Bewertung der Auswirkungen der Proteinaggregation auf zellulären oxidativen Stress in der Hefe

Proteinaggregation entlockt zellulären oxidativen Stress. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Überwachung der intrazellulären Staaten von Amyloidogenic Proteinen und den oxidativen Stress zugeordnet werden, mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Der Ansatz dient zur Untersuchung des Verhaltens von löslichen und Aggregation neigende Varianten des β-Amyloid Peptids.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Zusammenhang zwischen der Bildung intrazellulärer Proteinaggregate und deren Einfluss auf zellulären oxidativen Stress anhand der Backhefe Saccharomyces cerevisiae zu bestimmen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Proteinfehlfaltung und -aggregationskrankheiten, wie z.B. neurodegenerativer Erkrankungen und nicht-neuropathischer Amyloidosen, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach und schnell ist und die Quantifizierung der zellulären oxidativen Stressschäden in einer großen Hefepopulation ermöglicht.

Mit dieser Methode können wir einen Einblick in die Korrelation zwischen dem intrazellulären löslichen oder aggregierten Zustand eines amyloidogenen Proteins und dem oxidativen Stressniveau in Hefe geben. Darüber hinaus kann es auch auf andere Modellorganismen angewendet werden, die rekombinante Proteine exprimieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse wird von Manuela Costa, Technikerin der Abteilung für Durchflusszytometrie an der UAB, vorgeführt.

In dieser Studie wird der intrazelluläre Aggregationszustand verschiedener A-beta-42-Peptidvarianten unter Verwendung von S.cerevisiae verfolgt, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das für A-beta-42 kodiert und unter der Kontrolle eines Galaktose-induzierbaren Promotors mit GFP fusioniert wurde. Wählen Sie eine Kolonie der transformierten Hefezellen aus und inokulieren Sie in 20 Milliliter SC minus Ura-Medium mit 2 % Glukose. Lass die Kultur bei 30 Grad Celsius unter Rühren über Nacht wachsen.

Am nächsten Tag inokulieren Sie 100 Mikroliter der Nachtkultur in fünf Milliliter frisches SC minus Ura-Medium und züchten die Zellen zwei bis drei Stunden lang bei 30 Grad Celsius. Wenn die Kultur eine optische Dichte von 590 Nanometern oder einen OD 590 von 0,5 aufweist, zentrifugieren Sie die Kultur vier Minuten lang bei 3.000 g g, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in fünf Millilitern frischem SC minus Ura-Medium mit 2 % Raffinose. Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius unter Rühren für 30 Minuten.

Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Zellen vier Minuten lang bei 3.000-mal g, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in frischem SC minus Ura-Medium, das 2 % Galaktose enthält, um eine rekombinante Proteinexpression zu induzieren. Stellen Sie die Zellen für 16 Stunden in den Inkubator zurück. Nach 16 Stunden werden die Zellen geerntet, indem Sie Ein-Milliliter-Aliquots der Kultur in sterile Mikrozentrifugenröhrchen überführen und vier Minuten lang bei 3.000 g zentrifugieren.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Bestimmung des OD 590 der 16-Stunden-induzierten Hefezellen. Verdünnen Sie dann die Zellen in sterilem PBS auf einen OD 590 von 0,1. Übertragen Sie die Suspensionen der exprimierenden Zellen in entsprechend gekennzeichnete Polystyrolröhrchen mit rundem Boden und schützen Sie sie vor Licht.

Bereiten Sie nicht-induzierte Zellen als Negativkontrolle für die durchflusszytometrische Analyse vor. Geben Sie die Sonde für oxidativen Stress in einer Endkonzentration von fünf Mikromolaren zu jeder Probe. Decken Sie die Proben mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius.

Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, schleudern Sie die Zellen herunter, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellpellets in PBS. Waschen Sie die Zellen dreimal auf diese Weise mit PBS. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen im gleichen PBS-Volumen.

Stellen Sie sicher, dass nicht gefärbte Zellen in die Durchflusszytometrie-Analyse einbezogen werden. Führen Sie mit den entsprechenden Lasern und Filtern die Durchflusszytometrie-Analyse durch, um GFP und das Fluoreszenzsignal der oxidativen Stresssonde zu detektieren. Klicken Sie zunächst auf den Bereich Neues Arbeitsblatt öffnen, und geben Sie dem Experiment einen Namen.

Wählen Sie in der Symbolleiste das Werkzeug Streudiagramm aus, und erstellen Sie ein Diagramm mit den Variablen Seitliche Streufläche auf der Y-Achse und Vorwärts-Streufläche in einer linearen Skala auf der X-Achse. Klicken Sie auf das Werkzeug Streudiagramm, und erstellen Sie ein Diagramm mit den Variablen FITC-Fläche auf der X-Achse und APC-Fläche in einer logarithmischen Skala auf der Y-Achse. Klicken Sie auf das Symbol Geräteeinstellung und setzen Sie alle Kompensationsstufen auf der Registerkarte Kompensation auf Null.

Klicken Sie dann auf die Registerkarte Erfassung und wählen Sie eine Gesamtzahl von 20.000 Ereignissen aus, die mit einer niedrigen Durchflussrate aufgezeichnet werden sollen. Da das Fluoreszenzemissionssignal eines Fluorochroms von einem anderen Detektor detektiert werden kann, ist es wichtig, einen Kompensationsprozess durchzuführen, um das minimale Signal jedes Fluorochroms in allen Detektoren durch eine einfarbige Steuerung auszugleichen. Benennen Sie die Röhre 001 in Negativkontrolle um und klicken Sie auf die Registerkarte Erfassen, um die nicht induzierten, ungefärbten Zellen auszuführen.

Passen Sie die Spannung in den Instrumenteneinstellungen der Vorwärts- und Seitenstreuung an, bis die Grundgesamtheit im mittleren linken Quadranten verteilt ist. Klicken Sie auf das Polygon-Symbol, um eine Region R1 um die Zellpopulation ohne Zellablagerungen festzulegen, und verwenden Sie diese Gated Population P1 gleich R1 für alle fluoreszierenden Punktdiagramme und Histogrammdarstellungen. Um die PMT-Spannung des Fluoreszenzsignals anzupassen, führen Sie die ungefärbten Zellen im Punktdiagramm FL1 bis FL3 aus, indem Sie die Verstärkung auf der Registerkarte "Instrumenteneinstellung" einstellen, bis die Zellen im unteren linken Quadranten verteilt sind.

Erstellen Sie mit dem Streudiagramm-Werkzeug ein Punktdiagramm mit den Variablen FITC-A auf der x-Achse im Vergleich zu FSC-A und ein zweites Punktdiagramm mit den Variablen APC-A auf der x-Achse im Vergleich zu FSC-A. Wechseln Sie als Nächstes die Probe zu den induzierten Zellen, um die GFP-Fluoreszenz zu messen. Legen Sie auf der Registerkarte "Geräteeinstellung" die Verstärkung von FSC-A im Vergleich zu FITC fest, wenn die Grundgesamtheit im unteren rechten Quadranten verteilt ist.

Definieren Sie die GFP-positive Zellpopulation mit einem Gate. Wechseln Sie die Probe zu den nicht induzierten gefärbten Zellen. Zeigen Sie oxidativen Stress durch die Fluoreszenz in einem Punktdiagramm von FSC-A und APC-A an.

Stimmen Sie die Verstärkung ab, bis die Zellpopulation im linken oberen Quadranten verteilt ist. Gate die positive Zellpopulation in P3. Erstellen Sie mit dem Symbol Histogramm zwei Histogrammdiagramme, um die Zellfluoreszenz darzustellen, eines für FITC und eines für APC-Fluoreszenz. Erstellen Sie eine Tabelle, in der die mittlere Fluoreszenzintensität und die mediane Fluoreszenz mit dem entsprechenden Standardfehler und/oder der Varianzkoeffizient für GFP-Fluoreszenz und oxidativen Stress angezeigt werden.

Klicken Sie auf die Registerkarte Kompensation und setzen Sie alle Kompensationsstufen auf Null. Klicken Sie auf die Registerkarte Erfassung und wählen Sie eine Gesamtzahl von 20.000 Ereignissen aus, die aufgezeichnet werden sollen. Bereiten Sie drei neue Röhrchen mit Proben vor und nennen Sie sie nicht induziert, induziert löslich und induziert aggregiert.

Erfassen Sie Daten aus den Samples mit den voreingestellten Einstellungen. Analysieren Sie die Daten, indem Sie ein neues Blatt öffnen und ein Punktdiagramm für die Variablen FITC-A und APC-A erstellen, wobei Sie die positiven Zellen für die CellROX-Färbung angrenzen. Erstellen Sie für jede Probe eine Statistiktabelle mit der mittleren Fluoreszenz und dem Standardfehler für die FITC- und APC-Kanäle.

Es ist auch möglich, Zellen mit einem FACS-Sortierer nach der aggregierten Proteinzählung zu sortieren. Hefezellen, die nach einer Induktionszeit von 16 Stunden A-beta-42-Varianten exprimieren, werden unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht, um die rekombinante Proteinverteilung in den Zellen zu bestimmen. Diese Bilder sind repräsentativ für ausgewählte A-beta-42 GFP-Varianten.

Die Bildung von Proteineinschlüssen (PI) wurde bei 10 der 20 Varianten aus der analysierten Sammlung bestätigt. Dieses Balkendiagramm zeigt den Prozentsatz der Zellen mit unterschiedlichen PI-Zahlen, berechnet aus insgesamt 500 Fluoreszenzzellen für jede Variante in biologische Replikate. Es wurde eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen den vorhergesagten und den in vivo Aggregationseigenschaften beobachtet.

Die Proteinexpressionsniveaus in zellulären Extrakten wurden mit einem A-beta-spezifischen Antikörper quantifiziert. Als allgemeiner Trend sind PI-bildende A-beta-42-Varianten, die grün gefärbt sind, in niedrigeren Konzentrationen vorhanden als diejenigen, die diffus im Zytosol verteilt sind und rot gefärbt sind. Wichtige Unterschiede zwischen den A-beta-42-Varianten wurden beobachtet, wenn die Fluoreszenz der oxidativen Stresssonde, die Proteinspiegel und die GFP-Fluoreszenzeigenschaften im Verhältnis zu ihrer Fähigkeit, PI zu bilden, und ihren intrinsischen Aggregationsneigungen, die entweder vom AGGRESCAN- oder dem TANGO-Bioinformatik-Algorithmus vorhergesagt wurden, dargestellt wurden.

Die PI-bildenden Varianten sind grün und die nicht PI-bildenden Varianten rot. Im Anschluss an dieses Verfahren können auch andere Methoden wie die Propidiumiodid- oder Annexin-V-Färbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung des Einflusses einer intrazellulären exprimierten Proteinvariante auf die Zellapoptose oder die Zytotoxizität