Spaltöffnungen Tape-Peel: Ein verbessertes Verfahren zur Wache Zelle Probenvorbereitung

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, qualitativ hochwertige, angereicherte Stomata-Schließzellen für physiologische, biochemische und molekulare Analysen wie Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik vorzubereiten. Hallo, mein Name ist Sheldon Lawrence. Ich bin Doktorand in Dr. Chens Labor am Department of Biology an der University of Florida.

Heute zeige ich Ihnen, wie Sie Schließzellen aus pflanzlichem Blattgewebe isolieren können, die sowohl für die Untersuchung der Physiologie als auch der Biologie der Spaltöffnungen nützlich sind. Diese Methode gilt als neuartige Methode zur Isolierung von Schließzellen. Es ermöglicht insbesondere die Anreicherung intakter Schließzellen und liefert zuverlässige Proben für die Untersuchung von Signalprozessen in Spaltöffnungen.

Die Anwendung dieser Methode kann auf Brassicaceae-Pflanzen und andere Pflanzenarten ausgeweitet werden, wobei das Protokoll nur geringfügig geändert wird. Die Demonstration ist wichtig, da sich der Hauptschritt zur Anreicherung der Schließzellen als Herausforderung erweisen kann. Wählen Sie zunächst reife, fünf Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen aus.

Entfernen Sie vorsichtig ein Blatt mit einem Skalpell und schneiden Sie das Blatt an der Basis ab. Nehmen Sie zwei Stücke Klebeband und legen Sie das ausgeschnittene Blatt dazwischen. Üben Sie vorsichtig Druck auf beide Seiten aus und achten Sie darauf, dass das Ende der Klebebandstücke nicht anhaftet.

Dies kann erreicht werden, indem man einen Finger dazwischen steckt. Entfernen Sie vorsichtig die beiden Klebebandstücke voneinander und schwimmen Sie die von der abaxialen Seite des Blattes entnommene Schale sofort in den Öffnungspuffer der Spaltöffnungen. Nachdem alle Schalen gesammelt wurden, legen Sie sie unter Licht.

Lassen Sie sie dort zwei Stunden lang. Nehmen Sie mehrere Peelings und legen Sie sie auf Objektträger. Stellen Sie die Linsen mit einem Lichtmikroskop so ein, dass sie die Schließzellen sehen können, und stellen Sie sicher, dass sie geöffnet sind.

Legen Sie die Schalen in 50 ml der Zellwandverdauungsenzymlösung. Lassen Sie sie schweben und inkubieren Sie sie bei 26 Grad Celsius. Entfernen Sie nach 20 Minuten die Schalen aus der Enzymlösung und spülen Sie sie zweimal kurz mit entionisiertem Wasser ab und legen Sie sie in einen frischen Spaltöffnungspuffer

Mahlen Sie die Schalen in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff mit einem Stößel. Führen Sie dann die Phenolextraktion durch, wie im Text beschrieben. Nachdem Sie die Schalen in einem Mörser mit einem Stößel zerkleinert haben, geben Sie den Extrakt zusammen mit den Schalen in ein Oak Ridge Zentrifugenröhrchen und rühren Sie eine Stunde lang auf einem Shaker bei vier Grad Celsius.

Fällung der phenolextrahierten Proteine durch Zugabe von fünf Volumen eiskaltem 0,1 mol Ammoniumacetat in 100 % Methanol. Nachdem Sie das Protein über Nacht bei 20 Grad Celsius ausgefällt haben, ernten Sie das Protein durch Zentrifugation und führen Sie Pelletwäschen durch, wie im Text beschrieben. Suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter kaltem Aceton und geben Sie es in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Nach dem Zentrifugieren den Acetonüberstand entsorgen und das Pellet zehn Minuten lang trocknen. Löse die Proteinprobe in einem Auflösungspuffer auf. Nach dem Vortex und der Zentrifugation wird der Überstand aufgefangen und die Proteinkonzentration gemessen.

Führen Sie ein SDS-PAGE-Gel aus. Visualisieren Sie die einzelnen Proteinbanden und beobachten Sie die relative Proteinqualität. Dies ist ein repräsentatives Bild der Arabidopsis-Schließzellen vor und nach der Enzymverdauung der Mesophyll- und Epidermiszellen.

Die Lebensfähigkeit der Schließzellen vor und nach der Entfernung von Mesophyll- und Epidermiszellen kann mit Fluoresceindiacetat beobachtet werden, das die enzymatische Aktivität und die Integrität der Zellmembran misst. Wie du siehst, sind Schließzellen nach dem Peeling und der Enzymverdauung noch lebensfähig. Dieses Beispiel veranschaulicht die Bewegung der Spaltöffnungen von Arabidopsis als Reaktion auf eine ABA-Behandlung.

Die Schließzellen sprechen auf die Behandlung an und die Öffnung der Stomata nimmt nach 30-minütiger Behandlung mit ABA um mehr als 50 % ab. Hier ist ein zeitlicher Verlauf der Stomatabewegung. Zusätzlich wird ein repräsentatives Bild der Stomataöffnung zu jedem Zeitpunkt gezeigt.

Der Nachweis, die Trennung und die relative Häufigkeit von Proteinen wird mit SDS-PAGE beobachtet. Die Bänder sind klar und deutlich. Vier biologische Replikate sind enthalten, um die Reproduzierbarkeit der Proteinextraktion aus dieser Methode zu unterstreichen.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir versuchten, molekulare Veränderungen der Schließzellen in Echtzeit mit der Bewegung der Spaltöffnungen zu korrelieren. Einmal gemeistert, kann eine Proteinprobe aus Stomata-Schließzellen innerhalb weniger Stunden hergestellt und in mehreren Experimenten verwendet werden. Es ist wichtig, daran zu denken, dass die Schließzellen beim Schälen und Hantieren nicht zu stark geschädigt werden.

Nach dieser Methode können andere Techniken angewendet werden, um die Signalübertragung von Schließzellen zu untersuchen, wie z. B. die isobare Markierung, um die Redux-Reaktion von Proteinen in Pflanzen unter normalen und Stressbedingungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie intakte und lebensfähige Schließzellen isolieren und anreichern sowie hochwertiges Protein extrahieren können, das für nachgelagerte Studien geeignet ist.