemische Analysen. Dieses Protokoll liefert hochwertige Proben für Stomata-Signalwege.

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Wir danken Daniel Chen aus der Digital Video Produktion Team von Buchholz High School für die Unterstützung bei der Videobearbeitung. Diese Forschung auf Stomata Schließzellen, Proteomik und Metabolomik in der Chen-Labor wurde durch Zuschüsse aus den US National Science Foundation (0818051, 1158000 und 1412547) unterstützt. Wenwen Kong wird von der China Scholarship Council unterstützt. Dr. Qiuying Pang wird von der China Scholarship Council und der National Natural Science Foundation of China (31570396) unterstützt.

1. Anbau von Pflanzen
<ol><li>Keimen Sie die Samen in Blumenerde Mischung. Wachsen Sie Pflanzen in einer Kammer Wachstum mit einer Lichtintensität von 140 µmol Photonen m−2 s −1 und eine Photoperiode von 8 h Licht bei 22 ° C und 16 h dunkel bei 18 ° C für 2 Wochen.</li>
	<li>Transplantation Sämlinge ähnlicher Größe individuell in 4" Durchmesser Töpfe mit den Boden und wachsen für weitere 3 Wochen unter den gleichen Bedingungen im Schritt 1.1 beschrieben. Hinweis: Wasserpflanzen Sie mit Leitungswasser zweimal in der Woche um den Boden feucht zu halten.</li>
</ol>2. Vorbereitung des angereicherten Spaltöffnungen
<ol><li>Entfernen Sie die Blätter des 5 - Wochen alten A. Thaliana Pflanzen einzelne mit einem Skalpell.</li>
	<li>Legen Sie jedes Blatt auf zwei Stücke von klaren Tesafilm mit Einteiler der abaxial (unteren) Seite an und das andere Stück adaxial (oberen) Seite des Blattes an. Lassen Sie das Band auf dem Blatt für 5 s.</li>
	<li>Sanfte Peel auseinander die beiden Teile der Bänder mit dem Zeigefinger und dem Daumen an jeder Hand die abaxial Seite mit Pflaster und Schließzellen und die adaxial Seite mit Mesophyll Zellen zu trennen.</li>
	<li>Ort die Schalen von der abaxial Seite der Blätter in 60 mL der Stomata öffnen (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, angepasst auf pH 6.2 mit 1 M KOH) in 40 mm × 12 mm Größe Petri Puffer Speisen während sie erfasst werden.<ol>
<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle Probe Schalen gesammelt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Petrischalen mit den Schalen in die Wachstums-Kammer unter leichten Bedingungen in Schritt 1.1. Lassen Sie die Schalen unter dem Licht für 2 h Stomata öffnen.</li>
	<li>Ort schält sich in einer 150 mm x 20 mm Petrischale mit 50 mL der Zellwand Verdauung Enzym Mischung (0,7 % Cellulase r-10, 0,025 % Macerozyme r-10, 0,1 % (w/V) Polyvinylpyrrolidon-40 und 0,25 % (w/V) Rinderserumalbumin in 55 % Basislösung (0,55 M Sorbit, 0,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,5 mM Ascorbinsäure, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-Morpholineethanesulfonic Säure (MES) bei pH 5,7 mit 1 M KOH eingestellt).</li>
	<li>Schütteln Sie die Schalen auf eine wechselseitige Shaker in einer Petrischale bei 50 u/min für 20 Minuten.</li>
	<li>Herausnehmen Sie Schalen mit einer Pinzette aus Enzymlösung, nach 20 min. die Schalen auf eine 150 x 20 mm Größe Petrischale mit 50 mL Wasser übertragen.</li>
	<li>Spülen mit einer transferpipette, Schalen für 15 s zweimal mit 10 mL Wasser, alle restlichen Enzymlösung zu entfernen.</li>
	<li>Benutzen Sie eine Pinzette, um Schalen in einer Petrischale 150 x 20 mm Größe mit 50 mL frische Stomata öffnen Puffer wie in Schritt 2.4 verwendet zu platzieren. Inkubation für 1 h bei Lichtverhältnissen erklärt in Schritt 1.1 erlauben die Stomata zu erholen.</li>
</ol>3. Abscisic Säure (ABA) Behandlung und Spaltöffnungen Bewegung Assay
<ol><li>In einer Petrischale 150 x 20 mm Größe. Inkubieren Sie die angereicherten Spaltöffnungen Schalen bei 30° C für 15 min in 50 mL des Puffers Stomata öffnen oder in 50 mL des Puffers Stomata öffnen mit einer Endkonzentration von 10 µM ABA für die angemessene Behandlungszeit.</li>
	<li>Ein Shaker bei 50 u/min für 5, 15 und 30 min Schalen aufsetzen. Nach jedem Zeitintervall eine Schale mit einer Pinzette zu entfernen und die bildgebenden Schritte in Schritt 3.3.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von Spaltöffnungen vor ABA Behandlung und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der ABA-Behandlung mit einem Lichtmikroskop.<ol>
<li>Nehmen Sie eine Schale und legen Sie es auf einen Glas-Objektträger.</li>
		<li>Legen Sie die Folie auf der Mikroskop-Bühne und stellen Sie die Bühne so ein, dass das Bild der Schale visualisiert werden kann.</li>
		<li>Passen Sie die feinen und natürlich Fokus auf das Mikroskop um ein klares Bild von den Schließzellen zu erhalten.</li>
		<li>Nehmen Sie mehrere Bilder von mehreren Spaltöffnungen bei 40 X Vergrößerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie 60 Stomata Öffnungen mit ImageJ-8.</li>
	<li>Berechnen Sie die Standardfehler und Bedeutung bei einem p-Wert < 0,05 der Stomata Blende 60 Messungen.</li>
</ol>(4) Protein Extraktion und Trennung der SDS-Page
<ol><li>Schleifen Sie die Schalen für 15 s in genug flüssigem Stickstoff um die Schalen mit einem gekühlten Mörser und Stößel zu decken.</li>
	<li>Pro 50 Schalen hinzufügen 3 mL Tris gesättigt Phenol (pH 8,8) und 3 mL Protein Extraktionspuffer (0,9 M Saccharose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4 % 2-Mercaptoethanol, 10 µL 1 mM Protease und Phosphatase-Inhibitor) mit einer Pipette vermischen und dann Schleifen die Schalen für 5 Addi nale Minuten unter einem Abzug.</li>
	<li>Den Extrakt mit einer Pipette zu übertragen und die Schalen mit einer Pinzette aus Metall zu einem Oakridge Zentrifugieren Rohr und agitieren auf einem Schüttler bei 50 u/min für 1 h bei 4 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie die Schalen aus der Oakridge Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren Sie den Extrakt bei 5.000 x g für 10 min. Übertragen Sie dann die obere phenolische Phase auf eine neue saubere Mikro-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette.</li>
	<li>Niederschlag der Phenol extrahiert Proteine durch Zugabe von 5 Bänden der eiskalte 0,1 M Ammoniumacetat in 100 % Methanol. Vortex kurz und Inkubation über Nacht bei-20 ° C.</li>
	<li>Bei 20.000 x g bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, Dekantieren des Überstands durch langsam aus dem Schlauch Gießen und das Protein Pellet in das Rohr zu behalten.</li>
	<li>Das Protein Pellet zweimal mit 0,1 M Ammoniumacetat in Methanol, Waschen und dann zweimal mit 80 % Aceton und einmal mit 100 % kaltem Aceton. Hinweis: Waschungen erfolgt durch Zugabe von 10 mL der angegebene Reagenz auf das Rohr des Proteins. Auf einem Schüttler bei 50 u/min für 5 min, gefolgt von Zentrifugation bei 15.000 x g bei 4 ° C für 10 min schütteln. Dann Gießen Sie das Reagenz aus der Tube behalten nur das Protein Pellet.</li>
	<li>Das Pellet 1 mL kaltem Aceton 100 % hinzu und wieder aussetzen durch pipettieren langsam rauf und runter.</li>
	<li>Bei 20.000 x g bei 4 ° C für 5 min zentrifugieren dann Protein Federung per Pipette auf eine 2 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen übertragen.</li>
	<li>Das Aceton durch Dekantieren es aus Rohr zu entfernen und das Pellet in Abzug für 10 min trocknen.</li>
	<li>Das Protein in einem Mikro-Zentrifugenröhrchen mit 200 µL Puffer Auflösung (8 M Harnstoff, 0,5 % SDS, 30 mM Tris-HCl bei pH 8,5) auflösen und Vortex für 30 min. Zentrifuge bei 20.000 x g bei 15 ° C für 20 min und Sammeln der Überstand in einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Die Proteinkonzentration nach Protein Quantifizierung Protokoll9zu quantifizieren.</li>
	<li>Verwenden Sie Proteinproben für Protein Trennung durch Gelelektrophorese nach Protokoll10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Schließzellen sind ein Modellsystem zur Untersuchung von Signal Transduction Mechanismen in Pflanzen und es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Vorbereitung der Proben, die in der Studie verwendeten die am besten geeignete biologische Fragen zu beantworten. Trotz des zunehmenden Interesses an Schließzellen innerhalb der Pflanze Forschungsgemeinschaft, gibt es keine universelle Methode zum Stomata Schließzellen vorbereiten, die sowohl die Physiologie der Stomata Bewegung erlauben würde sowie der molekularen Veränder...

Spaltöffnungen spielen eine wichtige Rolle in der allgemeinen Physiologie und Fitness Pflanzen. Diese kleine Pflanze bestimmte Strukturen von zwei spezialisierten epidermalen Zellen bekannt als Schließzellen gebildet werden und befinden sich meist reichlich auf der abaxial Oberfläche der Blätter. Spaltöffnungen sind notwendig für den Austausch der Gase zwischen der Anlage und der Atmosphäre sowie die Kontrolle der Wasserverlust durch Transpiration. Schließzellen regulieren Stomata Blende durch die Integration von verschiedenen externen (z.B., Licht, Feuchtigkeit, Erreger Kontakt, Kohlendioxid-Konzentration) und internen (zB., endogenen Hormonen) Reize1,2. In den letzten 20 Jahren ist dieser Zellentyp Modellsystem für Studium Zelle signalisieren Prozesse in Pflanzen geworden. Diese Zellen bilden einen kleinen Bruchteil der gesamten Zellen in ein Blatt; so muss um ihre einzigartige Mobilfunk zu untersuchen, biochemischen und molekularbiologischen Eigenschaften in eine einzelne Zelle Art und Weise, um sie von anderen Zelltypen Blatt zu isolieren. In der Vergangenheit haben Wache Zelle Studien häufig die Vorbereitung der Guard Zelle Protoplasten (GCP)3,4,5beteiligt. Dies in der Regel erfordert die Verwendung von großen Mengen an Zellwand entwürdigende Enzyme und oder mechanische Störungen über mischen und hat bewiesen, kostspielig und zeitaufwendig sein, dauert in der Regel viele Stunden zur Vorbereitung einer GCP-Probe, oft mit wenig Ertrag Zeiten. Noch wichtiger ist, weil Schließzellen als komplette Paare, Spaltöffnungen Blende Regeln handeln, die Verwendung von GCP als ein künstliches System zu studieren, Guard Zelle Signalisierung ersichtlich.
Hier entwickelten wir eine Methode um Spaltöffnungen vorzubereiten, in denen intakt Schließzellen sind bereichert und physiologische Reaktionen auf Reize zu erhalten. Diese Methode wurde eine Methode, die verwendet wurde, um Mesophyll Zelle Protoplasten6,7zu isolieren. In unserer Methode sind Spaltöffnungen vorbereitet mit klarem Tesafilm, zunächst die Mehrheit der Mesophyll Zellen trennen die adaxial Schicht des Blattes aus der abaxial Schicht mit dem Pflaster und der Schließzellen beigefügt. Dies geschieht durch Anbringung ein Stück Klebeband auf beiden Seiten des Blattes und schälen sie auseinander. Die Zellen aus dem abaxial Layer dürfen unter Licht in einem Spaltöffnungen-Eröffnung-Puffer zu erholen. Später werden die verbleibenden Zellen Pflaster entfernt mit einer kleinen Menge der Zellwand entwürdigende Enzyme, Guard-Zelle, die angereichert werden, auf dem Band zu hinterlassen.
In dieser einfachen Methode Stomata Schließzellen, die tragfähig und reaktionsfähig sind schnell und effizient werden vorbereitet, dauert weniger als eine Stunde angereicherten Stomata Schließzellen von 50 Schalen mit minimalen Kosten zu erhalten. Die Methode hier erlegt weniger Schäden an den Pflanzenzellen als bisherige Methoden dem Protoplasten zubereitet werden. Darüber hinaus Materialien von dieser Methode Ertrag wünschenswert Protein Mengen gesammelt. Vor allem, weil das Blatt nicht mischen unterliegt oder langwierige Verdauung Zeiten und die Schließzellen intakt sind, die Ergebnisse der Studien genauer werden darauf ein Guard natürliche Zellbiologie relevant sein. Mit dieser Methode können die Stomata Bewegungen mit Veränderungen auf molekularer Ebene in Echtzeit korreliert werden. Erkenntnisse aus Studien mit dieser Vorbereitung Methode wäre so wichtig für ein umfassenderes Verständnis der Guard Zelle Signalisierung.
Wir verwendeten die Pflanze Arabidopsis Thaliana als Vorbild; jedoch kann dieses Protokoll zur Bereicherung der Stomata Schließzellen in andere Pflanzenarten wie Brassica Napus mit kleinen Änderungen in der Verdauung Zeit angewendet werden. Als ein Proof of Concept haben wir bewiesen, dass Stomata Schließzellen, angereichert mit dieser Methode lebensfähig und reagieren auf Reize wie Fluorescein Diacetat (FDA) Assay und Studien unter Verwendung der Pflanzenhormon Abscisic Acid (ABA), bzw. zeigen. Darüber hinaus haben wir bewiesen, dass qualitativ hochwertige Proteine von diesen Schließzellen isoliert werden können. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll dieses Prozesses.

<table><tbody><tr><td>Chirurgische Skalpellfeder aus Edelstahl</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>Scotch Tape (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R-10)&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmazeutische Industrie Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>DM6000B Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Oak Ridge Hochgeschwindigkeits-PPCO-Zentrifugenröhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>EZQ Protein-Quantifizierungskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceindiacetat (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Abscisinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Unternehmen&nbsp;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Pinzette des National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

spaltöffnungen tape-peel: ein verbessertes verfahren zur wache zelle probenvorbereitung

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

Das Studium der Schließzellen ist wichtig, das Wissen um die spezifischen Beiträge dieser Zelle Art die Gesamtfunktion der Pflanzen. Allerdings ist es oft schwierig, zu isolieren und damit oft zu studieren, stellt eine Herausforderung dar.
Diese Studie legt eine Stomata Guard Zelle Bereicherung Methode. Das Protokoll nutzt Tesafilm um die Schließzellen isolieren und Proteine aus den Zellen zu extrahieren. Diese Methode verbessert die Integrität und den Ertrag der Guard Zelle während der Isolierung und bietet eine zuverlässige Probe für die Untersuchung der Signalisierung Zellprozesse und wie sie mit Stomata Bewegung Phänotypen korrelieren. Bei dieser Methode wurden die Blätter der Pflanze zwischen beiden Teilen der Band partitioniert und geschält auseinander um der abaxial Seite zu entfernen. Dieses Protokoll wurde an Arabidopsis Blattgewebe Schließzellen isolieren angewendet. Die Zellen wurden mit Fluorescein Diacetat (FDA) Lebensfähigkeit zu bestimmen und Abscisic Säure (ABA) einzuschätzen Spaltöffnungen Bewegung als Reaktion auf ABA behandelt. Dieses Protokoll ist zusammenfassend erweist sich als nützlich für die Vorbereitung angereicherten Stomata Schließzellen und Proteine zu isolieren. Die Qualität der Zellen und Proteine erhalten Sie hier aktivieren physiologische und andere biologische Studien.

Ein repräsentatives Bild von Arabidopsis Schließzellen vor und nach der Verdauung des Mesophyll und Epidermiszellen in Abbildung 1dargestellt ist. Guard Zellviabilität vor und nach der Entfernung des Mesophyll und epidermalen Zellen kann mit der FDA um zu messen, enzymatische Aktivität und Integrität der Zellmembran (Abb. 1 b und 1D) beobachtet werden. Abbildung 2 veranschaulicht Sto...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des Vorbereitens angereicherten Stomata Schließzellen, die nützlich für physiologische und andere biologische Studien.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, qualitativ hochwertige, angereicherte Stomata-Schließzellen für physiologische, biochemische und molekulare Analysen wie Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik vorzubereiten. Hallo, mein Name ist Sheldon Lawrence. Ich bin Doktorand in Dr. Chens Labor am Department of Biology an der University of Florida.Heute zeige ich Ihnen, wie Sie Schließzellen aus pflanzlichem Blattgewebe isolieren können, die sowohl für die Untersuchung der Physiologie als auch der Biologie der Spaltöffnungen nützlich sind. Diese Methode gilt als neuartige Methode zur Isolierung von Schließzellen. Es ermöglicht insbesondere die Anreicherung intakter Schließzellen und liefert zuverlässige Proben für die Untersuchung von Signalprozessen in Spaltöffnungen.Die Anwendung dieser Methode kann auf Brassicaceae-Pflanzen und andere Pflanzenarten ausgeweitet werden, wobei das Protokoll nur geringfügig geändert wird. Die Demonstration ist wichtig, da sich der Hauptschritt zur Anreicherung der Schließzellen als Herausforderung erweisen kann. Wählen Sie zunächst reife, fünf Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen aus.Entfernen Sie vorsichtig ein Blatt mit einem Skalpell und schneiden Sie das Blatt an der Basis ab. Nehmen Sie zwei Stücke Klebeband und legen Sie das ausgeschnittene Blatt dazwischen. Üben Sie vorsichtig Druck auf beide Seiten aus und achten Sie darauf, dass das Ende der Klebebandstücke nicht anhaftet.Dies kann erreicht werden, indem man einen Finger dazwischen steckt. Entfernen Sie vorsichtig die beiden Klebebandstücke voneinander und schwimmen Sie die von der abaxialen Seite des Blattes entnommene Schale sofort in den Öffnungspuffer der Spaltöffnungen. Nachdem alle Schalen gesammelt wurden, legen Sie sie unter Licht.Lassen Sie sie dort zwei Stunden lang. Nehmen Sie mehrere Peelings und legen Sie sie auf Objektträger. Stellen Sie die Linsen mit einem Lichtmikroskop so ein, dass sie die Schließzellen sehen können, und stellen Sie sicher, dass sie geöffnet sind.Legen Sie die Schalen in 50 ml der Zellwandverdauungsenzymlösung. Lassen Sie sie schweben und inkubieren Sie sie bei 26 Grad Celsius. Entfernen Sie nach 20 Minuten die Schalen aus der Enzymlösung und spülen Sie sie zweimal kurz mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie in einen frischen Spaltöffnungspuffer.Mahlen Sie die Schalen in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff mit einem Stößel. Führen Sie dann die Phenolextraktion durch, wie im Text beschrieben. Nachdem Sie die Schalen in einem Mörser mit einem Stößel zerkleinert haben, geben Sie den Extrakt zusammen mit den Schalen in ein Oak Ridge Zentrifugenröhrchen und rühren Sie eine Stunde lang auf einem Shaker bei vier Grad Celsius.Fällung der phenolextrahierten Proteine durch Zugabe von fünf Volumen eiskaltem 0,1 mol Ammoniumacetat in 100 % Methanol. Nachdem Sie das Protein über Nacht bei 20 Grad Celsius ausgefällt haben, ernten Sie das Protein durch Zentrifugation und führen Sie Pelletwäschen durch, wie im Text beschrieben. Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter kaltem Aceton und geben Sie es in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Nach dem Zentrifugieren den Acetonüberstand entsorgen und das Pellet zehn Minuten lang trocknen. Löse die Proteinprobe in einem Auflösungspuffer auf. Nach dem Vortex und der Zentrifugation wird der Überstand aufgefangen und die Proteinkonzentration gemessen.Führen Sie ein SDS-PAGE-Gel aus. Visualisieren Sie die einzelnen Proteinbanden und beobachten Sie die relative Proteinqualität. Dies ist ein repräsentatives Bild der Arabidopsis-Schließzellen vor und nach der Enzymverdauung der Mesophyll- und Epidermiszellen.Die Lebensfähigkeit der Schließzellen vor und nach der Entfernung von Mesophyll- und Epidermiszellen kann mit Fluoresceindiacetat beobachtet werden, das die enzymatische Aktivität und die Integrität der Zellmembran misst. Wie du siehst, sind Schließzellen nach dem Peeling und der Enzymverdauung noch lebensfähig. Dieses Beispiel veranschaulicht die Bewegung der Spaltöffnungen von Arabidopsis als Reaktion auf eine ABA-Behandlung.Die Schließzellen sprechen auf die Behandlung an und die Öffnung der Stomata nimmt nach 30-minütiger Behandlung mit ABA um mehr als 50 % ab. Hier ist ein zeitlicher Verlauf der Stomatabewegung. Zusätzlich wird ein repräsentatives Bild der Stomataöffnung zu jedem Zeitpunkt gezeigt.Der Nachweis, die Trennung und die relative Häufigkeit von Proteinen wird mit SDS-PAGE beobachtet. Die Bänder sind klar und deutlich. Vier biologische Replikate sind enthalten, um die Reproduzierbarkeit der Proteinextraktion aus dieser Methode zu unterstreichen.Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir versuchten, molekulare Veränderungen der Schließzellen in Echtzeit mit der Bewegung der Spaltöffnungen zu korrelieren. Einmal gemeistert, kann eine Proteinprobe aus Stomata-Schließzellen innerhalb weniger Stunden hergestellt und in mehreren Experimenten verwendet werden. Es ist wichtig, daran zu denken, dass die Schließzellen beim Schälen und Hantieren nicht zu stark geschädigt werden.Nach dieser Methode können andere Techniken angewendet werden, um die Signalübertragung von Schließzellen zu untersuchen, wie z. B. die isobare Markierung, um die Redux-Reaktion von Proteinen in Pflanzen unter normalen und Stressbedingungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie intakte und lebensfähige Schließzellen isolieren und anreichern sowie hochwertiges Protein extrahieren können, das für nachgelagerte Studien geeignet ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.

Untersuchung Tissue-und Organ-spezifische Phytochrom Antworten mit FACS-gestützte zelltypspezifisch Expression Profiling in Arabidopsis thaliana</em

Wir haben eine einfache und reproduzierbare Protokoll Stomata Reaktion auf lebende Bakterien Zugang entwickelt. Diese Methode minimiert Verwundung und Manipulation des Blattes über die Nutzung von epidermalen schält Vergleich bereits berichtet.

Die Beurteilung stomatäre Response to Bakterienzellen Live mit Whole Leaf Imaging

Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Gene Screening plasmodesmal Permeabilität und damit Auxin Gradienten während tropischen Reaktion zu steuern. Dies beinhaltet die Messung des Grades der Tropic Reaktion in Hypokotyl   von Arabidopsis thaliana und plasmodesmal Permeabilität von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS) Laden und schließlich Kallose- Ebene Beurteilung zu überprüfen.

Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

Die innere Uhr reguliert etwa ein Drittel der Arabidopsis Transkriptom, aber der Prozentsatz der Gene, die zurück in die Zeitnahme ernähren bleibt unbekannt. Hier visualisieren wir eine Methode, um schnell circadian Phänotypen in jeder Mutantenlinie von Arabidopsis beurteilen mit lumineszenten Bildgebung eines zirkadianen Reporter vorübergehend in Protoplasten ausgedrückt.

Schnelle Analyse von Circadian Phänotypen in Arabidopsis Protoplasten Transfizierte mit einem lumineszenten Clock Reporter

Bestehende Methoden zur Modifikation von Pflanzen sind nur begrenzt anwendbar. Die hier vorgeschlagene neuartige Peptid-abgeleitete Technologie verspricht sowohl Einfachheit als auch Effizienz bei der Einführung von exogenen Proteinen oder Genen in die gewünschten intrazellulären Kompartimente intakter Pflanzen.

Peptid abgeleitete Methode zu schleusen Gene und Proteine ​​über zelluläre und Organell-Barrieren in Pflanzen

Hier präsentieren wir ein Interaktom-Capture-Protokoll, das auf Arabidopsis thaliana Blatt-Mesophyll-Protoplasten angewendet wird. Diese Methode beruht kritisch auf in vivo UV-Vernetzung und ermöglicht die Isolierung und Identifizierung von p-mRNA-bindenden Proteinen aus einer physiologischen Umgebung.

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Das Ziel dieses Protokolls ist zu zeigen, wie induzieren gruppierte Spaltöffnungen in Keimblätter von Arabidopsis Thaliana Sämlinge durch Immersion Behandlung mit einer zuckerhaltigen Lösung für mittlere und intrazelluläre Strukturen wie Chloroplasten beobachten und Mikrotubuli in der gruppierten Schließzellen mit konfokale laser-Mikroskopie.

Ein Ansaugsystem für gruppierte Spaltöffnungen durch Zucker Lösung eintauchen Behandlung in Arabidopsis Thaliana Sämlinge

In dieser Arbeit werden zwei Phänotypisierungsmethoden ohne die Verwendung von epidermalen Peelings beschrieben, um die Gene zu charakterisieren, die die Entwicklung der Stomata steuern. Die erste Methode zeigt, wie ein stomataler Phänotyp unter Verwendung einer Toluidinblau-O-gefärbten Pflanzenepidermis analysiert werden kann. Die zweite Methode beschreibt, wie man stomatale Liganden identifiziert und ihre biologischen Aktivitäten überwacht.

Identifizierung der Gene, die an der Entwicklung der Stomata beteiligt sind, mittels epidermalem Phänotyp-Scoring

Hier stellen wir eine einfache Methode zur direkten Beobachtung und automatisierten Messung der stomatären Reaktionen auf bakterielle Invasion in Arabidopsis thaliana vor. Diese Methode nutzt ein tragbares stomatales Bildgebungsgerät zusammen mit einer Bildanalyse-Pipeline, die für vom Gerät aufgenommene Blattbilder ausgelegt ist.

Direkte Beobachtung und automatisierte Messung der stomatalen Reaktionen auf Pseudomonas syringae pv. Tomate DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dieses Protokoll bietet eine vergleichende Methode zur Bewertung von Stomatal- und Epidermalmerkmalen bei zwei verschiedenen Arten mittels epidermaler Peelings, Clearing-Techniken und KI-unterstützter Bildanalyse. Das Ziel ist es, eine hochdurchgängige, reproduzierbare Quantifizierung zellulärer Strukturen, die der Funktion der Spaltöffnungen zugrunde liegen, für landwirtschaftliche Anwendungen und breite Pflanzenforschung zu ermöglichen.

Charakterisierung von Stomatal- und Epidermalmerkmalen mittels Peels, Clearing und KI-basierter Bildanalyse

Erfahren Sie eine verbesserte Methode zur Isolierung intakter Schließzellen aus Pflanzenblättern für physiologische und biochemische Analysen. Dieses Protokoll liefert hochwertige Proben für Stomata-Signalwege.

Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

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